Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

مقايسة حركية بلاناية لقياس خصائص المنتجات الطبيعية ذات الخواص الحيوية

Published: May 30, 2020 doi: 10.3791/61070
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State University of New York (SUNY) at Morrisville

Summary

يستخدم حركية بلاناريان لقياس خصائص المنشطات والانسحاب من المنتجات الطبيعية بالمقارنة مع حركة الحيوانات في مياه الينابيع وحدها.

Abstract

ويرد وصف وسيلة مباشرة، ويمكن السيطرة عليها لاستخدام غير الطفيلية، دوديسيا التيغرينا،دودة مسطحة مائية حرة المعيشة، لدراسة خصائص المنشطات والانسحاب من المنتجات الطبيعية. وقد طبقت التشايسات التجريبية التي تستفيد من جوانب فريدة من علم وظائف الأعضاء في علم وظائف الأعضاء في علم التشريح على الدراسات المتعلقة بشفاء الجروح، والتجدد، و ورم. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لأن المُعَدَّين لديهم لديهم حساسية تجاه مجموعة متنوعة من المحفزات البيئية، وهم قادرون على تعلم وتطوير استجابات مشروطة، يمكن استخدامها في الدراسات السلوكية التي تدرس التعلم والذاكرة. يمتلك المواطعون تناظر ثنائي أساسي ونظامًا عصبيًا مركزيًا يستخدم أنظمة عصبية قادرة على دراسة آثار المُحتَولات الحيوية العصبية العضلية. ونتيجة لذلك، تم تطوير نظم تجريبية لرصد الحركة اليافعة والحركة لفحص إدمان المواد وسحبها. لأن الحركة غير الساحلية توفر إمكانية نظام فحص حركية حساس وموحد بسهولة لمراقبة تأثير المحفزات ، تم تكييف اختبار السرعة الحركية (pLmV) لرصد كل من التحفيز وسلوكيات الانسحاب من قبل الوسطاء من خلال تحديد عدد خطوط الشبكة التي عبرتها الحيوانات مع مرور الوقت. هنا ، يتم توضيح التقنية وتطبيقها وشرحها.

Introduction

ويستخدم البروتوكول الموصوف الحركة الوازمية لتوفير وسيلة لتقييم آثار المواد الطبيعية المعدلة بيولوجياً. وقد تم تكييفها على وجه التحديد لتحديد ما إذا كانت هذه المواد تعمل كمنشطات، وإذا كانت مرتبطة بعد ذلك بسلوك انسحاب قابل للقياس1. هذا الفحص، والمعروف باسم اختبار السرعة الحركية غير الساحلية (pLmV)، تم استخدامه لأول مرة لاختبار العوامل الدوائية المعروفة2،3. وقد نما تطبيق هذا التحليل القائم على الحركة الواهية منذ ذلك الحين في شعبيته واعتمد من قبل مختبرات مختلفة مهتمة بمواد أخرى غير المنتجات الطبيعية4,5. لهذا الفحص، يتم وضع بلانكاري في طبق بيتري يحتوي على مياه الينابيع أو مياه الينابيع التي تحتوي على مودولاتور حيوي مذاب. لأن الطبق نفسه يوضع على ورق الرسم البياني، يمكن استخدام عدد خطوط الشبكة التي يعبرها الحيوان مع مرور الوقت أثناء تحركه حول الحاوية لتحديد معدل الحركة في كل حالة. اختبار الضوء / الظلام ، وإلا يشار إليه باسم اختبار تفضيل المكان المشروط (CPP) ، هو اختلاف آخر حول موضوع مراقبة الحركة المحيطية ، ويقيّم مدى سرعة استجابة الحيوانات والهجرة إلى بيئة مظلمة6،7. ويمكن أيضا أن تتبع الفيديو من الحركات االبارانية يمكن تحليلها باستخدام برامج الكمبيوتر ومركز الكتلة (كوم) تتبع8،9،10،11.

استخدام planarian كنموذج حيواني لمثل هذه الدراسات يقدم العديد من المزايا على الحيوانات الأخرى في أن المجرب يمكن بسهولة السيطرة على بيئة الفحص. على وجه التحديد ، يمكن أن تجويع planarians قبل التجريب منع تعرضهم لغيرها من العوامل الغذائية أو الدوائية التي قد تربك النتائج ، ويمكن إدخال مودولاتور محدد قيد التحقيق إلى planarians ببساطة عن طريق إضافته مباشرة إلى المياه الثقافة ، وبالتالي توحيد التعرض. منذ لديها الجهاز العصبي والناقلات العصبية التي تذكرنا 'أعلى من أجل' الحيوانات، وعلم وظائف الأعضاء والاستجابات التجريبية لهذه الحيوانات إلى المحفزات العصبية العضلية تعتبر ذات الصلة بيولوجيا إلى الكائنات الحية الأخرى12,13,14,15,16. أيضا، لأن غير مكلفة نسبيا وs-1311 غير مكلفة نسبيا ومباشرة للحفاظ على في المختبر، أنها توفر نموذجا بيولوجيا يمكن الوصول إليها لكثير من المحققين.

كما تجريبي، planarians هي مناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات. على سبيل المثال، مجموعتنا، فضلا عن غيرها من المحققين استخدام الباريتاريون لدراسة ورمريجنيس17،18،19. كما يعرض الـ Planarians أيضًا مجموعة من سلوكيات الاستجابة للمحفزات الكيميائية والحرارية والجاذبية والكهربائية والصورة والمغناطيسية التي شكلت أساس أنظمة فحص أخرى. وقد استخدمت بعض هذه الآثار لدراسة التعلم والذاكرة في هذه الحيوانات20،21،22،23،24،25،26،27. الاستخدام الأولي للنموذج اللانطاري في الأدب في الوقت الحاضر يركز على نشاط الخلايا الجذعية متعددة القدرات، ودعا neoblasts، ودورها في تجديد28،29،30. وهكذا، فإن اعتماد النموذج الموصوف هنا يسمح بمزيد من الدراسة باستخدام مقايسات أخرى قائمة على أساس من االشماحي لتوفير فهم أوسع لكيفية تأثير المنتجات الطبيعية وغيرها من المواد الحيوية على الكائن الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1- تربية تربية بلاناري

