Summary
Мы сообщаем протокол с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток, чтобы изолировать плазмоцитов дендритные клетки (PDC) с высокой степенью чистоты из костного мозга волчаночного склонной мышей для функциональных исследований Pdc.
Protocol
Примечание: MRL / Мр-Fas LPR (MRL / LPR) волчанка склонной мышей разводили и поддерживали в определенном патогена объекта следующим требованиям институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) под номером Virginia Tech (обеспечение защиты животных: A3208-01). Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с протоколом IACUC # 12-062.
1. среда для культивирования клеток и сортировка буфера
- Подготовить всю среду для культивирования клеток (С10) с использованием среды RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1 мМ пирувата натрия, 1% 100 MEM заменимых аминокислот, 10 мМ HEPES, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глутамина и 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина.
- Подготовка сортировки буфера (HBSS-полный) с помощью 1x Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) с добавлением 10 мМ HEPES, 2,5 мг / мл бычьего сывороточного альбумина,0,05 мМ MgCl 2 и 0,2 Ед / мл ДНКазы I.
2. Мышь Вскрытие
- Приготовьте два блюда диаметром 6 см, содержащих 4 мл С10. Поместите посуду на лед.
- Эвтаназии мыши по CO 2 ингаляции.
- Урожай селезенку и держать его в блюдо с С10 на льду.
- Pin мышь вниз с животом вверх на вскрытии пластины. Стерилизацию тело путем распыления 70% этанола.
- Разрежьте кожу и отделить кожу от мышечной стенки внизу вдоль вентральной средней линии от лобкового симфиза до шеи.
- Разрежьте кожу вдоль задней конечности от первого разреза до лодыжки.
- Зафиксируйте кожу обратно по бокам и сократить мышечную стенку по бокам от первого места разреза к диафрагме.
- Pin мышечной стенки назад на правой стороне головы.
- Расположить селезенке на правой стороне мыши под тонкой кишки и рядом с желудком. Возьмите один конец йе селезенке и отделить его от желудка.
- Обрежьте обе задние конечности из, в том числе бедренной и большеберцовой костей, а также удалить все мышцы в максимально возможной степени.
- Нарезать мышцы вдоль задней конечности от тазовой / тазобедренного сустава до лодыжки с острым ножницами, пытаясь избежать кровеносных сосудов.
- Отделите заднюю конечность путем разрезания на тазовой / тазобедренного сустава и лодыжки / ног сустава без воздействия содержимого костного мозга.
- Чистые оставшиеся мышцы на кости, царапая с лезвием бритвы и несколько раз сокращая мышцы на совместных пунктах.
- Держите кости в 6 см чашку, содержащую 4 мл С10 на льду. Перейдите к рассечения следующей мыши.
3. Выделение спленоцитов
- Однородный селезенку осторожно плунжерный шприц с сетчатым фильтром клетки 70 мкм на верхней части тарелки, содержащей 4 мл С10, пока не красные части не видны.
- Добавить дополнительные 6 мл С10 в чашку через ситечко ае затем передать общую клеточную суспензию 10 мл до 15 мл коническую пробирку.
- Центрифуга коническую трубку со скоростью 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С.
- После центрифугирования, аспирация супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл 1 х красных кровяных телец (эритроцитов) буфера для лизиса. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- После инкубации в течение центрифугировать коническую трубку со скоростью 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С.
- После центрифугирования аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл С10. Откажитесь от любых больших комков (мертвые клетки) и держать трубку на льду для последующего использования.
Примечание: Если есть много мелких комков, используют клеточный фильтр 70 мкм для фильтрации суспензии клеток один раз. - Подсчитайте число клеток с трипановым синим с использованием автоматического счетчика клеток.
4. костного мозга Выделение клеток
- Перенесите кости с С10 по 4 мл в ступке и добавить 6 мл С10, чтобы сделать объем 10 мл С10 в общей сложности.
- Трещина кости аккуратно в ступке с помощью арestle.
- Слегка помешивая с пестиком, чтобы освободить костный мозг в С10.
- Передача С10 по 10 мл, содержащих костный мозг в коническую пробирку емкостью 50 мл, на льду через клеточный фильтр 70 мкм. Добавьте 10 мл свежего С10 в раствор, содержащий все еще кости.
Примечание: Пипетка раствор, содержащий костного мозга вверх и вниз несколько раз до прохождения через сито, если красные сгустки видны. - Повторите шаги от 4,2 до 4,4 раза. После последней промывки, кости должны казаться белым.
- Центрифуга 50 мл коническую трубку со скоростью 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С. В то же время, подготовить 5 мл готовой к использованию в градиенте плотности среды, в 15 мл коническую центрифужную пробирку при комнатной температуре.
- После центрифугирования аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл С10.
- Медленно слой приостановку 10 мл клеток на верхней части 5 мл в градиенте плотности среды, поддерживая четкий интерфейс между двумя фазами. Затем центрифугировать 15 мл коническую трубку в 1363 г в течение 30 мин приRT (20 ° C) с множеством ускорения, как 9 и замедления, установленного в 0 (или OFF) тормоза.
