Summary
אנו מדווחים פרוטוקול באמצעות תא קרינת מיון מופעל לבודד תאי דנדריטים plasmacytoid (PDC) עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברי זאבת נוטה ללימודי תפקודיים של PDC.
Protocol
הערה: MRL / MP-פאס LPR (MRL / LPR) עכברים נוטה זאבת גידלו ומתוחזק מתקן הפתוגן ללא הספציפיים הבאים בדרישות של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) וירג'יניה טק (מספר אבטחת צער בעלי חיים: A3208-01). מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם המלצות המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת פרוטוקול IACUC # 12-062.
1. תא תרבות בינונית הצפת המיון
- כן בינוני תרבית תאים מלא (C10) באמצעות RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי, פירובט סודיום 1 מ"מ, 1% 100 ממ חומצות אמינו לא חיוניים, 10 HEPES מ"מ, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 2 מ"מ L- גלוטמין ו 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין.
- הכן חיץ מיון (HBSS-מלא) באמצעות תמיסת מלח מאוזן של 1x האנק (HBSS) השלימו עם 10 HEPES מ"מ, 2.5 מ"ג / מ"ל אלבומין בסרום שור,0.05 מ"מ MgCl 2 ו 0.2 U / ml I. DNase
2. עכבר Dissection
- הכינו שתי מנות בקוטר 6 ס"מ המכיל 4 מ"ל C10. מניחים את הכלים על קרח.
- להרדים את העכבר משאיפת CO 2.
- קציר את הטחול ולשמור אותו בצלחת עם C10 על הקרח.
- הצמד את העכבר למטה עם הבטן כלפי מעלה על הצלחת הניתוח. לעקר את הגוף על ידי ריסוס אתנול 70%.
- חותך את העור להפריד את העור מקיר השריר מתחת לאורך קו אמצע הגחון מן מאחת הערווה עד הצוואר.
- חותך את העור לאורך הגפיים האחוריים מן החתך הראשון עד הקרסול.
- הצמד את העור לאחור בצדדים וחתך את קיר השרירים בצדי מהמקום החתך הראשון ממברנות.
- הצמד את קיר שרירי הגב בצד ימין של הראש.
- אתר את הטחול בצד הימני של העכבר מתחת המעי הדק ליד הקיבה. תרים קצה אחד של הטחול הדואר ולהפריד אותו מהבטן.
- חותכים שתי הגפיים האחוריות החוצה, כולל עצם הירך לבין השוקה, ולהסיר את כל השרירים ככל האפשר.
- חותך את השרירים לאורך הגפיים האחוריים מהג'וינט האגן / הירך עד הקרסול עם מספריים חדים, מנסה להימנע כלי דם.
- הפרד את הגפיים האחוריים בגזירה במפרק האגן / ירך מפרק קרסול / רגל ללא חשיפת תוכן מח עצם.
- שרירים הנותרים נקיים על העצמות על ידי גירוד עם סכין גילוח שוב ושוב וחיתוך השרירים בנקודות המשותפות.
- שמור את עצמות בצלחת 6 ס"מ המכיל 4 C10 מ"ל על הקרח. המשך ביתור העכבר הבא.
3. בידוד Splenocyte
- Homogenize הטחול בעדינות עם בוכנת מזרק נגד מסננת תא 70 מיקרומטר על גבי הצלחת ובה C10 4 מיליליטר עד שלא חתיכות אדומות נראות.
- להוסיף C10 נוסף 6 מ"ל לתוך צלחת דרך מסננתnd מכן להעביר את ההשעיה תא הכולל 10 מ"ל צינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה צינור החרוטים ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 2 מ"ל 1 x תאי דם אדומים (RBC) חיץ תמוגה. לדגור על RT במשך 5 דקות.
- לאחר דגירה, צנטריפוגות צינור החרוטים ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 C10 מ"ל. לבטל את כל גושים גדולים (תאים מתים) ולשמור את הצינור על קרח למשך מאוחר יותר.
הערה: אם יש הרבה גושים קטנים, להשתמש מסננת תא 70 מיקרומטר לסנן את ההשעיה תא פעם. - לספור את המספר הסלולרי עם trypan הכחול באמצעות דלפק תא אוטומטי.
4. בידוד תא מח עצם
- מעבירים את העצמות עם 4 מ"ל C10 לתוך מרגמה ולהוסיף 6 C10 מ"ל לעשות נפח של 10 מ"ל C10 בסך הכל.
- לפצח את העצמות בעדינות המרגמה באמצעות apestle.
- מערבבים בעדינות עם העלי כדי לשחרר את מח העצם לתוך C10.
- מעבירים את C10 10 מ"ל המכיל מח עצם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל על הקרח דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. להוסיף C10 10 מ"ל טריים אל תוך המדוכה עדיין המכיל את העצמות.
הערה: פיפטה הפתרון המכיל עד עצם מח ומטה מספר פעמים לפני שהם מעבירים דרך מסננים אם גושים אדומים גלויים. - חזור על שלבי 4.2 עד 4.4 פעמים. לאחר לשטוף האחרון, העצמות אמורות להופיע לבן.
- צנטריפוגה צינור חרוטי 50 מ"ל ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C. בינתיים מכינים 5 מ"ל מוכן לשימוש בינוני שיפוע צפיפות בתוך שפופרת צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל ב RT.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 C10 מ"ל.
- לאט שכבת השעית התא 10 מיליליטר על גבי מדיום שיפוע צפיפות 5 מיליליטר, שמירת ממשק ברור בין שני השלבים. ואז צנטריפוגות צינור חרוטי 15 מ"ל ב 1,363 גרם במשך 30 דקות בRT (20 מעלות צלזיוס) עם סט אץ כמו 9 האטה להגדיר כמו 0 (או הבלם OFF).
- לאחר צנטריפוגה, להסיר את הפתרון העליון 8 מ"ל בזהירות ולאסוף את המעיל 2 מ"ל באפי על הממשק (שכבה של תאים mononuclear) לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל חדש.
- להוסיף 12 C10 מ"ל קרח קר עד 15 מ"ל צינור חרוטי המכיל תאים mononuclear מח עצם, כובע ו להפוך כמה פעמים כדי לערבב היטב, אז צנטריפוגות צינור ב 800 XG במשך 10 דקות, 4 ° C.
5. מכתים פני התא עבור FACS
- מכתים לדוגמא
- כן פתרון נוגדן אנטי עכבר CD16 / 32 (1 דילול 100 HBSS-מלא, 5 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי).
- לאחר צנטריפוגה בשלב 4.10, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 פתרון נוגדנים μl אנטי עכבר CD16 / 32 לחסום קולטני Fc על תאים mononuclear. דגירה על קרח למשך 10 דקות.
- הכן תערובת נוגדנים הקרינה מצומדות (נמלהi-עכבר CD11c-PE 01:40 דילול, אנטי עכבר CD11b-APC-Cy7 1:80 דילול, אנטי עכבר PDCA-1-FITC 1:40 דילול אנטי עכבר B220-V500 01:40 דילול HBSS- מלא כפי המומלץ על ידי היצרן ב 100 נפח סופי μl לדגימה).
הערה: חשוב לכייל נוגדנים לפני השימוש. - לאחר 10 דקות הדגירה בשלב 5.1.2, להוסיף 4 מ"ל קרח קר HBSS מלא צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C כדי להסיר מאוגד אנטי עכבר CD16 / 32.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 תערובת נוגדנים μl הקרינה מצומדות. דגירה על קרח למשך 15 דקות בחושך.
- לאחר 15 דקות דגירה, להוסיף 4 מיליליטר קרח קר HBSS מלא צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C כדי להסיר נוגדני קרינת מצומדות מאוגדים.
- כן פתרון טעינת FACS (500 ng / ml DAPI ב HBSS-מלא).
- לאחר צנטריפוגה בשלב 5.1.6, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 μ; L FACS פתרון הטעינה. מעביר את השעית התא לתוך (צינור FACS) צינור תחתי עגול 12 x 75 מ"מ ולשמור את הצינור על קרח בחושך עד מיון בתוך השעה 1.
- מכתים לפיצוי
- צינורות לייבל 6 FACS PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI או בלא כתם. Splenocytes Aliquot ב 1 x 10 6 תאים / צינור לתוך צינורות FACS, ולשטוף עם 4 מ"ל HBSS מלא ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C..
הערה: השתמש DNA מחייבת הקרינה לצבוע, DAPI, להבחין בין תאים חיים מן התאים המתים. DAPI יכולים לעבור דרך קרום התא של תאים מתים (אבל לא של תאים חיים) ו- DNA כרומוזום לאגד. - לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 μl HBSS-מלא.
- בכל צינור FACS המתאים, להוסיף אחד נוגדנים הבאים: אנטי עכבר CD19-PE 01:40 דילול, אנטי עכבר CD11b-APC-Cy7 1:80 דילול, אנטי עכבר PDCA-1-FITC 1:40 דילול או B220-V500 01:40 דילול אנטי עכבר כפי שהומלץ על ידי manufacturer. השאירו את ה -5 (DAPI) ו -6 (בלא כתם) FACS צינורות כפי שהם. מערבבים היטב על ידי רועדת דגירה כל צינורות FACS על הקרח בחושך במשך 15 דקות.
- לאחר דגירה, להוסיף 4 מ"ל קרח קר HBSS מלא לתוך צינור כל צנטריפוגות צינורות FACS ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 500 קרח μl HBSS קר-מלא למעט גלולה בצינור שכותרתו DAPI, אשר resuspended ב 500 μl FACS פתרון הטעינה. שמירה על כל 6 צינורות על הקרח בחושך עד מיון.
- צינורות לייבל 6 FACS PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI או בלא כתם. Splenocytes Aliquot ב 1 x 10 6 תאים / צינור לתוך צינורות FACS, ולשטוף עם 4 מ"ל HBSS מלא ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C..
6. מיון על הסדרן הנייד
הערה: מבצע של מיון הליך על cytometer והתוכנה טופל עם הדרכה מפורטת המסופקת על ידי החברה. בקצרה, אנו משתמשים 100 זרבובית מיקרון ב 20 psi, ריכוז תא היעד שנקבע בין 5 - 10 מיליון דולר מ"ל, ולהתאים יעילות עד 70% ומעלה (כלומר, סכסוכים הזמן תחת 30%).
- הכן צינורות אוסף FACS עם 500 μl FBS / צינור המכיל 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין.
- להתאים את הפרמטרים פיצוי של סדרן התא באמצעות צינורות פיצוי חד כתם משלב 5.2.
- קלט 10,000 תאי צינור בלא כתם להגדיר שער שלילי עבור כל עוצמת פלורסנט.
- קלט 10,000 תאי צינורות פיצוי חד כתם אחרים כדי להגדיר שער חיובי עבור כל עוצמת פלורסנט.
הערה: התוכנה מחשבת את הפרמטרים פיצוי אוטומטי.
- השתמש מדגם אחד משלב 5.1 כדי להגדיר את השערים של אוכלוסיות תאים ממוינות על ידי הקלטת 3,000 תאים. באמצעות עוצמת פלורסנט כפרמטרים של X ו- גרף ציר Y, אוכלוסיית תאי יעד השער באופן ידני כקבוצה של נקודות כנראה מופרדות נקודות אחרות.
הערה: סט gating זהו גמיש שרירותי המבוסס על הדרישות של חוקרים. אם החוקרים מצפים טוהר גבוה יותר על בסיס סמנים אחד או יותר, להזיז את השערגבוה יותר על בסיס עוצמת ניאון המקביל. - טען צינור איסוף ולהתחיל למיין את אוכלוסיית תא המטרה.
- שמור את צינור איסוף על הקרח לאחר מיון עד שכל דוגמיות נעשים.
- להוסיף C10 קר קרח על צינור איסוף עד 4 מ"ל, כובע להפוך לערבב.
- צנטריפוגה צינור האיסוף ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C, ולאחר מכן לשאוב supernatant, יוצא בסביבות 200 μl עם תא גלול ללא פגע.
- להוסיף C10 קר קרח 1 מ"ל ל resuspend התא גלולה ולהעביר את כל השעיה התא לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות.
- צנטריפוגה צינור 1.5 מ"ל ב 800 XG במשך 5 דקות, 4 ° C ו לשאוב supernatant, עוזב 100 μl עם תא גלולה ללא פגע.
- אחסן את אוכלוסיות תאים ממוינים על הקרח עד לשימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החוקרים בקשו להעשיר מח עצם PDC עם טוהר גבוה, וללא השפעת סוגי תאים אחרים, מן MRL / LPR נוטה זאבת עכברי שניהם בגיל צעיר ומבוגרים ללמוד את השינויים התפקודיים של PDC באשר ליכולתם לייצר IFNα. אסטרטגית הטיהור הראשונה השתמשה הייתה MCS, אשר, כפי שמראה איור 1, הוביל רק 7.75 טוהר% לאחר העשרה. לעומת MCS, FACS מועשר PDC עם טוהר גבוה ככל 96.4%. כדי להבטיח טוהר גבוהה, אסטרטגיה gating צעד-אחר-צעד בוצע. כפי שניתן לראות בתרשים 2, תאי mononuclear היו מגודרים ומופרד פסולת על ידי פיזור קדימה (FSC) ולפזר בצד (SSC) פרמטרים. שימוש ברוחב FSC (FSC-W) לעומת גובה FSC (FSC-H) ו SSC-W לעומת SSC-H, תאים בודדים היו מגודרים כדי למנוע את האותות חיוביים הכוזבים המיוצרים על ידי אגרגטים. תאים בודדים לחיות אז היו מגודרים כמו DAPI - האוכלוסייה (DAPI + תאים מתים או אפופטוטיים).מ תאי בודדים חיים, CD11c + CD11b - האוכלוסייה מגודרת, שממנו B220 + PDCA-1 + אוכלוסייה מגודרת נוספת כמו PDC. מסודרי PDC היה לא רק של טוהר גבוה, אלא גם מבחינה תפקודית נורמלי. היו להם את היכולת לייצר IFNα במבחנה על גירוי CPG כפי שמוצג באיור 3 (Re-הדפסה באישור בפרסום הקודם שלנו 17.
איור 1. טוהר PDC נברו או MCS ו FACS שיטת תזרים נציג cytometry דמויות מראה את אחוז PDC (CD11c + CD11b - B220 + PDCA-1 +). בתאים מסודר לפי MCS (למעלה) FACS (למטה), בהתאמה. CD11c + CD11b - האוכלוסייה מגודרת תאים חיים הכולל (משמאל), ולאחר מכן PDC כמו B220 + PDCA-1 תאים + היו מגודרים בתוך CD11c + CD11b -. האוכלוסייה (מימין) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. אסטרטגיה gating עבור העשרה PDC ידי FACS אסטרטגיה gating צעד-אחר-צעד לפי הסדר הבא:. תאים mononuclear תאים בודדים FSC, תאים בודדים SSC, כדי DAPI - תאים חיים, כדי CD11c + CD11b -, וכדי B220 + PDCA-1 + כמו PDC חי. PDC בתאים יחיד הכולל הוא 2.95 ± 1.42%; מספר PDC המסודר הוא 0.88 ± 0.28 x 10 5 לכל עכבר עם קצב החלמה סביב 50%. (N = 12 MRL / LPR עכברים, הנתונים מוצגים כממוצע ± SD ב 95% CI של הממוצע). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 3. IFNα ייצור ידי FACS-מסודרים PDC מח עצם ממוין PDC טופלו בכיתה CPG (ODN1585; 5 מיקרומטר) במשך 6 שעות במבחנה. באיור, "y" מייצג הצעיר, 6 שבועות בן עכברים; "O" מייצג מבוגרים, 16 שבועות בן עכברים. MRL מייצג עכברים MRL כמו עכברים שליטה בריאים; LPR מייצג עכברי MRL / LPR כעכברים מועד זאבת. ריכוז IFNα ב supernatant התרבות נמדד עם ELISA. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, חד סטרי ANOVA. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (n = 3 עכברים בכל קבוצה). נתון זה לשכפל מהפרסום שלנו ב- Journal of Immunology באישורו. 17"Target =" pload / 54,641 / 54641fig3large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
- Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
- Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
- Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
- Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
- Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
- Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
- Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
- Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).