  1. استخدام الـ planarians المشتراة من شركة إمدادات بيولوجية أو البرية اشتعلت إذا لزم الأمر. و"البلاوناريين" المستخدمين في هذا البروتوكول هم "دوغسيا تيغرينا" (Dugesia tigrina)كما هو مدرج في قائمة التوريد. ويشار أيضا إلى هذا النوع باسم جيرارديا التيغرينا31. الأنواع المائية الأخرى هي أيضا مقبولة2،3.
    ملاحظة: البروتوكول الموصوف موجه للحيوانات التي تم شراؤها من شركة إمدادات بيولوجية. لم يتم اختبار نظام الفحص هذا مع الـ(بلانفاريون) الذين تم القبض عليهم. ومع ذلك ، إذا تم استخدام الـ planarians الذين يتم صيدهم في البرية ، فمن المستحسن أن يتم التعود على المياه المستخدمة في التجارب ، وكذلك البيئة المختبرية لمدة أسبوع على الأقل قبل الاستخدام.
  2. عند الوصول، نقل planarians إلى حاويات تخزين المواد الغذائية البلاستيكية التي تحتوي على مياه الينابيع النظيفة والحفاظ على الأغطية ajar.
  3. الحفاظ على الـ"بلاناريوس" في بيئة مظلمة.
  4. تغذية اغذية 24-36 ساعة في 24-36 ساعة في بيئتهم الجديدة.
  5. السماح للمختبرين بالتأقلم مع المختبر قبل أسبوع على الأقل من إجراء التجارب.
  6. تغذية الـ(بلانفاريون) على جدول زمني منتظم مرتين في الأسبوع
    1. السماح ل planarians لتغذية libitum الإعلانية على البيض المسلوق العضوي المفروم أو الكبد المخلوطة لحم البقر العضوي لمدة 1-2 ساعة.
    2. وضع غذى المواليسين في وعاء نظيف بعد التغذية.
      1. إزالة المياه المسخة قبالة planarians.
      2. استخدام فرشاة صغيرة مسطحة مائية (رقم 3-6) لنقل الأنقاض الغذائية والوحل التمسك الحاوية من حول planarians إلى منشفة ورقية.
      3. مع مياه الينابيع العذبة ودوامة لطيف أو التحريض، طرد planarians وصبها في وعاء نظيف.
      4. ويمكن نقل أي من الـ planarians الذين يتم الالتزام بها إلى الحاوية باستخدام فرشاة طلاء مائية مستديرة (رقم 3-6) أو ماصة نقل مع تحمل واسع.
      5. اطهروا من نقل المياه
      6. تغطية planarians مع مياه الينابيع النظيفة.
      7. بعد 24 ساعة، قم بإزالة المواطعين من أي نفايات غذائية مطرودة عن طريق نقلها إلى حاوية نظيفة على النحو المبين أعلاه (الخطوات 1-6-2-1-1-6-2-6).
  7. لتنظيف الحاويات والأواني المستخدمة لتربية تربية غير مُنطّة، لا تستخدم الصابون أو المنظفات. تنظيف هذه العناصر عن طريق شطف لهم جيدا مع المياه النظيفة (ماء الصنبور هو مقبول) وتجفيفها بقطعة قماش نظيفة أو منشفة ورقية.

2- إعداد الموامَرَين للتجارب

  1. السماح لالخوالقية المسلمة حديثا للتأقلم مع بيئتهم على الأقل 1 أسبوع قبل التجريب.
  2. تجويع 5-10 أيام قبل التجارب.
  3. تغيير المياه الثقافة على الأقل 1x خلال فترة المجاعة.

3. اختبار السرعة الحركية الحدية (pLmV) : السلوكيات المنشطة

  1. قبل التجريب ، تأكد من تشكيل المتعطشين بشكل كامل ، مع رأس وذيل كامل ومصطبغ.
  2. إعداد طبق بيتري زجاجي أو بلاستيكي 10 سم وحاوية معتادة لاختبار pLmV قبل بدء التجربة.
    1. ضع طبق بيتري قطره 10 سم نظيف لاستخدامه في اختبار pLmV على ورق الشبكة الم prelaminated (مع مربعات 0.5 سم).
    2. إضافة 20 مل من مياه الينابيع غير مغشوشة للضوابط، أو مياه الينابيع التي تحتوي على التركيز المناسب للمنتج الطبيعي يجري اختبارها، إلى 10 سم قطر طبق بيتري لاستخدامها لاختبار pLmV.
    3. ضع كاميرا (مثل الهاتف الخليوي أو كاميرا عالية الدقة) فوق طبق Petri المُعد الذي يبلغ قطره 10 سم لتسجيل الحركة البينية على ورق الشبكة أثناء التجربة. موقف حلقة هو وسيلة مريحة لوضع الكاميرا على مسافة يمكن أن تسجل وجهة نظر كاملة من 10 سم بيتري الطبق وخطوط الشبكة.
    4. إعداد حاوية التعود مع 5-10 مل من مياه الينابيع غير المغشوشة (الضوابط)، أو مياه الينابيع التي تحتوي على التركيز المناسب للمنتج الطبيعي الذي يجري اختباره. حاوية مماثلة لقارورة متألقة أو صغيرة 5 سم طبق بيتري هو مناسبة.
  3. استخدام صغيرة، نظيفة، مسطحة، أو جولة فرشاة الألوان المائية لنقل بلطف ألواح من وعاء الأسهم مع مياه الينابيع إلى حاوية التعود وجود 5-10 مل من مياه الينابيع أو مياه الينابيع غير مغشوشة التي تحتوي على المنتج الطبيعي يجري اختبارها.
    ملاحظة: عند التلاعب في الـ planarians لم مقايسة pLmV، استخدم فرشاة طلاء صغيرة أو نظيفة أو مسطحة أو مستديرة بالألوان المائية (رقم 3-6). عند تحريك الـ planarians ، يجب وضع الفرشاة تحت الحيوان لرفعه بلطف. لضمان عدم تلف الـ planarians عند استخدام الفرشاة ، لا ينبغي أن يتم تشغيل شعيرات الفرشاة تحت الحيوان. انتشار من شعيرات يمكن أن تضر بلاناريان إذا تم القبض عليه بين ألياف الفرشاة.
    ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام ماصة نقل واسعة من الآبار لنقل الـ planarian إلى حاوية عتادية نظيفة وجافة.
    1. إذا كان استخدام الماصة، وإزالة المياه الزائدة المنقولة مع بلانكاريان من حاوية التعود باستخدام ماصة نقل.
    2. إضافة بعناية إلى حل التعود (أي مياه الينابيع للضوابط أو مياه الينابيع التي تحتوي على تركيز المنتج الطبيعي الذي يجري اختباره) إلى حاوية التعود التي تحتوي على الـ planarian.
  4. تعتمد فترات التعود على ديناميات التحفيز التي تم تقييمها للمنتج الطبيعي الذي يجري اختباره. وقد ثبت أن زمن التعود من 2 دقيقة مقبولة للكشف عن التحفيز في هذا العمل1.
  5. بعد فترة التعود 2 دقيقة استخدام فرشاة الطلاء بالألوان المائية لنقل بلطف planarian إلى وسط طبق بيتري 10 سم المعدة لتجربة التحفيز pLmV.
  6. بدء تشغيل الكاميرا لتسجيل حركة من ا. بلانكاري. سجل 10-11 دقيقة من الفيديو.
  7. إعداد حاوية التعود وطبق بيتري 10 سم لتجربة pLmV مع حلول جديدة لكل بلانكاري.
  8. استخدم ماصات مخصصة، وأطباق، وحاويات، وفرش للدهانات لكل تركيز تجريبي للمنتج الطبيعي الذي يجري اختباره لتجنب تعريض الـ planarians عن غير قصد إلى الحل الخاطئ أثناء التجريب.
  9. لأن علم الـ "بلانارين" يحمل سلوكيات متعلّم، كلّ مُنطّيّ (تحكم أو اختبار) يجب أن يُستخدم مرة واحدة فقط21،,22.

4. اختبار السرعة الحركية الحدية (pLmV) : السلوكيات الانسحابية

  1. قبل التجريب ، تأكد من تشكيل المتعطشين بشكل كامل ، مع رأس وذيل كامل ومصطبغ.
  2. إعداد طبق بيتري 10 سم (الزجاج أو البلاستيك) لتجربة pLmV، طبق بيتري 5 سم (الزجاج أو البلاستيك) لشطف التعود على التعود على الأطباق، وحاوية التعود قبل بدء التجربة.
    1. ضع طبق بيتري قطره 10 سم نظيف لاستخدامه في تجربة pLmV على ورق الشبكة الم prelaminated مع مربعات 0.5 سم).
    2. إضافة 20 مل من مياه الينابيع غير مغشوشة إلى 10 سم قطر طبق بيتري لاستخدامها في تجربة pLmV.
    3. ضع كاميرا فوق طبق بيتري المعدة قطره 10 سم كما هو الحال في الخطوة 3.2.3 لتسجيل الحركة الياقيّة على ورق الشبكة أثناء التجربة.
    4. إعداد وعاء شطف االشطيف من خلال إضافة 5 مل من مياه الينابيع وحدها إلى طبق بيتري 5 سم.
    5. إعداد حاوية التعود مع 5-10 مل من مياه الينابيع غير المغشوشة (الضوابط) أو مياه الينابيع التي تحتوي على المنتج الطبيعي الذي يجري اختباره. حاوية مماثلة لقارورة متألقة أو صغيرة 5 سم طبق بيتري (الزجاج أو البلاستيك) هو مناسبة.
  3. استخدام صغيرة، نظيفة، مسطحة، أو جولة الفرشاة المائية لنقل بلانكاري من مياه الينابيع إلى حاوية التعود المعدة بعد 5-10 مل من مياه الينابيع غير المغشوشة (الضوابط) أو مياه الينابيع التي تحتوي على المنتج الطبيعي يجري اختبارها. نقل بلطف الحيوان من حاوية الأسهم إلى حاوية التعود. ضمان لا يتم تلف ا لا planarian من الفرشاة.
    ملاحظة: عند التلاعب في الـ planarians لم مقايسة pLmV، استخدم فرشاة طلاء صغيرة أو نظيفة أو مسطحة أو مستديرة بالألوان المائية (رقم 3-6). عند تحريك الـ planarians ، يجب وضع الفرشاة تحت الحيوان لرفعه بلطف. لضمان عدم تلف الـ planarians عند استخدام الفرشاة ، لا ينبغي أن يتم تشغيل شعيرات الفرشاة تحت الحيوان. انتشار من شعيرات يمكن أن تضر بلاناريان إذا تم القبض عليه بين ألياف الفرشاة.
    ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام ماصة نقل واسعة لنقل الآبار لنقل الـ planarian إلى حاوية تناوها نظيفة وجافة.
    1. إذا كان استخدام الماصة، والمياه الزائدة المنقولة مع بلاناريان ينبغي إزالتها من حاوية التعود باستخدام ماصة نقل.
    2. إضافة بعناية إلى حل التعود (أي مياه الينابيع غير المغشوشة للضوابط أو مياه الينابيع التي تحتوي على المنتج الطبيعي الذي يجري اختباره) إلى حاوية التعود التي تحتوي على الـ planarian.
  4. تعتمد فترات التعود على السحب على ديناميات التحفيز التي يتم تقييمها للمنتج الطبيعي الذي يجري اختباره؛ 2-5 دقيقة قد ثبت كافية.
  5. بعد فترة التعود استخدام فرشاة الطلاء بالألوان المائية لنقل بلطف planarian إلى طبق بيتري 5 سم المعدة التي تحتوي على مياه الربيع لشطف أي منتج طبيعي من حاوية التعود. ضمان لا يتم تلف ا لا planarian من الفرشاة.
  6. نقل على الفور من الناحية النيانية إلى مركز طبق بيتري المعدة 10 سم التي تحتوي على مياه الينابيع لتجربة الانسحاب pLmV. ضمان لا يتم تلف ا لا planarian من الفرشاة.
  7. بدء تشغيل الكاميرا لتسجيل حركة من ا. بلانكاري. سجل 10-11 دقيقة من الفيديو.
  8. إعداد حاوية التعود، وعاء شطف، وطبق بيتري 10 سم لتجربة pLmV مع حلول جديدة لكل بلاناريان.
  9. استخدم ماصات مخصصة، وأطباق، وحاويات، وفرش للدهانات لكل تركيز تجريبي للمنتج الطبيعي الذي يجري اختباره لتجنب تعريض الـ planarians عن غير قصد إلى الحل الخاطئ أثناء التجريب.
  10. لأن علم الاريانيين تظهر السلوكيات المستفادة، استخدم كل اٍنيناري (مراقبة أو اختبار) مرة واحدة فقط26،,27.

5 - تحليل البيانات

  1. إعداد جدول تجميع بيانات لتوثيق السلوك و حركة من الشبكات كـ عدد خطوط الشبكة عبر لكل دقيقة أثناء تشغيل pLmV. وينبغي أن يسمح الجدول بتوثيق العدد المتراكم من الخطوط في الدقيقة التي يعبرها المخطّط أيضاً. تضمين خطوط للملاحظات وجدول تعريفات لحصة الملاحظة من السلوكيات خلال الفترة التجريبية، مثل 'تجول' و 'وقف' (انظر المناقشة).
  2. باستخدام الفيديو، عد عدد خطوط الشبكة الكاملة التي يعبرها الـ planarian في الدقيقة الواحدة لمدة 10 دقائق، وسجل هذا الرقم على جدول البيانات. يتكون السلوك الياقي النموذجي من السرعة المستمرة ، وحركة أفقية موجهة إلى الأمام ، مع المنعطفات الدورية ، وبدون توقف.
    1. تبدأ في وقت التجربة في النقطة التي انتقلت من الفرشاة من الفرشاة المستخدمة لنقله إلى 10 سم بتري. سجل وقت البدء هذا.
    2. لتحديد متى يعبر الحيوان مربع شبكة كاملة، والتركيز على الرأس وتسجيل خط واحد عندما يعبر الرأس تماما مربع.
    3. لتسجيل شبكة كاملة عندما تتحرك الدودة حول حافة الطبق ، تصور مسافة 0.5 سم عن طريق الإشارة إلى الخطوط أثناء امتدادها من هوامش الطبق. إذا كان لانياري يعبر زاوية مربع، راجع الخط الثاني عبرت ليسجل خط شبكة واحدة. مرة أخرى ، والتركيز على الرأس لجعل هذه القرارات.
    4. إيقاف الفيديو بعد كل دقيقة لتسجيل البيانات.
    5. عند إعادة تشغيل الفيديو لحساب الدقيقة التالية، إذا كان رأس الفيروس المتنقل بين خطوط الشبكة عندما تم إيقاف الفيديو، تسجيل الخط الأول عبرت كمربع كامل.
    6. تسجيل عدد خطوط الشبكة عبرت لمدة 10 دقيقة.
  3. إذا توقف الحيوان عن الحركة أثناء اختبار pLmV ولم يعد يعبر خطوط الشبكة خلال وقت التسجيل لمدة 10 دقائق ، فوثق سلوك الـ planarian في المخطط السلوكي (على سبيل المثال ، "تجول" أو "توقف"). وينبغي بدلا من ذلك أن تؤخذ في الاعتبار الحيوانات التي توقف مسارها إلى الأمام أثناء فحص pLmV من البيانات المقدمة كتردد من العدد الإجمالي للحيوانات المعرضة لهذا التركيز الكاشف. يشير السلوك المتشنج أو اللولبي (المعروف باسم C) الذي يمنع أي حركة إلى الأمام أثناء فترة التعود إلى أن تركيز المنتج الطبيعي غير مناسب للاستخدام في مقايسة pLmV لأن مقايسة pLmV تستند إلى الحركة. يمكن تحليل السلوكيات من نوع C باستخدام نوع مختلف من التحليل (راجع المناقشة).
  4. إذا كان ذلك ممكنا، اختبار تركيزات تجريبية متعددة من المنتج الطبيعي باستخدام ما لا يقل عن 9-12 الديدان في أيام مختلفة وأوقات مختلفة من اليوم إذا تحديد التأثير العام للمكشف على علم وظائف الأعضاء. ومع ذلك ، إذا سعى الباحثون إلى الحد من التغير الناجم عن الإيقاع الإيقاعي ، يمكن إجراء التجارب مع الإضاءة المستمرة في وقت معين من اليوم باستخدام الديدان التي يتم استزراعها مع دورات ضوئية / داكنة الوقت وتعيين أوقات التغذية. يكون اثنين على الأقل من المجربين المشاركين في المشروع للسماح لخيار وجود بيانات سجل الفردية واحد، في حين أن الفرد الثاني بحساب خطوط الشبكة 'أعمى' للشروط المستخدمة لجمع البيانات. كما أن إشراك أفراد مختلفين في جمع البيانات، فضلا عن الحسابات والتحليلات الإحصائية، يقلل أيضا من التحيز المحتمل.
  5. حساب عدد خطوط الشبكة لكل تركيز منتج طبيعي في كل يوم بالنسبة إلى عدد التحكم لكل دقيقة بحيث يمكن دمج البيانات من أيام وأوقات ومجربين مختلفين. يمكن أن يتم حساب متوسط هذه البيانات ثم تحليلها باستخدام اختبارات T الخاصة بطالب. يمكن تقييم قيم P لكل اختبار في الدقيقة مقارنة بالتحكم وبين تركيزات الكواشف. وتوفر تقييمات ANOVA باستخدام مجموعات البيانات المستمدة من تركيزات تجريبية مختلفة طريقة أخرى للتحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وينبغي أن يكتمل إعداد وإعداد المختبرات لمساحة العمل لتشغيل مقايسة pLmV قبل بدء التجريب. وهذا يشمل إعداد حاوية التعود، شطف الحاوية إذا لزم الأمر (لتجارب الانسحاب)، طبق بيتري على ورق الشبكة مغلفة، ووضع الكاميرا بشكل صحيح (الشكل 1). وبمجرد أخذ جميع مقاطع الفيديو، يُنصح باستخدام ورقة بيانات مشتركة لتوحيد جمع البيانات وعرضها بين المحققين(الشكل 2 والملحق الشكل 2).

وينبغي أن تسمح الكاميرا التي أنشئت لعرض واضح من ورقة الشبكة والشبكة للسماح بإجراء تقييم دقيق للتقدم المحرز في الحيوان لمدة التجربة (الشكل 3A والشكل 3A الملحق). وينبغي أن يشمل جمع البيانات عدد خطوط الشبكة المتقاطعة، فضلا عن العدد الإجمالي التراكمي للخطوط المتقاطعة في الدقيقة الواحدة من التجربة(الشكل 3B). أثناء تحليل pLmV ، يكون لدى المُنَقيّمين سرعة مستمرة ، حركة أفقية موجهة إلى الأمام ، مع منعطفات دورية ، ولا تتوقف. عند البدء، يجب أن يسجل أول مربع الشبكة الكاملة عبرت كواحد، وليس السطر الأول كما هو محدد في الفيديو المثال. من المهم تسجيل وقت بدء الحركة الاتجاهية بعد أن يكون الـ planarian خاليًا من فرشاة الطلاء المستخدمة لنقله إلى طبق pLmV ، ثم متابعة كل دقيقة بعد ذلك. إذا كان planarian هو جزء من الطريق من خلال مربع في الوقت المحدد، خط الشبكة القادمة عبرت بعد إعادة تشغيل الفيديو يجب أن تحسب كمربع كامل.  عندما يتحرك الحيوان حول حافة الطبق ، راجع الخطوط لأنها تمتد من الطبق لتحديد مسافة 0.5 سم. عندما تواجه الديدان زاوية مربع، راجع الخط الثاني عبرت ليسجل خط شبكة واحدة. التركيز دائما على الرأس لجعل هذه القرارات. إذا كان بلانكاري يبدأ لتغطية منطقة ضيقة، ينبغي للمجرب مرة أخرى اتباع رأس الدودة لمراقبة المسافة من مربع شبكة كاملة. مثال على هذا السلوك هو المدرجة في الفيديو التكميلية(الشكل 3A الملحق).

لتوحيد النتائج من كل محاكمة، وينبغي حساب pLmV يعمل ورسم عدد من صناديق عبرت نسبة إلى التقدم المحرز في دودة السيطرة مطابقة(الشكل 3B). وينبغي تدريب كل مستخدم على أداء خطوط الشبكة المقايسة والعد قبل بدء الاختبارات باستخدام الكواشف ذات الأهمية. كمؤشر، باستخدام مجموعة تجريبية، planarians في مياه الينابيع عادة ما تغطي حوالي 24 صناديق في 3 دقائق (الشكل 4A؛ بيانات من 4 مستخدمين، في المتوسط 24.8 ± 4.8). وينبغي فحص مجموعة من تركيزات الكاشفات الاختبارية لتحديد نوع التحليل السلوكي الذي سيتم استخدامه لكل منها. لتحليل pLmV، يجب على الباحثين تحديد ما إذا كانت الحيوانات تعرض الحركة عند التعرض لها (الشكل 4B). قد تكون الأنواع الأخرى من التحليلات السلوكية أكثر فعالية لأنواع مختلفة من السلوكيات (انظر المناقشة). بالنسبة لمراقبة مياه الينابيع، سوف تظهر البيانات المنشطة عددا متزايدا من خطوط الشبكة التي عبرت أثناء تحرك الحيوان من خلال حاوية pLmV مع التركيز المطلوب من كاشف الاختبار في مياه الينابيع، بعد أن تعود في نفس تركيز كاشف الاختبار. وعلى النقيض من ذلك، فإن بيانات الانسحاب سوف تظهر عدداً متناقصاً من خطوط الشبكة المتقاطعة، نسبة إلى التحكم في مياه الينابيع، عندما يتحرك المُنطَر عبر حاوية pLmV التي تحتوي على مياه الينابيع وحدها، بعد أن تعود في التركيز المطلوب للمشفّر الممزوج في مياه الينابيع(الشكل 4C و4D). وتجدر الإشارة إلى أن بيانات السحب الـغير ظـرـيـة يمكن أن تؤدي إلى عدد أقل من عدد الشبكات في الضوابط، كما لوحظ في بيانات السحب المستحثة بالمخدرات من قِبل مجموعات أخرى2،6.

وسوف ينتقل المتحكمون في مياه الينابيع عبر خطوط الشبكة طوال مدة التجربة. ومع ذلك، من الممكن أن يتوقف المختبرون عن عبور خطوط الشبكة أثناء الفحص. إذا حدث ذلك، يجب تمييز هذه البيانات بشكل منفصل عن البيانات المتعلقة بالفيروسات المتنقلة التي تحافظ على تقدمها عبر خطوط الشبكة. وتوثيق هذه البيانات كنسبة مئوية من العدد الإجمالي للحيوانات المعرضة لهذا التركيز الخاص بالمعاشف هو وسيلة فعالة لتوضيح التواتر النسبي لهذه النتائج(الشكل 5A-C،الشكل 5A الملحق، الشكل 5 باء الملحق). يجب تضمين السلوكيات التي لا تمنع الـ planarians من عبور خطوط الشبكة في تحليل pLmV ، حتى لو كانت هذه الحركات تعوق التقدم المطرد للحيوانات.

Figure 1
الشكل 1: إعداد ممثل لمحسب pLmV.
وينبغي أن تكون مساحة المختبر إعداد قبل بدء الفحص. يظهر هو الإعداد نموذجي مع طبق بيتري 10 سم وضعت على ورق الشبكة مغلفة 0.5 سم. يتم وضع كاميرا مستند بحيث يمكن تسجيل رؤية واضحة لطبق بيتري 10 سم على جهاز كمبيوتر مرتبط. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي كاميرا لتسجيل تقدم planarians خلال التجربة بما في ذلك كاميرا الهاتف الخليوي المتمركزة فوق طبق بيتري باستخدام موقف حلقة. في الخلفية هو طبق بيتري 5 سم لشطف الديدان لتجارب الانسحاب، فضلا عن حاويات بيضاء صغيرة تستخدم لتعود على planarians. أيضا، في الخلفية هي وصفت، مكرسة فرش الطلاء المائية المستديرة، والماصات، وأطباق بيتري لكل تركيز المنتج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: pLmV ورقة البيانات.
إن ورقة البيانات المعدة لتسجيل عدد خطوط الشبكة المتقاطعة والنسبة المقابلة لبيانات التحكم، بالإضافة إلى وسيلة لحصة أي سلوك مفيد لأغراض جمع البيانات. انظر الشكل 2 الملحق للحصول على نسخة قابلة للتنزيل من ملف PDF لهذا الشكل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تجربة pLmV التمثيلية وورقة البيانات.
(أ)يجب وضع كاميرا فوق طبق بيتري 10 سم المستخدم في فحص pLmV بحيث يكون الـ planarian والشبكة الكاملة 0.5 سم تحت الطبق مرئية بوضوح. يجب تسجيل تشغيل pLmV الكامل (الشكل 3A الملحق)، و (B) عدد خطوط الشبكة عبرت كل دقيقة وضعت في جدول بيانات معد. وينبغي أن يتم إحصاء خطوط الشبكة الكلية المتراكمة التي تم عبورها، ومن ثم ينبغي تحويلها إلى عدد الخطوط المتراكمة التي تم عبورها بالنسبة إلى دودة التحكم في مياه الينابيع المقابلة. تطابق البيانات الواردة في الجدول الشكلي(B)الأرقام باستخدام الفيديو التكميلي(الشكل 3A الملحق). لا يتم عرض عدد عناصر التحكم المقابلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: رسوم بيانية تمثيلية لبيانات المنشطات والسحب.
وينبغي تدريب الباحثين على استخدام وتسجيل خطوط شبكة اختبار pLmV باستخدام مياه الينابيع وحدها قبل التجريب. عادة، يسافر المُخطّين حول 25 خط شبكة في 3 دقائق(أ)تظهر البيانات من أربعة مستخدمين، لكل منها 10 ديدان لمراقبة مياه الينابيع.  لتقدير تأثير الكاشف على الحركة غير المُعدية ، يتم مسح سلسلة من التركيزات باستخدام مقايسة pLmV ويتم فحص العدد الإجمالي لخطوط الشبكة المتقاطعة بالنسبة إلى عدد التحكم المقابل في 3 دقائق. (B) يتم تمثيل بيانات التحكم بواسطة الشريط الأبيض. يتم تمثيل بيانات الاختبار بواسطة الأشرطة السوداء، مع التركيزات المستخدمة في mM. نسبة إلى بيانات التحكم يجب أن يتم رسمها لتمثيل أفضل البيانات التي تم جمعها. (C)البيانات المنشطة التي يمثلها الخط الأزرق / الماس، وسوف تظهر ارتفاعا في خطوط الشبكة عبرت، مقابل (D) بيانات السحب، ممثلة أيضا من قبل الخط الأزرق / الماس، وسوف تظهر انحدارا تنازليا من قيمة بداية أولية، نسبة إلى بيانات التحكم، كما هو مبين في الخط الأحمر / المربعات في كل من (C و D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: ملاحظة وتوثيق البيانات السلوكية.
وينبغي أن يتم إحصاء البيناريين في مقايسة pLmV التي لا تحافظ على حركة الاتجاه أثناء التجربة، ولكن وقف مع السلوكيات المميزة ولم تعد تتحرك عبر الشبكات. قد تتضمن السلوكيات النموذجية شاشات العرض على أنها "تجول"(A و Figure 5A Supplement) ، و "stop" (B و Figure 5B Supplement). يجب تقديم هذه المعطيات السلوكية لتوثيق وتيرة هذه السلوكيات مقارنة بجميع الحيوانات المعرضة لتركيز هذا المنتج (C). تظهر هي عينات البيانات التي توثق النسب المئوية للحيوانات التحكم في مياه الينابيع (Ci)، والحيوانات المعرضة للمنبه (Cii)، وجود تجول (الأزرق)، وقف (أحمر) أو لا (الأخضر) السلوك. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوصف مقايسة حركية حركية مباشرة ويمكن الوصول إليها لتحديد آثار المنشطات والانسحاب من المنتجات الطبيعية. كنموذج سلوكي من الضروري أن يكون لديك بروتوكولات صارمة لتسجيل الحركة وتعريفات واضحة لأي سلوك لتوحيد الملاحظات بين المجربين المختلفين. وتقدم الأفكار المقدمة دليلا على كيفية تحقيق ذلك. وينبغي لكل مختبر يستخدم هذا البروتوكول أن يكيف المعلومات المقدمة ليتناسب مع آثار المنتج المعين الذي يجري اختباره. من المستحسن إعداد مساحة العمل بعناية لضمان إمكانية إجراء الاختبارات في ظروف متسقة من قبل كل محقق يشارك في الدراسة (الشكل 1). ويمكن تجميع أوراق تسجيل موحدة للمساعدة في حفظ السجلات الدقيقة وجمع البيانات عن الحركة والسلوكيات(الشكل 2 والشكل 3B).

وينبغي إجراء اختبارات حركية في أوقات مختلفة من اليوم، وذلك باستخدام دفعات مختلفة من الـ planarians إن أمكن، وذلك لمراعاة اختلاف الأنشطة الإيقاعية المتأصلة. في حين لم يتم إجراء هذه التحليلات ، يقترح أن يقوم المحققون بمراقبة كيفية تأثير الإيقاع الإيقاعي على الحركة من خلال الحفاظ على الألوان باستخدام دورة ضوئية / داكنة قياسية (على سبيل المثال ، 12/12) ، وعند إجراء فحص pLmV ، استخدم ظروف الإضاءة القياسية وتشغيل الاختبارات في نفس الوقت من اليوم32و33و34. يجب على الباحثين ممارسة آليات فحص pLmV وتعلم عد خطوط الشبكة لتوحيد كل من التعامل مع الـ planarians وتقييم الحركة الـ planarian(الشكل 3). وينبغي أن يتم ذلك باستخدام ضوابط مياه الينابيع غير المغشوشة. عادة، بعد 10-20 مثل هذه الممارسة يعمل، والبيانات تصبح قياسية تماما لجميع أعضاء المختبر. يجب اختيار عدد بعد تعيين pLmV الوقت لمقارنة التقدم المحرز في تعلم المقايسة. عادة ما يلاحظ المحققون ما يقرب من 24 خط شبكة عبرتها 3 دقائق في مقايسة pLmV في مياه الينابيع بعد 2 دقيقة من التعود في مياه الينابيع(الشكل 4A؛ بيانات تمثيلية لأربعة محققين مع 10 ضوابط عشوائية لمياه الينابيع لكل منهما ؛ 24.8 ± 4.8 خطوط الشبكة). ويمكن أن يؤدي وجود محققين مدربين اثنين أو ثلاثة من المحققين الذين يجرون كل مجموعة من الاختبارات إلى زيادة تحسين موثوقية النتائج لأن أي آثار خاصة بالمستخدمين على الطريقة والعد يمكن أن تؤخذ في الاعتبار في تحليل الأخطاء. وبهذه الطريقة، يمكن تبديل الاختبارات والعد بين المحققين بحيث يمكن إجراء العد "أعمى" للظروف التجريبية. لتقليل فرصة التحيز، يمكن لمختلف الأفراد إجراء اختبارات إحصائية على بيانات العد وإجراء التحليلات اللاحقة. وفيما يتعلق بوجود المنتج الذي يجري اختباره، ينبغي تجنب الاختلافات البيئية في نوعية المياه مثل درجة الحرارة ودرجة الحرارة. لأن الـ planarians حساسون للضوء، يجب أن يضمن إعداد التجربة أن إضاءة مساحة العمل متساوية. وأخيرا، لأن لا planarians يمكن أن تظهر السلوكيات المستفادة، كل دودة، بما في ذلك الضوابط، ينبغي أن تستخدم مرة واحدة فقط26،27.

من المفيد أن يكون لديك قائمة مرجعية تجريبية في المختبر إذا كان العديد من المجربين يعملون مع الفحص ، خاصة في مختبر أبحاث البكالوريوس ، لتجنب المزالق الشائعة التي قد تحدث عند تشغيل اختبار pLmV ، والتي من شأنها أن تؤثر على القيمة الإحصائية للنتائج. يجب أن تكون جميع الحلول في درجة حرارة الغرفة لأن الحركة غير المُهترَفة يتم تقليلها في درجات حرارة أقل. وينبغي الحرص على ضمان أن تكون العينات جائعة قبل 5-10 أيام من استخدامها، وأن كل عينة تتكون بالكامل، مع رأس وذيل مصطبغين تماما. ويقترح أيضا أن مخصص فرش الطلاء المسطحة أو المستديرة المائية (رقم 3-6)، والعادة الحاويات، وأطباق بيتري أن تستخدم لكل تركيز التجريبية لجعل سير العمل أكثر سلاسة للمجرب. وينبغي أن يمارس المحققون على نطاق واسع تقنية نقل اللوحات المائية باستخدام فرش الطلاء الصغيرة المسطحة أو المستديرة لضمان نقل الديدان بكفاءة بين الحاويات دون التسبب في إصابة الحيوانات أو ضائقة عليها (انظر المناقشة أعلاه؛ الشكل 4أ). استخدام هذه الفرش يقلل من نقل السوائل بين الحاويات ويقلل من الضغط المحتمل على الـ planarians. ومع ذلك ، يمكن أن تتضرر من قبل شعيرات الألياف إذا انتشرت أو تم تشغيلها عند الاتصال بالحيوان.

لأن تحليل pLmV يعتمد على البيانات السلوكية، فمن الضروري استخدام مجموعة بيانات كبيرة بما فيه الكفاية لضمان بيانات قوية على الرغم من تقلب استجابة الدودة إلى الدودة الفطرية. وعلى هذا النحو، فإن معظم المختبرات تستخدم ما لا يقل عن تسعة إلى اثني عشر من المصانع لاختبار كل تركيز من المنتج الذي يجري فحصه، لا سيما لأن المنتجات الطبيعية قد لا يكون لها تأثير ملحوظ مثل المستحضرات الصيدلانية القياسية1،,2،3،,4،,5،,,,6،,13،,14،,15،,,35،,36.1316 ويحسب عدد خطوط الشبكة التي يتم عبورها كل دقيقة بالنسبة لبيانات التحكم في مياه الينابيع لكل يوم ووقت اختبار. يتم تحديد متوسط هذه البيانات لكل تركيز اختبار لكل دقيقة ومقارنتها ببيانات التحكم، وكذلك مع التركيزات الأخرى المتطابقة زمنيًا باستخدام اختبارات T للطالب و ANOVA.

ويهدف فحص pLmV لدراسات الكواشف التي تؤثر على حركة من ألواح طول الوقت. يمكن إجراء دراسات مفصلة للحركات البهلاً باستخدام عدد من التقييمات الأخرى الموصوفة في المؤلفات4,35,36,37,38. لذلك ، من الحكمة إجراء سلسلة من تجارب التعود على تدوين كيفية تفاعل الموبايل مع كاشف الاختبار باستخدام مجموعة من التركيزات ومقارنة أي آثار مع سلوك الديدان في مياه الينابيع قبل الشروع في الاختبارات السلوكية. وبهذه الطريقة، يمكن اختيار الاختبار السلوكي المناسب لدراسة السلوكيات الفردية التي يسببها الكاشف على المُنطَة. يمكن وضعها في اِلَنَتِهِا في تركيزات مختلفة من الكاشف لمدة 5-10 دقيقة لتحديد ما إذا كان التركيز يسمح لهم بالحفاظ على سلوكهم السباحة النموذجي. السلوكيات التي لا تسمح بالحركية، مثل تلك التي تؤدي إلى سلوك من النوع C، أو سلوك متشنج أو يشبه النوبات، كانت محور الدراسات باستخدام أنواع منفصلة من التحليلات السلوكية التي يمكن تطبيقها على هذه الطريقة4,39,40. يمكن إجراء تحليلات pLmV باستخدام مجموعة من التركيزات بعد أوقات التعود القصيرة وعدد خطوط الشبكة الإجمالية التي تم عبورها عند 3 دقائق قياسًا بعناصر التحكم في مياه الينابيع قبل تحفيز الدورة الزمنية وتحليلات الانسحاب (الشكل 4B)1,2,3,4,5. يتم تشجيع المحققين على أخذ عينات أخرى من الأوقات، مثل 15 و 30 و 60 دقيقة، لمعرفة ما إذا كانت ديناميكيات التحفيز تتغير مع وقت التعرض1. كما تم الإبلاغ، في ربيع السيطرة على المياه الديدان الحفاظ على حركة أفقية ثابتة، إلى الأمام إلى الأمام لوقت 10 دقيقة1,4. وعلى النقيض من ذلك، قد تتوقف الديدان المعالجة من المنتجات وتوقف حركتها الاتجاهية أثناء الفحص ولم تعد خطوط الشبكة المتقاطعة. يمكن للمحقق أن يصدر حكماً سواء كان يحد من طول تشغيل pLmV التجريبي أو يستمد وسيلة لتقييم هذه السلوكيات كما هو موضح. ومع ذلك، من المهم تقييم وتيرة هذه السلوكيات، لأنها توفر بيانات إضافية تؤثر على الحركة. وتناقش البيانات الحركة والحركة بشكل منفصل في الميدان لأن الجمع بين المعلومات يربك تقييم هذه البيانات4,35,36,37,38. على سبيل المثال، لوحظ سلوكان عندما توقفت الديدان ولم تعد تعبر خطوط الشبكة أثناء الفحص. ويشار إلى هذه الحركات باسم "تجول" (الشكل 5 ألف و ملحق الشكل 5A)، و "إيقاف" (الشكل 5 ب و ملحق الشكل 5B). يتم توثيق تواتر هذه السلوكيات كنسب مئوية لجميع الحيوانات المعرضة لتركيز منتج معين مع بيانات التحكم (الشكل 5C). الأهم من ذلك ، يجب أن تكون السلوكيات العشوائية التي لا تمنع من عبور خطوط الشبكة من عبور خطوط الشبكة في تحليل pLmV ، حتى لو كانت هذه الحركات تعوق التقدم المطرد للحيوانات (الشكل 4B، 3 mM و 10 أشرطة mM). كما ذكرنا، وصف المحققون عدداً من الفئات السلوكية التي تقع خارج نطاق هذه المناقشة حول معدل pLmV لبروتوكول الحركة4,35,36,37,38.

يعتمد فحص pLmV على قابلية ذوبان الماء للمنتج قيد التحقيق. ومع ذلك، فإن العديد من هذه المواد ليست قابلة للذوبان تماما في الماء، وعلى هذا النحو، يمكن اختبار الأجزاء القابلة للذوبان في الماء فقط من قبل هذا الفحص في حين يجب تصفية الباقي من الحل كما تم القيام به في العمل السابق1. إذا تم تشغيل مقايسات pLmV باستخدام الكواشف solubilized باستخدام المذيبات غير الماء، وهذه تتطلب التحكم ما يعادل حجم بالإضافة إلى التحكم في مياه الينابيع. وفي حين أن هذه الطريقة لم تستخدم مع هذه المواد، فمن المرجح أن تعامل هذه الضوابط على ناقلات الأمراض على أنها اختبار، كما أن الحركة المسجلة بالنسبة للضوابط هي التي تُسجل بالنسبة لأي مادة اختبار أخرى. وهناك وسيلة أخرى ممكنة لاختبار المواد غير القابلة للذوبان هي إطعامها إلى اللاميناريين عن طريق خلطها في المواد الهلامية الغذائية. وتستخدم هذه التقنية لإدخال الرنا إلى الاريابين في الجينات ضربة قاضية / RNAi التجارب41. تغذية المنتجات البيولوجية planarians وsrna، ومع ذلك، يقدم مضاعفات لهذا الفحص في أن planarians لن تكون جائعة ولا يمكن نقلها إلى حاوية فحص الحركة في غضون وقت موحد يضمن التعرض أو تناول على قدم المساواة من المنتج قيد التحقيق من قبل الحيوانات التجريبية قبل الاختبار.

حالما يتم تأسيس ديناميات المنشطات والانسحاب باستخدام اختبار pLmV، يمكن أن تنطوي على مزيد من التجارب comodulators، وإدخال سيرنا، فضلا عن المعدلات أو الأدوية المسار البيولوجي لاختبار لزيادة أو تثبيط آثار حركية لوحظ بالمقارنة مع النتائج الأولية التي تم جمعها عند عدم استخدام هذه المعدلات الحيوية1،3. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي التنظيم الهادني للتعبير عن جين أو إضافة مثبطات للمسار إلى انخفاض معدل الحركة، في حين أن الآخرين قد يغيرون ديناميات الانسحاب. من خلال مراقبة نتائج pLmV المتغيرة ، يمكن لهذه التجارب الإضافية توفير نظرة ثاقبة في علم وظائف الأعضاء الكامنة المتضررة من منتج طبيعي أو غيرها من اختبار الكاشف5،42،43،44.

الإجراء الموصوف قابل لأي مختبر مهتم بتحديد آثار المنشطات والسحب لمجموعة متنوعة من المُودَّات الحيوية، بما في ذلك العديد من المنتجات الطبيعية. مزايا تطبيق تحليل pLmV بليناري تشمل كيف غير مكلفة وسهلة للحفاظ على هذه الحيوانات، وأنها يمكن أن تكون أيضا مواضيع لالتشخيصات الأخرى القائمة على أساس االماهن لتوفير فهم واسع من الآثار الفسيولوجية للمنتج قيد التحقيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يرغب المؤلفان في الإشادة بمكتب التقدم المؤسسي، ومؤسسة كلية موريسفل للحصول على منحة منشور لدعم هذا العمل، وكذلك برنامج دخول جامعة SUNY Morrisville للعلوم والتكنولوجيا (CSTEP) على مساعدتهم المستمرة ودعمهم للبحوث الجامعية في SUNY Morrisville. ونود أيضا أن نشكر صوفيا هوتشنز على تعليقات مفيدة على الأسلوب الموصوف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottled Water - 1 Gal. Poland Spring N/A Spring water for planarian culture and to prepare solutions
Brown Planaria (Dugesia tigrina) Carolina Biological Supply Company 132954 Brown planaria living (other species are acceptable)
Flat Paintbrush Royal Crafter's Choice 9159 Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers
Glass Petri Dish - 10 cm Kimax N/A 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay
Glass Petri Dish - 5 cm Kimax N/A 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation
Grid Paper Any N/A Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay
iPEVO Visualizer (software) iPEVO https://www.ipevo.com/software/visualizer Document camera software for video capture and recording
Metalware Set with Support Stand and Retort Ring Any N/A Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used
Organic Egg Any N/A Organic egg or beef liver for feeding planarains
Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL Beckman N/A Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation
Round Storage Container - 10 cm Ziploc N/A 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer
Round Water Paint Brush LOEW-Cornell N/A Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft
Transfer Pipette Any N/A Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians
USB Document Camera iPEVO CDVU-06IP Document camera (or other camera or cell phone camera)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
  2. Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
  3. Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
  4. Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
  5. Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
  6. Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. 0, 8-13 (2013).
  7. Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
  8. Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
  9. Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
  10. Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
  11. Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
  12. Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
  13. Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
  14. Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
  15. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
  16. Raffa, R. B., Rawls, S. M. A model for drug action and abuse. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2008).
  17. Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
  18. Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
  19. Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
  20. Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
  21. Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
  22. Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
  23. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
  24. Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
  25. de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
  26. Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
  27. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, Pt 20 3799-3810 (2013).
  28. Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
  29. Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
  30. Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
  31. Animal Diversity. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Dugesia_tigrina/ (2019).
  32. Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
  33. Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
  34. Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
  35. Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
  36. Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
  37. Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
  38. Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
  39. Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
  40. Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
  41. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
  42. Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
  43. Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
  44. Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 159، بلاناري، pLmV، الحركة، السلوك، المنشطات، الانسحاب
مقايسة حركية بلاناية لقياس خصائص المنتجات الطبيعية ذات الخواص الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voura, E. B., Pulquerio, C. H.,… More

Voura, E. B., Pulquerio, C. H., Fong, R. A. M. V., Imani, Z., Rojas, P. J., Pratt, A. M., Shantel, N. M., Livengood, E. J. A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products. J. Vis. Exp. (159), e61070, doi:10.3791/61070 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter