Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En planarisk motilitetsanalyse for å måle de biomodulerende egenskapene til naturlige produkter

Published: May 30, 2020 doi: 10.3791/61070
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State University of New York (SUNY) at Morrisville

Summary

Planarian motilitet brukes til å måle stimulerende og abstinensegenskaper av naturlige produkter sammenlignet med bevegelsen av dyrene i kildevann alene.

Abstract

En enkel, kontrollerbar måte å bruke ikke-parasittiske planarian, Dugesia tigrina, en frittlevende akvatisk flatworm, å studere stimulerende og abstinens egenskaper av naturlige produkter er beskrevet. Eksperimentelle analyser som drar nytte av unike aspekter ved planarian fysiologi har blitt brukt på studier på sårheling, regenerering og tumorigenesis. I tillegg, fordi planarianere viser følsomhet for en rekke miljøstimuli og er i stand til å lære og utvikle bevisste svar, kan de brukes i atferdsstudier som undersøker læring og minne. Planarianere har en grunnleggende bilateral symmetri og et sentralnervesystem som bruker nevrotransmittersystemer mottagelige for studier som undersøker effekten av nevromuskulære biomodulatorer. Derfor er eksperimentelle systemer overvåking planarian bevegelse og motilitet utviklet for å undersøke stoffavhengighet og tilbaketrekking. Fordi planarisk motilitet gir potensialet for et følsomt, lett standardisert motilitetsanalysesystem for å overvåke effekten av stimuli, ble den planariske lokomotoriske hastighetstesten (pLmV) tilpasset for å overvåke både stimulering og abstinensatferd av planarianere gjennom fastsettelse av antall rutenettlinjer krysset av dyrene med tiden. Her er teknikken og dens anvendelse demonstrert og forklart.

Introduction

Protokollen som beskrives bruker planær motilitet for å gi et middel til å vurdere de biomodulerende effektene av naturlige stoffer. Det ble spesielt tilpasset for å avgjøre om disse stoffene fungerer som sentralstimulerende midler, og hvis de da var forbundet med en målbar uttaksatferd1. Denne analysen, kjent som den planariske lokomotoriske hastighetstesten (pLmV), ble først brukt til å teste kjente farmakologiskemidler 2,3. Anvendelsen av denne planære motilitetsbaserte analysen har siden vokst i popularitet og har blitt vedtatt av forskjellige laboratorier som er interessert i andre stoffer enn naturligeprodukter 4,5. For denne analysen er en planarian plassert i en petriskål som inneholder kildevann eller kildevann som inneholder en oppløst biomodulator. Fordi selve fatet er plassert på grafpapir, kan antall rutenettlinjer krysset av dyret med tiden når den beveger seg om beholderen, brukes til å bestemme bevegelseshastigheten i hver tilstand. Den lyse/mørke testen, ellers referert til som den bedede stedspreferansetesten (CPP), er en annen variasjon på temaet overvåking av planær motilitet, og vurderer hvor raskt dyrene reagerer og migrerer til et mørkt miljø6,7. Videosporing av planære bevegelser kan også analyseres ved hjelp av dataprogrammer og senter for massesporing (COM)sporing 8,,9,,10,,11.

Å bruke planarian som dyremodell for slike studier gir flere fordeler fremfor andre dyr ved at eksperimentereren enkelt kan kontrollere analysemiljøet. Spesielt, sulte planarians før eksperimentering kan hindre deres eksponering for andre ernæringsmessige eller farmakologiske midler som ellers kan forvirre resultatene, og den spesifikke biomodulatoren under undersøkelse kan innføres til planarianerne bare ved å legge den direkte til kulturvannet, og dermed standardisere eksponering. Siden planarianere har et nervesystem og nevrotransmittere som minner om "høyere orden" dyr, fysiologi og eksperimentelle reaksjoner av disse dyrene til nevromuskulære stimuli anses biologisk relevant for andreorganismer 12,13,14,15,16. Også, fordi planarianere er relativt billig og grei å vedlikeholde i laboratoriet, tilbyr de en tilgjengelig biologisk modell for mange etterforskere.

Som et eksperimentelt dyr er planarianere egnet til et bredt spekter av studier. For eksempel bruker vår gruppe, samt andre forskere planarianere til å studere tumorigenesis17,18,19. Planarians viser også en rekke responsatferd til kjemiske, termiske, gravitasjons-, elektriske, foto- og magnetiske stimuli som har dannet grunnlaget for andre analysesystemer. Noen av disse effektene har blitt brukt til å studere læring og minne hos disse dyrene20,21,22,23,24,25,26,27. Den primære bruken av den planære modellen i litteraturen i dag fokuserer på aktiviteten til planære pluripotente stamceller, kalt neoblaster, og deres rolle iregenerering 28,29,30. Ved å vedta modellen som er beskrevet her, kan det derfor muliggjøre videre studier ved hjelp av andre planære analyser for å gi en bredere forståelse av hvordan naturlige produkter og andre biomodulatorer påvirker organismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Planarisk husdyrhold