- После центрифугирования, удалить верхний 8 мл этого раствора осторожно и собирают 2 мл поглощающее покрытие на границе раздела (слой мононуклеарных клеток) в новый 15 мл коническую трубку.
- Добавить 12 мл охлажденной на льду С10 в 15 мл коническую пробирку, содержащую мононуклеарных клеток костного мозга, колпачок и инвертировать несколько раз, чтобы хорошо перемешать, а затем отцентрифугировать пробирку при 800 х г в течение 10 мин, 4 ° С.
5. поверхности клеток Окрашивание для FACS
- Пример окрашивания
- Подготовка анти-мыши CD16 / 32 раствор антитела (от 1 до 100 разбавления в HBSS-полной, 5 мкг / мл, конечная концентрация).
- После центрифугирования в шаге 4.10, аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл раствора антител против мышиного CD16 / 32, чтобы блокировать рецептор Fc на мононуклеарных клетках. Инкубируют на льду в течение 10 мин.
- Приготовьте смесь флуоресцентной-конъюгированного антитела (муравейя-мышь CD11c-PE 1:40 разбавление, анти-мышь CD11b-APC-CY7 1:80 разбавление, анти-мышь PDCA-1-FITC 1:40 разбавление и анти-мышиного В220-В500 1:40 разведение в HBSS- полный, как рекомендовано производителем в количестве 100 мкл конечного объема на образец).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно титрование антител перед использованием. - После 10-минутной инкубации на стадии 5.1.2, добавляют 4 мл охлажденного льдом HBSS, набитый и центрифуге при 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С для удаления несвязанного против мышиного CD16 / 32.
- После центрифугирования аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл смеси флуоресцентно-конъюгированных антител. Инкубируют на льду в течение 15 мин в темноте.
- После 15-минутной инкубации, добавляют 4 мл охлажденного льдом HBSS, набитый и центрифуге при 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С для удаления несвязанных флуоресцентно-конъюгированные антитела.
- Приготовьте раствор загрузки FACS (500 нг / мл DAPI в HBSS-полной).
- После центрифугирования на этапе 5.1.6, аспирация супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 500 ц; Л FACS загрузки раствора. Передача клеточной суспензии в 12 х 75 мм с круглым дном трубки (FACS трубки) а и не держать трубку на льду в темноте до сортировки в течение 1 часа.
- Окрашивание для компенсации
- Этикетка 6 FACS труб, как PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI или неокрашенными. Алиготе спленоцитов на 1 × 10 6 клеток / пробирку в пробирки FACS и промывают 4 мл HBSS набитый при 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С.
Примечание: Использование ДНК-связывающим флуоресценции красителя, DAPI, чтобы отличить живые клетки от мертвых клеток. DAPI, может проходить через плазматическую мембрану мертвых клеток (но не живые клетки), и связывают хромосомной ДНК. - Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл HBSS-полной.
- В каждой соответствующей FACS трубки, добавьте один из следующих антител: анти-мышиного CD19-PE разбавлении 1:40, анти-CD11b-мышь-АРС-CY7 1:80 разведение, анти-мышь ПВПД-1-FITC, 1:40 разбавление или анти-мышиного В220-В500 1:40 разбавления в соответствии с рекомендациями производcturer. Оставьте 5 - й (DAPI) и 6 - е (FACS) безупречной трубки , как они. Хорошо перемешать встряхиванием и инкубировать все FACS пробирки на лед в темноте в течение 15 мин.
- После инкубации добавляют 4 мл охлажденного на льду HBSS, набитый в каждую пробирку и центрифугировать пробирки FACS при 800 х г в течение 5 мин, 4 ° С.
- После центрифугирования, аспирация супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл охлажденного льдом HBSS-полной для гранул в трубе с надписью DAPI, который ресуспендировали в 500 мкл FACS загрузки раствора исключением. держа все 6 трубок на льду в темноте до сортировки.
- Этикетка 6 FACS труб, как PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI или неокрашенными. Алиготе спленоцитов на 1 × 10 6 клеток / пробирку в пробирки FACS и промывают 4 мл HBSS набитый при 800 мкг в течение 5 мин, 4 ° С.
6. Сортировка по Клеточный сортер
Примечание: Операция сортировки процедуры на цитометр и программного обеспечения стандартизирована с подробной инструкцией, предоставленной компанией. Если коротко, то мы используем 100 мкм сопла при 20 фунтов на квадратный дюйм, установить концентрацию клеток - мишеней между 5 - 10 миллионов на мл, и регулировать КПД до 70% или выше (то есть, конфликты держали до 30 лет%).
- Приготовьте сбор FACS труб с 500 мкл FBS / пробирку, содержащую 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина.
- Настройка параметров компенсации из ячейки сортировщик с использованием компенсации трубок одной пятен с шага 5.2.
- Запись 10000 клеток в неокрашенной трубе, чтобы установить отрицательную ворота для каждой интенсивности флуоресценции.
- Запись 10000 клеток в других трубах компенсации одного пятна, чтобы установить положительные ворота для каждой интенсивности флуоресценции.
Примечание: Программа автоматически рассчитывает параметры компенсации.
- Используйте один образец с шага 5.1, чтобы установить ворота популяций отсортированных клеток путем записи 3000 клеток. Использование интенсивности флуоресценции в качестве параметров X и Y-оси графика, целевой популяции клеток ворот вручную, как группа точек, по-видимому, отделенных от других точек.
Примечание: Этот набор стробирования является гибким и произвольно на основе требований исследователей. Если исследователи ожидают более высокой чистоты на основе одного или более маркеров, перемещать воротавыше, на основании соответствующей интенсивности флуоресценции. - Загрузите пробирку для сбора и начинают сортировать популяцию клеток-мишеней.
- Держите пробирку для сбора на льду после сортировки, пока все пробирки с образцами не выполняются.
- Добавьте ледяную С10 в пробирку до 4 мл, кепке и инвертировать перемешать.
- Центрифуга отборная труба при 800 х г в течение 5 мин, 4 ° С, а затем аспирата супернатант, в результате чего около 200 мкл с помощью клеточного осадка нетронутым.
- Добавляют 1 мл охлажденного льдом С10 ресуспендируют осадок клеток и передать всю клеточную суспензию в 1,5 мл центрифужную пробирку.
- Центрифуга 1,5 мл трубки при 800 х г в течение 5 мин, 4 ° С и аспирата супернатант, оставляя по 100 мкл с клеточному осадку нетронутым.
- Храните отсортированных клеточных популяций на льду до использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы стремились обогатить костного мозга Pdc с высокой степенью чистоты, и без влияния других типов клеток, из MRL / LPR волчанка склонными мышей обоих молодых и старости для изучения функциональных изменений Pdc относительно их способности производить IFN &. Первая стратегия очистки была использована MCS, которая, как показано на рисунке 1, привела к только 7,75% чистоты после обогащения. По сравнению с MCS, FACS, обогащенный Pdc с чистотой, достигающей 96,4%. Для обеспечения высокой чистоты, шаг за шагом стратегии стробирования была выполнена. Как показано на рисунке 2, одноядерные клетки закрытого типа , и отделен от космического мусора рассеяния вперед (FSC) и параметров бокового рассеяния (SSC). Используя FSC-ширину (FSC-W) по сравнению с FSC-высоты (FSC-H) и SSC-W по сравнению с SSC-H, отдельные клетки закрытого типа , чтобы избежать ложных положительных сигналов , формируемых агрегатов. Живые отдельные клетки затем закрытого типа , как DAPI - население (DAPI + клетки мертвы или апоптическая).Из живых одиночных клеток, CD11c + CD11b - население закрытого типа, из которого B220 + PDCA-1 + население было дополнительно закрытого типа , как Pdc. Отсортированная Pdc были не только высокой чистоты, но и функционально нормально. Они имели возможность производить IFN & alpha ; в пробирке при стимуляции CpG , как показано на рисунке 3 (Повторная печать с разрешения нашей предыдущей публикации 17.
Рисунок 1. Чистота Pdc перебирал либо MCS и FACS методом проточной цитометрии Репрезентативный цифры , показывающие процент (CD11c Pdc + CD11b - B220 + PDCA-1 +). В отсортированных клетках по MCS (вверху) и FACS (внизу), соответственно. CD11c + CD11b - население закрытого типа от общего числа живых клеток (слева), а затем Pdc как B220 + PDCA-1 + Клетки закрытого типа в пределах CD11c + CD11b -. Населения (справа) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Gating Стратегия Pdc Обогащение FACS шаг за шагом стратегии стробирования в следующем порядке:. Мононуклеары на отдельные клетки FSC, в одиночных камерах SSC, чтобы DAPI - живые клетки, к CD11c + CD11b - и B220 + PDCA-1 + в качестве живой Pdc. Pdc в общей сложности одиночных клеток 2,95 ± 1,42%; сортируется номер Pdc составляет 0,88 ± 0,28 × 10 5 на мышь со скоростью восстановления составит около 50%. (П = 12 MRL / LPR мышей, данные представлены в виде среднего значения ± SD в 95% ДИ от среднего значения). 641fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 3. Производство по IFN & FACS отсортированных Pdc Рассортировано костного мозга Pdc обрабатывали класса A - CPG (ODN1585; 5 мкм) в течение 6 ч в пробирке. На рисунке, "у" означает более молодых, 6-недельных мышей; "O" означает более старых, 16-недельных мышей. MRL означает MRL мышей, как здоровых контрольных мышей; LPR выступает за MRL / LPR мышей как волчанка подверженных мышей. Концентрация & alpha; -IFN в культуральный супернатант измеряли методом ELISA. * Р <0,05, ** Р <0,01, *** р <0,001, в одну сторону ANOVA. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (n = 3 мыши в группе). Эта цифра воспроизводится из нашей публикации в журнале Immunology с разрешения. 17pload / 54641 / 54641fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
- Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
- Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
- Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
- Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
- Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
- Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
- Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
- Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).