  1. Bruk planarianere kjøpt fra et biologisk forsyningsselskap eller villfanget om nødvendig. Planarianerne som brukes i denne protokollen er Dugesia tigrina, som oppført i forsyningslisten. Denne arten er også referert til som Girardia tigrina31. Andre akvatiske planære arter er ogsåakseptable 2,3.
    MERK: Protokollen som er beskrevet er rettet mot dyr kjøpt fra et biologisk forsyningsselskap. Dette analysesystemet har ikke blitt testet med villfangede planarianere. Men hvis villfanget planarianere brukes, anbefales det at de blir habituated til vannet som brukes i forsøkene, samt laboratoriemiljøet i minst 1 uke før bruk.
  2. Ved ankomst, overføre planarians til plast mat oppbevaringsbeholdere som inneholder rent kildevann og holde lokkene på gløtt.
  3. Vedlikehold planarianere i et mørkt miljø.
  4. Mate ny leverte planarians etter 24-36 h i sitt nye miljø.
  5. La planarianere akklimatisere seg til laboratoriet minst 1 uke før eksperimentering.
  6. Feed planarians på en vanlig to ganger i uken tidsplan.
    1. La planarianere mate ad bibliotekum på hakkede økologiskkokte egg eller blandet økologisk biff lever i 1-2 timer.
    2. Plasser matet planarians i en ren beholder etter fôring.
      1. Fjern det skitne vannet fra planarianerne.
      2. Bruk en liten flat akvarellbørste (nummer 3–6) til å overføre matrester og slim som følge av beholderen fra rundt planarianere til et papirhåndkle.
      3. Med friskt kildevann og mild virvlende eller agitasjon, løsne planarians og hell dem i en ren beholder.
      4. Eventuelle planarianere som er igjen, kan overføres ved hjelp av en rund akvarellbørste (nummer 3–6) eller overføre pipette med bred boring.
      5. Dekanter overføringsvannet.
      6. Dekk planarianerne med rent kildevann.
      7. Etter 24 timer fjerner du planarianerne fra utvist matavfall ved å overføre dem til en ren beholder som beskrevet ovenfor (trinn 1.6.2.1–1.6.2.6).
  7. For å rengjøre beholdere og redskaper som brukes til planarisk husdyrhold, ikke bruk såpe eller vaskemiddel. Rengjør disse elementene ved å skylle dem godt med rent vann (vann fra springen er akseptabelt) og tørk dem med en ren klut eller papirhåndkle.

2. Utarbeidelse av planarianere for eksperimenter

  1. La nylig leverte planarianere akklimatisere seg til miljøet minst 1 uke før eksperimentering.
  2. Sulte planarianere i 5-10 dager før eksperimentering.
  3. Endre kulturvannet minst 1x i sultperioden.

3. Planarian lokomotor hastighet (pLmV) test: Sentralstimulerende atferd

  1. Før eksperimentering, sørg for at sultne planarianere er fullt dannet, med et komplett og pigmentert hode og hale.
  2. Forbered et glass eller plast 10 cm petriskål og en boligbeholder for pLmV-testen før eksperimentet startes.
    1. Plasser en ren petriskål med 10 cm diameter som skal brukes til pLmV-testen på forhåndslaminert rutenettpapir (med 0,5 cm firkanter).
    2. Tilsett 20 ml uforfalsket kildevann for kontroller, eller kildevann som inneholder riktig konsentrasjon av det naturlige produktet som testes, til petriskålen med 10 cm diameter som skal brukes til pLmV-testen.
    3. Plasser et kamera (f.eks. mobiltelefon eller høyoppløselig kamera) over den tilberedte petriskålen med 10 cm diameter for å registrere planarisk motilitet over rutenettpapiret under eksperimentet. Et ringestativ er en praktisk måte å plassere kameraet på en avstand som kan ta opp hele visningen av 10 cm petriskål og rutenettlinjer.
    4. Forbered en boligbeholder med 5–10 ml uforfalsket kildevann (kontroller), eller kildevann som inneholder riktig konsentrasjon av det naturlige produktet som testes. En beholder som ligner på et scintillation hetteglass eller liten 5 cm petriskål er egnet.
  3. Bruk en liten, ren, flat eller rund akvarell pensel til å forsiktig overføre en planarian fra lagerbeholderen med kildevann til beboelsesbeholderen med 5–10 ml uforfalsket kildevann eller kildevann som inneholder det naturlige produktet som testes.
    MERK: Når du manipulerer planarianere for pLmV-analysen, bruk en liten, ren, flat eller rund akvarellbørste (nummer 3–6). Når du flytter planarians, bør børsten plasseres under dyret for å løfte den forsiktig. For å sikre at planarianere ikke blir skadet når du bruker børsten, bør børstens børste børste ikke spilles ut under dyret. Spredning ut av bust kan skade planarian hvis den er fanget mellom fibrene i børsten.
    MERK: En bred overføringspipette kan også brukes til å overføre planarianen til en ren og tørr boligbeholder.
    1. Hvis du bruker pipetten, fjern overflødig vann flyttet med planarian fra habituation beholderen ved hjelp av overføring pipette.
    2. Tilsett syteoppløsningen (f.eks. kildevann for kontroller eller kildevann som inneholder konsentrasjonen av naturlig produkt som testes) til habituationbeholderen som inneholder planarian.
  4. Habituation perioder vil avhenge av stimulering dynamikk vurdert for det naturlige produktet som testes. En habituation tid på 2 min viste seg akseptabelt å oppdage stimulering i dettearbeidet 1.
  5. Etter 2 min habituation perioden bruke en akvarell pensel for å forsiktig overføre planarian til midten av forberedt 10 cm Petri parabolen for pLmV stimulering eksperiment.
  6. Start kameraet for å registrere bevegelsen av planarian. Ta opp 10–11 min med video.
  7. Forbered habituation container og 10 cm Petri skål for pLmV eksperimentet med friske løsninger for hver planarian.
  8. Bruk dedikerte pipetter, retter, beholdere og pensler for hver eksperimentelle konsentrasjon av det naturlige produktet som testes for å unngå utilsiktet å utsette planarianere for feil løsning under eksperimentering.
  9. Fordi planarianere viser lært atferd, bør hver planarian (kontroll eller test) bare brukes engang 21,,22.

4. Planarian locomotor hastighet (pLmV) test: Uttak atferd

  1. Før eksperimentering, sørg for at sultne planarianere er fullt dannet, med et komplett og pigmentert hode og hale.
  2. Forbered en 10 cm petriskål (glass eller plast) for pLmV-eksperimentet, en 5 cm petriskål (glass eller plast) for skylling av den planariske etter habituation, og en habituation beholder før du starter eksperimentet.
    1. Plasser en ren petriskål med 10 cm diameter som skal brukes til pLmV-eksperimentet på forhåndslaminert rutenettpapir med 0,5 cm firkanter).
    2. Tilsett 20 ml uforfalsket kildevann til petriskålen med 10 cm diameter som skal brukes til pLmV-eksperimentet.
    3. Plasser et kamera over den tilberedte petriskålen med 10 cm diameter som i trinn 3.2.3 for å registrere planær motilitet over rutenettpapiret under eksperimentet.
    4. Forbered den planære skyllebeholderen ved å tilsette 5 ml kildevann alene til 5 cm petriskål.
    5. Forbered en boligbeholder med 5–10 ml uforfalsket kildevann (kontroller) eller kildevann som inneholder det naturlige produktet som testes. En beholder som ligner på et scintillation hetteglass eller liten 5 cm petriskål (glass eller plast) er egnet.
  3. Bruk en liten, ren, flat eller rund akvarellbørste til å overføre en planarian fra kildevann til den tilberedte beboelsesbeholderen med 5–10 ml uforfalsket kildevann (kontroller) eller kildevann som inneholder det naturlige produktet som testes. Flytt forsiktig dyret fra lagerbeholderen til boligbeholderen. Sørg for at planarianen ikke er skadet av børsten.
    MERK: Når du manipulerer planarianere for pLmV-analysen, bruk en liten, ren, flat eller rund akvarellbørste (nummer 3–6). Når du flytter planarians, bør børsten plasseres under dyret for å løfte den forsiktig. For å sikre at planarianere ikke blir skadet når du bruker børsten, bør børstens børste børste ikke spilles ut under dyret. Spredning ut av bust kan skade planarian hvis den er fanget mellom fibrene i børsten.
    MERK: En bred overføringspipette kan også brukes til å overføre planarianen til en ren og tørr boligbeholder.
    1. Hvis du bruker pipetten, bør overflødig vann flyttes med planarian fjernes fra boligbeholderen ved hjelp av overføringspipetten.
    2. Tilsett habituation-løsningen nøye (f.eks. uforfalsket kildevann for kontroller eller kildevann som inneholder det naturlige produktet som testes) til beboelsesbeholderen som inneholder planarianen.
  4. Habituation perioder for tilbaketrekking vil avhenge av stimulering dynamikk vurdert for det naturlige produktet blir testet; 2–5 min har vist seg å være tilstrekkelig.
  5. Etter habituation perioden bruke en akvarell pensel å forsiktig overføre planarian til forberedt 5 cm Petriskål som inneholder kildevann for å skylle av ethvert naturlig produkt fra habituation beholderen. Sørg for at planarianen ikke er skadet av børsten.
  6. Overfør umiddelbart planarianen til midten av den tilberedte 10 cm petriskålen som inneholder kildevann for pLmV-uttakseksperimentet. Sørg for at planarianen ikke er skadet av børsten.
  7. Start kameraet for å registrere bevegelsen av planarian. Ta opp 10–11 min med video.
  8. Forbered habituation beholderen, skyllebeholderen og 10 cm Petri skål for pLmV eksperimentet med friske løsninger for hver planarian.
  9. Bruk dedikerte pipetter, retter, beholdere og pensler for hver eksperimentelle konsentrasjon av det naturlige produktet som testes for å unngå utilsiktet å utsette planarianere for feil løsning under eksperimentering.
  10. Fordi planarianere viser lært atferd, bruk hver planarian (kontroll eller test) bare éngang 26,,27.

5. Dataanalyse

  1. Klargjøre en datainnsamlingstabell for å dokumentere virkemåten og motiliteten til planarianere som antall rutenettlinjer som krysses for hvert minutt under pLmV-kjøringen. Tabellen bør tillate at det akkumulerte antall linjer per minutt krysset av planarian å bli dokumentert også. Inkluder linjer for notater og en definisjonstabell for å telle observasjon av atferd i løpet av den eksperimentelle perioden, for eksempel "vandre" og "stopp" (se Diskusjon).
  2. Bruk videoen til å telle antall fullstendige rutenettlinjer som krysses av planarian per minutt i 10 min, og registrere dette tallet i datatabellen. Typisk planær atferd består av kontinuerlig hastighet, fremoverrettet, horisontal bevegelse, med periodiske svinger og uten stopp.
    1. Begynn å tid eksperimentet på det punktet at planarian har flyttet av penselen brukes til å overføre den til 10 cm Petri parabolen. Ta opp denne starttiden.
    2. For å bestemme når dyret krysser en full rutenett firkant, fokuser på hodet og score en linje når hodet krysser en firkant fullt ut.
    3. For å score et fullt rutenett når ormen beveger seg rundt kanten av parabolen, visualiser en avstand på 0, 5 cm ved å referere til linjene når de strekker seg ut fra kantene på parabolen. Hvis planarian krysser hjørnet av en boks, se den andre linjen krysset for å score en rutenettlinje. Igjen, fokuser på hodet for å gjøre disse beslutningene.
    4. Stopp videoen etter hvert minutt for å spille inn dataene.
    5. Når du starter videoen på nytt for å telle neste minutt, hvis hodet på ormen var mellom rutenettlinjer da videoen ble stoppet, ta opp den første linjen krysset som en full boks.
    6. Score antall rutenettlinjer krysset i 10 min.
  3. Hvis dyret slutter å bevege seg under en pLmV-test og ikke lenger krysser rutenettlinjer i løpet av 10 min opptakstid, dokumenterer du oppførselen til planarianen i atferdskartet (f.eks. 'vandre' eller 'stopp'). Dyr som avslutter sitt fremre spor under pLmV-analysen, bør i stedet tas oppmerksom på og dataene presenteres som en frekvens av det totale antallet dyr som er eksponert for den reagenskonsentrasjonen. Kveilet eller konvulsiv atferd (kjent som en C-virkemåte) som forhindrer videre bevegelse i løpet av habituation perioden indikerer at konsentrasjonen av det naturlige produktet ikke er egnet for bruk i en pLmV-analyse fordi pLmV-analysen er motilitetsbasert. C-type atferd kan analyseres ved hjelp av en annen type analyse (se Diskusjon).
  4. Hvis mulig, test flere eksperimentelle konsentrasjoner av det naturlige produktet ved hjelp av minst 9-12 ormer på forskjellige dager og forskjellige tider av dagen hvis du bestemmer den totale effekten av reagensen på planarian fysiologi. Men hvis forskere forsøker å redusere døgnrytmeindusert variasjon, kan eksperimenter utføres med konstant belysning på et bestemt tidspunkt på dagen ved hjelp av ormer som er dyrket med tidsbestemte lys / mørke sykluser og sett fôringstider. Har minst to eksperimenterere involvert i prosjektet for å tillate muligheten til å ha én enkelt postdata, mens den andre personen teller rutenettlinjene "blind" til betingelsene som brukes for datainnsamling. Å ha ulike personer involvert i datainnsamling, samt statistiske beregninger og analyse, reduserer også mulige skjevheter.
  5. Beregn rutenettlinjetellinger for hver naturlige produktkonsentrasjon på hver dag i forhold til kontrolltellinger for hvert minutt, slik at data fra forskjellige dager, klokkeslett og eksperimenterere kan kombineres. Disse dataene kan i gjennomsnitt analyseres og analyseres ved hjelp av Studentens T-tester. P-verdier for hver test kan vurderes per minutt i forhold til kontrollen og mellom reagenskonsentrasjoner. ANOVA-vurderinger ved hjelp av datasett avledet fra ulike eksperimentelle konsentrasjoner gir en ytterligere analysemetode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Laboratoriet som er konfigurert og klargjøring av arbeidsområdet for å kjøre pLmV-analysen, bør fullføres før eksperimenteringen begynner. Dette inkluderer utarbeidelse av habituation container, skyll beholder om nødvendig (for uttak eksperimenter), Petri parabolen over laminert rutenett papir, og riktig plassert kamera (Figur 1). Når alle videoene er tatt, er det tilrådelig å bruke et felles dataark for å standardisere datainnsamling og presentasjon mellom undersøkere (Figur 2 og Figur 2 Supplement).

Kameraet satt opp bør tillate en klar visning av planarian og rutenettet papir for å tillate en nøyaktig vurdering av fremdriften av dyret for varigheten av eksperimentet (Figur 3A og Figur 3A Supplement). Datainnsamlingen bør inneholde antall rutenettlinjer som krysses, samt det kumulative totale antall linjer som krysses per minutt av eksperimentet (figur 3B). Under pLmV-analyse har planarianere en kontinuerlig hastighet, fremoverrettet, horisontal bevegelse, med periodiske svinger, og stopper ikke. Når du begynner, bør den første fulle rutenettboksen bli scoret som en, ikke den første linjen som bestemmes i eksempelvideoen. Det er viktig å registrere starttiden for retningsbevegelse etter at planarianen er fri for penselen som brukes til å overføre den til pLmV-parabolen, og deretter følge gjennom for hvert minutt etterpå. Hvis en planarian er en del av veien gjennom en boks i minuttet, bør neste rutenettlinje krysset etter omstart av videoen telles som en fullstendig boks.  Når dyret beveger seg rundt kanten av parabolen, se linjene når de strekker seg ut fra parabolen for å bestemme en avstand på 0, 5 cm. Når ormer støter på hjørnet av en boks, kan du se den andre linjen som krysses for å score én rutenettlinje. Fokuser alltid på hodet for å gjøre disse beslutningene. Hvis planarian begynner å dekke et stramt område, bør eksperimentereren igjen følge hodet på ormen for å overvåke avstanden til en full rutenettboks. Et eksempel på denne virkemåten er inkludert i tilleggsvideoen (figur 3A-tillegg).

Hvis du vil standardisere resultatene fra hver studie, bør pLmV-kjøringene beregnes og tegnes inn når antall bokser krysses i forhold til fremdriften til den samsvarende kontrollormen (figur 3B). Hver bruker bør være opplært til å utføre analysen og telle rutenettlinjer før du begynner tester ved hjelp av reagenser av interesse. Som en benchmark, ved hjelp av eksperimentell oppsett, planarians i kildevann vanligvis dekker ca 24 bokser i 3 minutter (Figur 4A; data fra 4 brukere, gjennomsnitt på 24,8 ± 4,8). En rekke konsentrasjoner av testreagenser bør undersøkes for å bestemme hvilken type atferdsanalyse som skal brukes for hver. For pLmV analyse bør forskerne avgjøre om dyrene viser motilitet når de blir eksponert (figur 4B). Andre typer atferdsanalyser kan være mer effektive for ulike typer atferd (se diskusjon). I forhold til vårvannkontrollen vil sentralstimulerende data vise et økende antall rutenettlinjer krysset når dyret beveger seg gjennom pLmV-beholderen med ønsket konsentrasjon av testreagensen i kildevann, etter å ha blitt habituated i samme konsentrasjon av testreagensen. Til sammenligning vil uttaksdata vise et synkende antall rutenettlinjer krysset, i forhold til kildevannkontrollen, når planarian beveger seg gjennom pLmV-beholderen som har kildevann alene, etter å ha blitt habituated i ønsket konsentrasjon av reagensen blandet i kildevann (figur 4C og 4D). Spesielt kan overt uttaksdata føre til rutenett teller mindre enn de av kontrollene, som har blitt observert i narkotika indusert abstinensdata av andregrupper 2,6.

Spring vannkontroll planarians vil flytte over rutenettlinjer for varigheten av eksperimentet. Det er imidlertid mulig for testplanarianere å slutte å krysse rutenettlinjer under analysen. Hvis dette skjer, bør disse dataene utheves separat fra data om ormer som opprettholder fremdriften over rutenettlinjene. Dokumentere disse dataene som en prosentandel av det totale antall dyr eksponert for den aktuelle reagenskonsentrasjonen er en effektiv måte å illustrere den relative frekvensen av disse funnene (figur 5A-C, figur 5A supplement og figur 5B Supplement). Atferd som ikke hindrer planarianerne i å krysse rutenettlinjer, bør inkluderes i pLmV-analysen, selv om disse bevegelsene hindrer dyrenes jevnfremgang.

Figure 1
Figur 1: Representativt oppsett for pLmV-analysen.
Laboratorieplassen skal tilberedes før analysen begynner. Vist er et typisk oppsett med en 10 cm petriskål plassert over laminert 0,5 cm rutenettpapir. Et dokumentkamera er plassert slik at en klar visning av 10 cm petriskål kan tas opp på en koblet datamaskin. Imidlertid kan ethvert kamera brukes til å registrere fremdriften til planarianerne under eksperimentet, inkludert et mobiltelefonkamera plassert over Petri-parabolen ved hjelp av et ringestativ. I bakgrunnen er en 5 cm petriskål for å skylle ormer for uttakseksperimenter, samt små hvite beholdere som brukes til å habituating planarians. Også i bakgrunnen er merket, dedikerte runde akvarell pensler, pipetter, og Petri retter for hvert produkt konsentrasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: pLmV datablad.
Et forberedt dataark for å registrere antall rutenettlinjer som krysses, tilsvarende i forhold til kontrolldata, samt et middel til å telle eventuelle virkemåter, er nyttig for datainnsamlingsformål. Se Figur 2 Supplement for en nedlastbar PDF-versjon av dette tallet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativt pLmV-eksperiment og datablad.
(A) Et kamera bør plasseres over 10 cm petriskål som brukes til pLmV-analysen, slik at det planariske og hele 0,5 cm rutenettet under fatet er godt synlig. Hele pLmV-kjøringen skal registreres (figur 3A-tillegg) og(B) antall rutenettlinjer som krysses hvert minutt som er plassert i en klargjort datatabell. De akkumulerte totale rutenettlinjene som krysses, skal telles, og deretter bør disse konverteres til antall akkumulerte linjer krysset i forhold til den tilsvarende vårvannskontrollormen. Dataene i tabellen som følger med figuren (B) samsvarer med tellingene ved hjelp av tilleggsvideoen (figur 3A-tillegg). Tilsvarende kontrollantall vises ikke. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative grafer over sentralstimulerende data og uttaksdata.
Forskere bør trenes til å bruke og score pLmV analyse rutenettlinjer ved hjelp av kildevann alene før eksperimentering. Vanligvis planleggere reise ca 25 rutenettlinjer i 3 min. (A) Data fra fire brukere er vist, hver med 10 springvann kontroll ormer.  For å sette pris på effekten av en reagens på planær motilitet, undersøkes en rekke konsentrasjoner ved hjelp av pLmV-analysen, og det totale antallet rutenettlinjer som krysses, undersøkes i forhold til tilsvarende kontrollantall etter 3 minutter. (B) Kontrolldata representeres av den hvite linjen. Testdata representeres av de svarte linjene, med konsentrasjonene som brukes i mM. I forhold til kontrolldata bør tegnes inn for å best representere dataene som samles inn. (C) Sentralstimulerende data representert av den blå linjen / diamanter, vil vise en økning i rutenettlinjer krysset, versus (D) uttaksdata, også representert av den blå linjen / diamanter, vil vise en avtagende skråning fra en innledende startverdi, i forhold til kontrolldataene, som vist av den røde linjen / firkanter i begge (C og D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Observasjon og dokumentasjon av atferdsdata.
Planarianere i pLmV-analysen som ikke opprettholder retningsbevegelse under eksperimentet, men stopper med karakteristisk atferd og ikke lenger beveger seg over rutenettene, bør telles. Typisk atferd kan omfatte skjermer som "vandre"(A og Figur 5A Supplement)og "stopp"(B og Figur 5B Supplement). Disse tallene med atferdsdata bør presenteres for å dokumentere hyppigheten av denne atferden sammenlignet med alle dyrene som er eksponert for den produktkonsentrasjonen (C). Vist er eksempeldata som dokumenterer prosentandelene av vårvannskontrolldyr (Ci), og dyr utsatt for et sentralstimulerende middel (Cii), som har en vandring (blå), stopp (rød) eller ingen (grønn) oppførsel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En enkel og tilgjengelig planarisk motilitetsanalyse er beskrevet for å bestemme stimulerende og abstinenseffekter av naturlige produkter. Som atferdsmodell er det nødvendig å ha strenge protokoller for å score bevegelse og klare definisjoner av atferd for å standardisere observasjoner mellom ulike eksperimenterere. Ideene som presenteres, gir en demonstrasjon av hvordan dette kan oppnås. Hvert laboratorium som bruker denne protokollen, bør tilpasse den presenterte informasjonen slik at den passer til effekten av det bestemte produktet som testes. Det anbefales å nøye sette opp arbeidsområdet for å sikre at tester kan gjøres under konsistente forhold av hver utprøver som er involvert i studien (figur 1). Standardiserte registreringsark kan kompileres for å bistå med nøyaktig journalføring og datainnsamling om motilitet og atferd (figur 2 og figur 3B).

Motilitetstester bør gjøres på ulike tider av dagen, ved hjelp av forskjellige grupper av planarianere om mulig, for å ta hensyn til avvikende iboende circadian aktiviteter. Selv om disse analysene ikke er utført, foreslås det at etterforskerne overvåker hvordan den planære døgnrytmen kan påvirke motiliteten ved å opprettholde planarianere ved hjelp av en standard lys /mørk syklus (f.eks. 12/12), og når du utfører pLmV-analysen, bruk standard lysforhold og kjør testene samtidigpå dag 32,,33,,34. Forskere bør praktisere mekanikken i pLmV-analysen og lære å telle rutenettlinjer for å standardisere både håndteringen av planarianerne og vurderingen av planær motilitet (figur 3). Dette bør gjøres ved hjelp av uforfalskede kildevannskontroller. Vanligvis, etter 10-20 slike praksis går, data blir ganske standard for alle laboratoriemedlemmer. Teller etter en angitt pLmV-tid bør velges for å sammenligne fremdriften i å lære analysen. Etterforskerne observerer vanligvis ca 24 rutenettlinjer krysset med 3 min i pLmV-analysen i kildevann etter en 2 min habituation i kildevann (Figur 4A; representative data for fire etterforskere med 10 tilfeldige kildevannkontroller hver; 24,8 ± 4,8 rutenettlinjer). Å ha to eller tre opplærte etterforskere som utfører hvert sett med tester, kan ytterligere forbedre påliteligheten til resultatene fordi eventuelle brukerspesifikke effekter på metoden og tellinger kan tas i betraktning i feilanalysen. På denne måten kan tester og tellinger byttes mellom etterforskere slik at tellinger kan gjøres "blind" til eksperimentelle forhold. For å redusere sjansen for skjevhet, kunne ulike personer utføre statistiske tester på telledataene og utføre de påfølgende analysene. Utenfor tilstedeværelsen av produktet som testes, bør miljøvariasjoner i vannkvalitet som temperatur og pH unngås. Fordi planarianere er lysfølsomme, bør oppsettet av eksperimentet sørge for at belysningen av arbeidsområdet er jevn. Til slutt, fordi planarianere kan vise lært atferd, bør hver orm, inkludert kontroller, bare brukesen gang 26,27.

Det er nyttig å ha en eksperimentell sjekkliste i laboratoriet hvis flere eksperimenterere arbeider med analysen, spesielt i et lavere forskningslaboratorium, for å unngå vanlige fallgruver som kan oppstå når du kjører pLmV-testen, noe som vil påvirke den statistiske verdien av resultatene. Alle løsninger bør være ved romtemperatur fordi planarisk motilitet reduseres ved lavere temperaturer. Det bør tas hensyn til at prøvene sultes 5–10 dager før bruk, og at hver prøve er fullt ut dannet, med et helt pigmentert hode og hale. Det foreslås også at dedikerte flate eller runde akvarellbørster (nummer 3-6), habituation beholdere, og Petri retter brukes for hver eksperimentell konsentrasjon for å gjøre arbeidsflyten jevnere for eksperimentereren. Teknikken for å overføre planarianerne ved hjelp av små flate eller runde akvarellsmalbørster bør praktiseres mye av forskerne for å sikre effektiv overføring av ormene mellom beholdere uten å forårsake skade eller nød for dyrene (se diskusjon ovenfor; Figur 4A). Bruken av disse penslene minimerer overføringen av væsker mellom beholderne og reduserer potensiell stress på planarianerne. Imidlertid kan planarianere bli skadet av bustene hvis fibrene spres eller spilles ut når de kontakter dyret.

Fordi pLmV-analysen er avhengig av atferdsdata, er det viktig å bruke et tilstrekkelig stort datasett for å sikre robuste data til tross for medfødt variabilitet for orm-til-orm-respons. Som sådan bruker de fleste laboratorier minst ni til tolv planarianere for å teste hver konsentrasjon av produktet som undersøkes, spesielt fordi naturlige produkter kanskje ikke har så markert effekt som standardlegemidler 1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,13,14,15,16,35,36. Antall rutenettlinjer som krysses hvert minutt beregnes i forhold til kildevannskontrolldataene for hver testdag og -klokkeslett. Disse dataene er i gjennomsnitt for hver testkonsentrasjon for hvert minutt og sammenlignet med kontrolldataene, samt til andre tidstilpassede konsentrasjoner ved hjelp av både Studentens T-tester og ANOVA.

PLmV-analysen er rettet mot studier av reagenser som påvirker motiliteten til planarianerne i løpet av analysetiden. Detaljerte studier av planære bevegelser kan gjennomføres ved hjelp av en rekke andre vurderinger som er beskrevet i litteraturen4,35,36,37,38. Derfor er det forsvarlig å gjennomføre en rekke habituation eksperimenter for å ta oppmerksom på hvordan planarianerne reagerer på testreagensen ved hjelp av en rekke konsentrasjoner og sammenligner eventuelle effekter med ormenes oppførsel i kildevann før de tar fatt på atferdstester. På denne måten kan den riktige atferdstesten velges for å studere de enkelte manerer indusert av reagensen på planarian. Planarianerne kan plasseres i ulike konsentrasjoner av reagensen i 5–10 min for å avgjøre om en konsentrasjon tillater dem å opprettholde sin typiske svømmeatferd. Atferd som ikke tillater motilitet, for eksempel de som resulterer i en C-type, eller konvulsiv eller anfallslignende atferd, har vært fokus for studier ved hjelp av separate typer atferdsanalyser som kan brukes på denne metoden4,39,40. pLmV-analyser kan utføres ved hjelp av en rekke konsentrasjoner etter korte beboelsestider og antall totale nettlinjer krysset ved 3 min scoret i forhold til kildevannskontroller før tidskursstimulering og abstinensanalyser (Figur 4B)1,2,3,4,5. Etterforskerne oppfordres til å prøve andre ganger, for eksempel 15, 30 og 60 min, for å se om stimuleringsdynamikken endres med eksponeringstiden1. Som det er rapportert, i våren vannkontroll ormer opprettholde en jevn, fremover-rettet horisontal bevegelse for 10 min analyse tid1,4. I motsetning kan produktbehandlede ormer stoppe og slutte sin retningsmotilitet under analysen og ikke lenger krysse rutenettlinjer. Utprøver kan gjøre en vurdering om å begrense lengden på eksperimentell pLmV kjøre eller utlede et middel til å vurdere disse atferdene som beskrevet. Det er imidlertid viktig å vurdere hyppigheten av disse atferdene, da de gir ytterligere data som påvirker motiliteten. Motilitets- og bevegelsesdata diskuteres separat i feltet fordi det å kombinere informasjonen forvirrer vurderingen av slike data4,35,36,37,38. Som et eksempel ble det observert to atferd når ormene stoppet og ikke lenger krysset rutenettlinjer under analysen. Disse bevegelsene kalles "vandre" (Figur 5A Og Figur 5A Tillegg), og "stopp" (Figur 5B Og Figur 5B Tillegg). Hyppigheten av denne atferden er dokumentert som prosentandeler av alle dyrene som er eksponert for den bestemte produktkonsentrasjonen sammen med kontrolldataene (Figur 5C). Viktigere, tilfeldig atferd som ikke hindrer planarian fra å krysse rutenettlinjer bør inkluderes i pLmV analyse, selv om disse bevegelsene hindrer jevn fremgang av dyrene (Figur 4B, 3 mM og 10 mM barer). Som nevnt har etterforskerne beskrevet en rekke atferdskategorier som er utenfor omfanget av denne diskusjonen av pLmV-frekvensen av motilitetsprotokoll4,35,36,37,38.

PLmV-analysen er avhengig av vannløseligheten til produktet som er under etterforskning. Mange av disse stoffene er imidlertid ikke helt løselige i vann, og som sådan kan bare de vannløselige delene testes av denne analysen, mens resten må filtreres fra løsningen som det er gjort i tidligere arbeid1. Hvis pLmV-analyser kjøres ved hjelp av reagenser som er solubilisert ved hjelp av andre løsemidler enn vann, krever disse en volumekvivalent kontroll i tillegg til kildevannkontrollen. Selv om denne metoden ikke har blitt brukt med slike stoffer, bør slike vektorkontroller sannsynligvis behandles som en test, og motiliteten scoret i forhold til kontroller som alle andre teststoffer. En annen mulig måte å teste ikke-løselige stoffer ville være å mate dem til planarianerne ved å blande dem inn i matgeler. Denne teknikken brukes til å introdusere siRNA til planarians i gen knock-down / RNAi eksperimenter41. Fôring planarians biologiske produkter og siRNA, men presenterer komplikasjoner til denne analysen ved at planarianerne ikke ville bli sultet og ikke kan overføres til motility analyse beholder innen en standardisert tid som sikrer lik eksponering eller inntak av produktet under undersøkelse av eksperimentelle dyr før testing.

Når sentralstimulerende og abstinensdynamikk er etablert ved hjelp av pLmV-analysen, kan videre eksperimentering innebære komodulatorer, innføring av siRNA, samt biologiske veimodifikatorer eller legemidler for å teste for forsterkning eller hemming av de observerte motilitetseffektene sammenlignet med de første resultatene som samles inn når de ikke bruker disse biomodulatorene1,,3. For eksempel kan nedregulere uttrykket av et gen eller legge til pathway-hemmere redusere bevegelseshastigheten, mens andre kan endre dynamikken i tilbaketrekking. Gjennom observasjon av endrede pLmV-resultater kan disse tilleggseksperimentene gi innsikt i den underliggende fysiologien som påvirkes av et naturlig produkt eller annen testreagens5,,42,,43,,44.

Prosedyren beskrevet er mottagelig for ethvert laboratorium som er interessert i å bestemme stimulerende og abstinenseffekter av en rekke biomodulatorer, inkludert mange naturlige produkter. Fordelene med anvendelsen av den planære pLmV-analysen inkluderer hvor billig og lett å vedlikeholde disse dyrene er, og at de også kan være for andre planære-baserte analyser for å gi en bred forståelse av de fysiologiske effektene av produktet som er under etterforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne kontoret til Institutional Advancement, og Morrisville College Foundation for et publikasjonsstipend for å støtte dette arbeidet, samt SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) for deres pågående hjelp og støtte til lavere forskning ved SUNY Morrisville. Vi ønsker også å takke Sophia Hutchens for nyttige kommentarer til teknikken som er beskrevet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottled Water - 1 Gal. Poland Spring N/A Spring water for planarian culture and to prepare solutions
Brown Planaria (Dugesia tigrina) Carolina Biological Supply Company 132954 Brown planaria living (other species are acceptable)
Flat Paintbrush Royal Crafter's Choice 9159 Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers
Glass Petri Dish - 10 cm Kimax N/A 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay
Glass Petri Dish - 5 cm Kimax N/A 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation
Grid Paper Any N/A Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay
iPEVO Visualizer (software) iPEVO https://www.ipevo.com/software/visualizer Document camera software for video capture and recording
Metalware Set with Support Stand and Retort Ring Any N/A Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used
Organic Egg Any N/A Organic egg or beef liver for feeding planarains
Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL Beckman N/A Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation
Round Storage Container - 10 cm Ziploc N/A 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer
Round Water Paint Brush LOEW-Cornell N/A Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft
Transfer Pipette Any N/A Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians
USB Document Camera iPEVO CDVU-06IP Document camera (or other camera or cell phone camera)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
  2. Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
  3. Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
  4. Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
  5. Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
  6. Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. 0, 8-13 (2013).
  7. Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
  8. Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
  9. Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
  10. Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
  11. Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
  12. Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
  13. Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
  14. Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
  15. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
  16. Raffa, R. B., Rawls, S. M. A model for drug action and abuse. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2008).
  17. Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
  18. Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
  19. Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
  20. Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
  21. Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
  22. Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
  23. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
  24. Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
  25. de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
  26. Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
  27. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, Pt 20 3799-3810 (2013).
  28. Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
  29. Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
  30. Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
  31. Animal Diversity. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Dugesia_tigrina/ (2019).
  32. Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
  33. Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
  34. Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
  35. Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
  36. Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
  37. Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
  38. Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
  39. Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
  40. Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
  41. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
  42. Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
  43. Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
  44. Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).

Tags

Biokjemi Utgave 159 planarian pLmV motilitet atferd stimulerende tilbaketrekking
En planarisk motilitetsanalyse for å måle de biomodulerende egenskapene til naturlige produkter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voura, E. B., Pulquerio, C. H.,… More

Voura, E. B., Pulquerio, C. H., Fong, R. A. M. V., Imani, Z., Rojas, P. J., Pratt, A. M., Shantel, N. M., Livengood, E. J. A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products. J. Vis. Exp. (159), e61070, doi:10.3791/61070 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter