Summary
A motilidade planária é usada para medir as propriedades estimulantes e de retirada de produtos naturais quando comparadas com o movimento dos animais apenas na água da nascente.
Abstract
Um meio simples e controlável de usar o planário não parasitário, Dugesia tigrina, um verme aquático de vida livre, para estudar as propriedades estimulantes e de retirada de produtos naturais é descrito. Ensaios experimentais que se beneficiam de aspectos únicos da fisiologia planária têm sido aplicados a estudos sobre cicatrização de feridas, regeneração e tumorigênese. Além disso, como os planários apresentam sensibilidade a uma variedade de estímulos ambientais e são capazes de aprender e desenvolver respostas condicionadas, eles podem ser usados em estudos comportamentais que examinam a aprendizagem e a memória. Os planários possuem uma simetria bilateral básica e um sistema nervoso central que usa sistemas neurotransmissores favoráveis a estudos que examinam os efeitos dos biomoduladores neuromusculares. Consequentemente, sistemas experimentais que monitoram o movimento planário e a motilidade foram desenvolvidos para examinar o vício e a retirada de substâncias. Como a motilidade planária oferece o potencial de um sistema de ensaio de motilidade sensível e facilmente padronizado para monitorar o efeito dos estímulos, o teste de velocidade locomotor (pLmV) planário foi adaptado para monitorar tanto comportamentos de estimulação quanto de retirada por planários através da determinação do número de linhas de grade cruzadas pelos animais com o tempo. Aqui, a técnica e sua aplicação são demonstradas e explicadas.
Introduction
O protocolo descrito utiliza motilidade planária para fornecer um meio de avaliar os efeitos biomoduladores das substâncias naturais. Foi especificamente adaptado para determinar se essas substâncias funcionam como estimulantes, e se elas foram então associadas a um comportamento de retirada mensurável1. Este ensaio, conhecido como teste de velocidade locomotor planária (pLmV), foi usado pela primeira vez para testar os conhecidos agentes farmacológicos2,3. A aplicação deste ensaio planário baseado em motilidade tem crescido desde então em popularidade e tem sido adotada por diferentes laboratórios interessados em outras substâncias além dos produtos naturais4,,5. Para este ensaio, um planário é colocado em uma placa de Petri contendo água de nascente ou água de nascente contendo um biomodulador dissolvido. Como o prato em si é colocado em papel gráfico, o número de linhas de grade cruzadas pelo animal com o tempo à medida que se move sobre o recipiente pode ser usado para determinar a taxa de movimento em cada condição. O teste claro/escuro, também chamado de teste de preferência de local condicionado (CPP), é outra variação sobre o tema do monitoramento da motilidade planária, e avalia a rapidez com que os animais respondem e migram para um ambiente escurecido6,7. O rastreamento de vídeo dos movimentos planários também pode ser analisado usando programas de computador e rastreamento do Centro de Massa (COM)8,,9,,10,,11.
Usar o planário como modelo animal para tais estudos oferece várias vantagens sobre outros animais, pois o experimentador pode facilmente controlar o ambiente de ensaio. Especificamente, passar fome aos planários antes da experimentação pode impedir sua exposição a outros agentes nutricionais ou farmacológicos que poderiam confundir os resultados, e o biomodulador específico sob investigação pode ser introduzido aos planários simplesmente adicionando-o diretamente à água da cultura, padronizando assim a exposição. Como os planários possuem um sistema nervoso e neurotransmissores que lembram animais de "alta ordem", a fisiologia e as respostas experimentais desses animais a estímulos neuromusculares são consideradas biologicamente relevantes para outros organismos12,,13,,14,,15,16. Além disso, como os planários são relativamente baratos e diretos de manter em laboratório, eles oferecem um modelo biológico acessível para muitos pesquisadores.
Como um animal experimental, os planários são adequados para uma ampla gama de estudos. Por exemplo, nosso grupo, assim como outros pesquisadores usam planários para estudar tumorigênese17,,18,,19. Os planários também exibem uma série de comportamentos de resposta a estímulos químicos, térmicos, gravitacionais, elétricos, fotográficos e magnéticos que formaram a base de outros sistemas de ensaio. Alguns desses efeitos têm sido utilizados para estudar a aprendizagem e a memória nesses animais20,21,22,23,24,25,26,27. O uso primário do modelo planário na literatura atualmente enfoque na atividade de células-tronco pluripotentes planárias, chamadas neoblastos, e seu papel na regeneração28,,29,30. Assim, a adoção do modelo aqui descrito permite um estudo mais aprofundado usando outros ensaios baseados em planários para fornecer uma compreensão mais ampla de como produtos naturais e outros biomoduladores afetam o organismo.
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Protocol
1. Criação planária
- Use planários comprados de uma empresa de suprimentos biológicos ou capturados, se necessário. Os planários usados neste protocolo são Dugesia tigrina,conforme listado na lista de suprimentos. Esta espécie também é referida como Girardia tigrina31. Outras espécies planárias aquáticas também são aceitáveis2,3.
NOTA: O protocolo descrito é voltado para animais comprados de uma empresa de suprimentos biológicos. Este sistema de ensaio não foi testado com planários selvagens. No entanto, se forem utilizados planários capturados selvagens, recomenda-se que eles sejam habituados à água utilizada nos experimentos, bem como ao ambiente de laboratório por pelo menos 1 semana antes do uso. - Na chegada, transfira os planários para recipientes plásticos de armazenamento de alimentos contendo água limpa da nascente e mantenha as tampas entreabertas.
- Mantenha os planários em um ambiente escuro.
- Alimentar planários recém-entregues após 24-36 h em seu novo ambiente.
- Permita que os planários se aclimatar ao laboratório pelo menos uma semana antes da experimentação.
- Alimentar planários em um horário regular duas vezes por semana.
- Permita que os planários alimentem ad libitum em ovos cozidos orgânicos picados ou fígado de carne orgânica misturado por 1-2 h.
- Coloque os planários alimentados em um recipiente limpo após a alimentação.
- Remova a água suja dos planários.
- Use um pequeno pincel de aquarela plana (número 3-6) para transferir detritos alimentares e lodo aderindo ao recipiente de planários ao redor de planários para uma toalha de papel.
- Com água fresca da fonte e suave rodopiagem ou agitação, desaloja os planários e despeje-os em um recipiente limpo.
- Os planários que permanecerem aderidos ao recipiente podem ser transferidos usando um pincel de aquarela redondo (número 3-6) ou transferir pipeta com um furo largo.
- Decante a água de transferência.
- Cubra os planários com água limpa da fonte.
- Após 24h, remova os planários de qualquer resíduo de alimentos expelido, transferindo-os para um recipiente limpo conforme descrito acima (etapas 1.6.2.1-1.6.2.6).
- Para limpar recipientes e utensílios usados para a criação planária, não use sabão ou detergente. Limpe esses itens enxaguando-os bem com água limpa (a água da torneira é aceitável) e secando-os com um pano limpo ou papel toalha.
2. Preparação de planários para experimentos
- Permita que os planários recém-entregues se aclimatar em seu ambiente pelo menos 1 semana antes da experimentação.
- Planários de fome por 5 a 10 dias antes da experimentação.
- Mude a água da cultura pelo menos 1x durante o período de fome.
3. Teste de velocidade locomotor planária (pLmV): Comportamentos estimulantes
- Antes da experimentação, garanta que os planários famintos estejam totalmente formados, com uma cabeça e cauda completas e pigmentadas.
- Prepare uma placa de vidro ou plástico de 10 cm de Petri e um recipiente de habitação para o teste pLmV antes de iniciar o experimento.
- Coloque uma placa de Petri de 10 cm de diâmetro limpa para ser usada para o teste pLmV em papel de grade pré-nomeado (com quadrados de 0,5 cm).
- Adicione 20 mL de água de nascente não adulterada para controles, ou água de nascente contendo a concentração adequada do produto natural que está sendo testado, à placa petri de 10 cm de diâmetro a ser usada para o teste pLmV.
- Posicione uma câmera (por exemplo, celular ou câmera de alta resolução) acima da placa Petri de 10 cm de diâmetro preparada para registrar motilidade planária sobre o papel da grade durante o experimento. Um suporte de anel é uma maneira conveniente de posicionar a câmera a uma distância que pode registrar toda a visão da placa de Petri de 10 cm e linhas de grade.
- Prepare um recipiente de habitação com 5-10 mL de água de nascente não adulterada (controles), ou água de nascente contendo a concentração adequada do produto natural que está sendo testado. Um recipiente semelhante a um frasco de cintilação ou pequena placa de Petri de 5 cm é adequado.
- Use um pincel de aquarela pequeno, limpo, plano ou redondo para transferir suavemente um planário do recipiente de caldo com água de nascente para o recipiente de habitação com 5-10 mL de água de nascente não adulterada ou água de nascente contendo o produto natural que está sendo testado.
NOTA: Ao manipular planários para o ensaio pLmV, use um pincel de aquarela pequeno, limpo, plano ou redondo (número 3-6). Ao mover planários, o pincel deve ser colocado sob o animal para levantá-lo suavemente. Para garantir que os planários não sejam danificados ao usar o pincel, as cerdas da escova não devem ser jogadas sob o animal. Espalhar-se das cerdas pode prejudicar o planário se ficar preso entre as fibras da escova.
NOTA: Uma pipeta de transferência de furo largo também pode ser usada para transferir o planário para um recipiente de habitação limpa e seca.- Se usar a pipeta, remova o excesso de água movido com o planário do recipiente de habitação usando a pipeta de transferência.
- Adicione cuidadosamente a solução de habitação (ou seja, água de nascente para controles ou água de nascente contendo a concentração do produto natural a ser testada) ao recipiente de habitação contendo o planário.
- Os períodos de habitação dependerão da dinâmica de estimulação avaliada para o produto natural que está sendo testado. Um tempo de habitação de 2 min mostrou-se aceitável para detectar estimulação neste trabalho1.
- Após o período de habitação de 2 min use um pincel de aquarela para transferir suavemente o planário para o centro da placa petri preparada de 10 cm para o experimento de estimulação pLmV.
- Inicie a câmera para gravar o movimento do planário. Gravar 10-11 min de vídeo.
- Prepare o recipiente de habitação e a placa de Petri de 10 cm para o experimento pLmV com soluções frescas para cada planário.
- Use pipetas, pratos, recipientes e pincéis dedicados para cada concentração experimental do produto natural que está sendo testado para evitar expor inadvertidamente os planários à solução errada durante a experimentação.
- Como os planários exibem comportamentos aprendidos, cada planário (controle ou teste) só deve ser usado uma vez21,22.
4. Teste de velocidade locomotor planária (pLmV): Comportamentos de retirada
- Antes da experimentação, garanta que os planários famintos estejam totalmente formados, com uma cabeça e cauda completas e pigmentadas.
- Prepare uma placa de Petri de 10 cm (vidro ou plástico) para o experimento pLmV, uma placa de Petri de 5 cm (vidro ou plástico) para enxaguar o planário após a habituação, e um recipiente de habitação antes de iniciar o experimento.
- Coloque uma placa de Petri de 10 cm de diâmetro limpa para ser usada para o experimento pLmV em papel de grade pré-nomeado com quadrados de 0,5 cm).
- Adicione 20 mL de água de mola não adulterada à placa petri de 10 cm de diâmetro a ser usada para o experimento pLmV.
- Posicione uma câmera acima da placa Petri de 10 cm de diâmetro preparada como na etapa 3.2.3 para registrar motilidade planária sobre o papel de grade durante o experimento.
- Prepare o recipiente de lavagem planária adicionando 5 mL de água de nascente sozinho à placa de Petri de 5 cm.
- Prepare um recipiente de habitação com 5-10 mL de água de nascente não adulterada (controles) ou água de nascente contendo o produto natural que está sendo testado. Um recipiente semelhante a um frasco de cintilação ou pequena placa de Petri de 5 cm (vidro ou plástico) é adequado.
- Use um pincel de aquarela pequeno, limpo, plano ou redondo para transferir um planário da água da nascente para o recipiente de habitação preparado com 5-10 mL de água de nascente não adulterada (controles) ou água de nascente contendo o produto natural que está sendo testado. Mova suavemente o animal do recipiente de estoque para o recipiente de habitação. Certifique-se de que o planário não está danificado pela escova.
NOTA: Ao manipular planários para o ensaio pLmV, use um pincel de aquarela pequeno, limpo, plano ou redondo (número 3-6). Ao mover planários, o pincel deve ser colocado sob o animal para levantá-lo suavemente. Para garantir que os planários não sejam danificados ao usar o pincel, as cerdas da escova não devem ser jogadas sob o animal. Espalhar-se das cerdas pode prejudicar o planário se ficar preso entre as fibras da escova.
NOTA: Uma pipeta de transferência de furo largo também pode ser usada para transferir o planário para um recipiente de habitação limpa e seca.- Se usar a pipeta, o excesso de água movido com o planário deve ser removido do recipiente de habitação usando a pipeta de transferência.
- Adicione cuidadosamente a solução de habitação (ou seja, água de nascente não adulterada para controles ou água de nascente contendo o produto natural que está sendo testado) ao recipiente de habitação contendo o planário.
- Os períodos de habitação para retirada dependerão da dinâmica de estimulação avaliada para o produto natural que está sendo testado; 2-5 min provaram ser suficientes.
- Após o período de habitação use um pincel de aquarela para transferir suavemente o planário para a placa de Petri preparada de 5 cm contendo água de nascente para enxaguar qualquer produto natural do recipiente de habitação. Certifique-se de que o planário não está danificado pela escova.
- Transfira imediatamente o planário para o centro da placa de Petri preparada de 10 cm contendo água de nascente para o experimento de retirada do pLmV. Certifique-se de que o planário não está danificado pela escova.
- Inicie a câmera para gravar o movimento do planário. Gravar 10-11 min de vídeo.
- Prepare o recipiente de habitação, o recipiente de enxágüe e a placa de Petri de 10 cm para o experimento pLmV com soluções frescas para cada planário.
- Use pipetas, pratos, recipientes e pincéis dedicados para cada concentração experimental do produto natural que está sendo testado para evitar expor inadvertidamente os planários à solução errada durante a experimentação.
- Como os planários exibem comportamentos aprendidos, use cada planário (controle ou teste) apenas uma vez26,27.
5. Análise de dados
- Prepare uma tabela de coleta de dados para documentar o comportamento e a motilidade dos planários à medida que o número de linhas de grade cruzou para cada minuto durante a execução do pLmV. A tabela deve permitir que o número acumulado de linhas por minuto atravessado pelo planário também seja documentado. Inclua linhas para notas e uma tabela de definições para marcar a observação de comportamentos durante o período experimental, como 'wander' e 'stop' (ver Discussão).
- Usando o vídeo, conte o número de linhas de grade completa atravessadas pelo planário por minuto por 10 minutos, e registe esse número na tabela de dados. O comportamento planário típico consiste em velocidade contínua, movimento horizontal direcionado para a frente, com curvas periódicas e sem paradas.
- Comece a cronometrar o experimento no ponto em que o planário saiu do pincel usado para transferi-lo para a placa de Petri de 10 cm. Regisso horário de início.
- Para determinar quando o animal cruza um quadrado de grade completa, concentre-se na cabeça e marque uma linha quando a cabeça cruzar completamente um quadrado.
- Para marcar uma grade completa quando o verme se move ao redor da borda do prato, visualize uma distância de 0,5 cm, referindo-se às linhas enquanto elas se estendem para fora das margens do prato. Se o planário cruzar o canto de uma caixa, consulte a segunda linha cruzada para marcar uma linha de grade. Novamente, concentre-se na cabeça para fazer essas determinações.
- Pare o vídeo após cada minuto para gravar os dados.
- Ao reiniciar o vídeo para contar no minuto seguinte, se a cabeça do worm estava entre as linhas de grade quando o vídeo foi interrompido, grave a primeira linha cruzada como uma caixa cheia.
- Marcar o número de linhas de grade cruzadas por 10 minutos.
- Se o animal parar de se mover durante um teste de pLmV e não cruzar mais as linhas de grade durante o tempo de gravação de 10 minutos, documente o comportamento do planário no gráfico comportamental (por exemplo, 'vagar' ou 'parar'). Os animais que cessarem sua faixa dianteira durante o ensaio pLmV devem, em vez disso, tomar nota e os dados apresentados como uma frequência do número total de animais expostos a essa concentração de reagente. O coiling ou o comportamento convulsivo (conhecido como comportamento C) impedindo qualquer movimento para a frente durante o período de habitação indica que a concentração do produto natural não é apropriada para uso em um ensaio pLmV porque o ensaio pLmV é baseado em motilidade. Comportamentos do tipo C podem ser analisados usando um tipo diferente de análise (ver Discussão).
- Se possível, teste múltiplas concentrações experimentais do produto natural usando pelo menos 9-12 vermes em dias diferentes e diferentes horários do dia se determinando o efeito geral do reagente na fisiologia planária. No entanto, se os pesquisadores se esforçam para reduzir a variabilidade induzida pelo ritmo circadiano, os experimentos podem ser conduzidos com iluminação constante em uma hora do dia usando vermes que são cultivados com ciclos de luz/escuridão cronometrados e definem os tempos de alimentação. Tenha pelo menos dois experimentadores envolvidos no projeto para permitir a opção de ter um registro individual, enquanto o segundo individual conta as linhas de grade 'cegas' às condições utilizadas para coleta de dados. Ter diferentes indivíduos envolvidos na coleta de dados, bem como cálculos estatísticos e análises, também reduz possíveis viés.
- Calcule a contagem de linhas de grade para cada concentração de produto natural em cada dia em relação à contagem de controle para cada minuto para que dados de dias, tempos e experimentadores diferentes possam ser combinados. Esses dados podem ser mediados e analisados usando os testes T do Student. Os valores P para cada teste podem ser avaliados por minuto em comparação com o controle e entre as concentrações de reagentes. As avaliações ANOVA utilizando conjuntos de dados derivados de diferentes concentrações experimentais fornecem um método adicional de análise.
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Representative Results
O laboratório configurado e a preparação do espaço de trabalho para execução do ensaio pLmV devem ser concluídos antes do início da experimentação. Isso inclui a preparação do recipiente de habitação, o recipiente de lavagem, se necessário (para experimentos de retirada), placa de Petri sobre papel de grade laminada e câmera devidamente colocada(Figura 1). Uma vez que todos os vídeos são feitos, é aconselhável usar uma folha de dados comum para padronizar a coleta e apresentação de dados entre os investigadores (Figura 2 e Suplemento Figura 2).
A configuração da câmera deve permitir uma visão clara do planário e do papel da grade para permitir uma avaliação precisa do progresso do animal durante a duração do experimento (Figura 3A e Suplemento Figura 3A). A coleta de dados deve incluir o número de linhas de grade cruzadas, bem como o número total acumulado de linhas cruzadas por minuto do experimento(Figura 3B). Durante a análise do HPV, os planários têm uma velocidade contínua, movimento horizontal direcionado para a frente, com curvas periódicas, e não param. Ao começar, a primeira caixa de grade completa cruzada deve ser pontuada como uma, não a primeira linha como determinado no vídeo de exemplo. É importante registrar o tempo de início do movimento direcional depois que o planário está livre do pincel usado para transferi-lo para o prato pLmV, e depois seguir por cada minuto depois. Se um planário faz parte do caminho através de uma caixa no minuto, a próxima linha de grade cruzada após reiniciar o vídeo deve ser contada como uma caixa cheia. Quando o animal se move ao redor da borda do prato, consulte as linhas como elas se estendem para fora do prato para determinar uma distância de 0,5 cm. Quando os vermes encontrarem o canto de uma caixa, consulte a segunda linha cruzada para marcar uma linha de grade. Concentre-se sempre na cabeça para fazer essas determinações. Se o planário começar a cobrir uma área apertada, o experimentador deve seguir novamente a cabeça do worm para monitorar a distância de uma caixa de grade completa. Um exemplo desse comportamento está incluído no vídeo suplementar (Suplemento Figura 3A).
Para padronizar os resultados de cada ensaio, as corridas pLmV devem ser calculadas e traçadas conforme o número de caixas cruzadas em relação ao progresso do worm de controle correspondente(Figura 3B). Cada usuário deve ser treinado para realizar o ensaio e contar linhas de grade antes do início dos testes usando reagentes de interesse. Como referência, utilizando a configuração experimental, os planários em água de nascente normalmente cobrem aproximadamente 24 caixas em 3 minutos (Figura 4A; dados de 4 usuários, média de 24,8 ± 4,8). Uma série de concentrações de reagentes de teste devem ser examinadas para determinar o tipo de análise comportamental a ser usada para cada um. Para análise do HPV, os pesquisadores devem determinar se os animais apresentam motilidade quando expostos(Figura 4B). Outros tipos de análises comportamentais podem ser mais eficazes para diferentes tipos de comportamentos (ver discussão). Em relação ao controle de água da nascente, os dados estimulantes mostrarão um número crescente de linhas de rede cruzadas à medida que o animal se move através do recipiente pLmV com a concentração desejada do reagente de teste em águas de nascente, após ser habituado na mesma concentração do reagente de teste. Em contrapartida, os dados de retirada mostrarão um número decrescente de linhas de rede cruzadas, em relação ao controle de água de nascente, quando o planário se move através do recipiente pLmV tendo água de nascente sozinho, após ser habituado na concentração desejada do reagente misturado em água de nascente(Figura 4C e 4D). Notavelmente, os dados de abstinência podem levar à contagem de grades menor do que os dos controles, como tem sido observado em dados de retirada induzidos por drogas por outros grupos2,6.
Os planários de controle de água da primavera passarão por cima das linhas de rede durante o experimento. É possível, no entanto, que os planários de teste parem de cruzar as linhas de grade durante o ensaio. Se isso ocorrer, esses dados devem ser destacados separadamente a partir de dados sobre worms mantendo seu progresso sobre as linhas de grade. Documentar esses dados como uma porcentagem do número total de animais expostos a essa concentração de reagente em particular é uma forma eficaz de ilustrar a frequência relativa desses achados (Figura 5A-C, Suplemento Figura 5A e Suplemento Figura 5B). Comportamentos que não impeçam os planários de cruzar linhas de grade devem ser incluídos na análise do pLmV, mesmo que esses movimentos impeçam o progresso constante dos animais.
Figura 1: Configuração representativa para o ensaio pLmV.
O espaço do laboratório deve ser preparado antes de iniciar o ensaio. Mostrado é uma configuração típica com uma placa de Petri de 10 cm colocada sobre papel de grade laminado de 0,5 cm. Uma câmera de documento é posicionada de tal forma que uma visão clara da placa de Petri de 10 cm pode ser gravada em um computador vinculado. No entanto, qualquer câmera pode ser usada para gravar o progresso dos planários durante o experimento, incluindo uma câmera de celular posicionada acima da placa de Petri usando um suporte de anel. Ao fundo está uma placa de Petri de 5 cm para enxaguar vermes para experimentos de abstinência, bem como pequenos recipientes brancos usados para habituar os planários. Além disso, ao fundo são rotulados, pincéis de aquarela redondas dedicados, pipetas e placas de Petri para cada concentração de produto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ficha técnica do pLmV.
Uma ficha técnica preparada para registrar o número de linhas de grade cruzadas, as correspondentes em relação aos dados de controle, bem como um meio de contabilizar quaisquer comportamentos é útil para fins de coleta de dados. Consulte o Suplemento figura 2 para uma versão PDF para download desta figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Experimento pLmV representativo e ficha técnica.
(A) Uma câmera deve ser colocada acima da placa de Petri de 10 cm usada para o ensaio pLmV de tal forma que o planário e a grade completa de 0,5 cm sob o prato é claramente visível. A execução completa do pLmV deve ser registrada (Figura 3A Supplement), e (B) o número de linhas de grade cruzadas a cada minuto colocado em uma tabela de dados preparada. As linhas de grade total acumuladas cruzadas devem ser contabilizadas, e então estas devem ser convertidas para o número de linhas acumuladas cruzadas em relação ao verme de controle de água de nascente correspondente. Os dados sobre a tabela de figuras fornecidas (B) correspondem às contagens utilizando o vídeo suplementar (Figura 3A Supplement). As contagens de controle correspondentes não são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Gráficos representativos de dados estimulantes e de retirada.
Os pesquisadores devem ser treinados para usar e pontuar as linhas de grade de ensaio pLmV usando água de nascente somente antes da experimentação. Normalmente, os planários viajam cerca de 25 linhas de grade em 3 minutos. (A) Dados de quatro usuários são mostrados, cada um com 10 vermes de controle de água de nascente. Para apreciar o efeito de um reagente na motilidade planária, uma série de concentrações são pesquisadas usando o ensaio pLmV e o número total de linhas de grade cruzadas são examinadas em relação às contagens de controle correspondentes em 3 minutos. (B) Os dados de controle são representados pela barra branca. Os dados do teste são representados pelas barras pretas, com as concentrações utilizadas em MM. Em relação aos dados de controle devem ser plotados para melhor representar os dados coletados. (C) Os dados estimulantes representados pela linha azul/diamantes, mostrarão um aumento nas linhas de grade cruzadas, versus (D) dados de retirada, também representados pela linha azul/diamantes, mostrarão uma inclinação decrescente a partir de um valor inicial inicial, em relação aos dados de controle, como mostrado pela linha vermelha/quadrados em ambos(C e D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Observação e documentação dos dados comportamentais.
Planários no ensaio do pLmV que não mantêm movimento direcional durante o experimento, mas param com comportamentos característicos e não se movem mais sobre as grades devem ser contabilizados. Comportamentos típicos podem incluir displays como 'wander' (SuplementoA e Figura 5A),e 'stop' (SuplementoB e Figura 5B). Esses dados comportamentais devem ser apresentados para documentar a frequência desses comportamentos em comparação com todos os animais expostos a essa concentração do produto (C). São mostrados dados amostrais documentando os percentuais de animais de controle de água de nascente (Ci), e animais expostos a um estimulante (Cii), tendo um comportamento de wander (azul), stop (vermelho) ou não (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um ensaio de motilidade planária simples e acessível é descrito para determinar os efeitos estimulantes e de retirada de produtos naturais. Como modelo comportamental é necessário ter protocolos rigorosos para marcar movimento e definições claras de quaisquer comportamentos para padronizar observações entre diferentes experimentadores. As ideias apresentadas oferecem uma demonstração de como isso pode ser alcançado. Cada laboratório que utilizar este protocolo deve adaptar as informações apresentadas para se adequar aos efeitos do produto em particular que está sendo testado. Recomenda-se configurar cuidadosamente o espaço de trabalho para garantir que os testes possam ser feitos em condições consistentes por cada pesquisador envolvido no estudo(Figura 1). As folhas de gravação padronizadas podem ser compiladas para auxiliar na manutenção precisa de registros e coleta de dados sobre motilidade e comportamentos (Figura 2 e Figura 3B).
Os testes de motilidade devem ser feitos em vários momentos do dia, utilizando diferentes lotes de planários, se possível, para explicar as atividades circunsuárias inerentes divergentes. Embora essas análises não tenham sido conduzidas, sugere-se que os pesquisadores monitorem como o ritmo circadiano planário pode afetar a motilidade, mantendo planários usando um ciclo padrão claro/escuro (por exemplo, 12/12), e ao conduzir o ensaio do pLmV, usem condições de iluminação padrão e executem os testes na mesma hora do dia32,33,,34. Os pesquisadores devem praticar a mecânica do ensaio do pLmV e aprender a contar linhas de grade para padronizar tanto o manuseio dos planários quanto a avaliação da motilidade planária (Figura 3). Isso deve ser feito usando controles de água de nascente não adulterados. Normalmente, após 10-20 tais práticas, os dados se tornam bastante padrão para todos os membros do laboratório. Conta após um tempo de pLmV definido deve ser escolhido para comparar o progresso na aprendizagem do ensaio. Os investigadores normalmente observam aproximadamente 24 linhas de rede cruzadas por 3 min no ensaio pLmV em águas de nascente após uma habituação de 2 minutos em água de nascente (Figura 4A; dados representativos para quatro investigadores com 10 controles aleatórios de água de nascente cada; 24,8 ± linhas de rede de 4,8). Ter dois ou três investigadores treinados conduzindo cada conjunto de testes pode melhorar ainda mais a confiabilidade dos resultados, porque quaisquer efeitos específicos do usuário sobre o método e contagens podem ser levados em conta na análise de erros. Dessa forma, testes e contagens podem ser trocados entre investigadores para que as contagens possam ser feitas "cegas" às condições experimentais. Para diminuir a chance de viés, diferentes indivíduos poderiam realizar testes estatísticos nos dados da contagem e realizar as análises subsequentes. Fora a presença do produto que está sendo testado, devem ser evitadas variações ambientais na qualidade da água, como temperatura e pH. Como os planários são sensíveis à luz, a configuração do experimento deve garantir que a iluminação do espaço de trabalho esteja uniforme. Finalmente, como os planários podem exibir comportamentos aprendidos, cada verme, incluindo controles, só deve ser usado uma vez26,27.
É útil ter uma lista experimental no laboratório se vários experimentadores estiverem trabalhando com o ensaio, particularmente em um laboratório de pesquisa de graduação, para evitar armadilhas comuns que possam ocorrer ao executar o teste de pLmV, o que afetaria o valor estatístico dos resultados. Todas as soluções devem estar em temperatura ambiente porque a motilidade planária é reduzida a temperaturas mais baixas. Deve-se tomar cuidado para garantir que os espécimes estejam famintos de 5 a 10 dias antes de seu uso e que cada espécime esteja totalmente formado, com uma cabeça e cauda completamente pigmentadas. Sugere-se também que pincéis de aquarela planos ou redondos dedicados (número 3-6), recipientes de habitação e placas de Petri sejam usados para cada concentração experimental para tornar o fluxo de trabalho mais suave para o experimentador. A técnica de transferência dos planários utilizando pequenas pincéis de aquarela plana ou redonda deve ser praticada extensivamente pelos pesquisadores para garantir a transferência eficiente dos vermes entre os recipientes sem causar ferimentos ou angústia aos animais (ver discussão acima; Figura 4A). O uso desses pincéis minimiza a transferência de líquidos entre os recipientes e reduz o estresse potencial nos planários. No entanto, os planários podem ser danificados pelas cerdas se as fibras forem espalhadas ou jogadas para fora quando entrarem em contato com o animal.
Como o ensaio pLmV se baseia em dados comportamentais, é essencial usar um conjunto de dados suficientemente grande para garantir dados robustos, apesar da variabilidade inata de resposta entre worms e worms. Como tal, a maioria dos laboratórios utiliza um mínimo de nove a doze planários para testar cada concentração do produto que está sendo examinado, especialmente porque os produtos naturais podem não ter um efeito tão marcante quanto os fármacos padrão1,,2,3,4,,5,,6,7,,13,14,,15,16,35,,36. O número de linhas de grade cruzadas a cada minuto é calculado em relação aos dados de controle de água da fonte para cada dia e hora de teste. Esses dados são mediados para cada concentração de teste para cada minuto e comparados com os dados de controle, bem como com outras concentrações com tempo compatível usando tanto os testes T do Student quanto o ANOVA.
O ensaio do PLmV é voltado para estudos de reagentes que afetam a motilidade dos planários durante o período de ensaio. Estudos detalhados de movimentos planários podem ser realizados utilizando uma série de outras avaliações descritas na literatura4,35,36,37,38. Portanto, é prudente realizar uma série de experimentos de habitação para tomar nota de como os planários reagem ao reagente de teste usando uma série de concentrações e comparando quaisquer efeitos com o comportamento dos vermes na água da nascente antes de embarcar em testes comportamentais. Dessa forma, o teste comportamental adequado pode ser selecionado para estudar os maneirismos individuais induzidos pelo reagente no planário. Os planários podem ser colocados em várias concentrações do reagente por 5-10 minutos para determinar se uma concentração permite que eles mantenham seu comportamento típico de natação. Comportamentos que não permitem motilidade, como os que resultam em um tipo C, ou comportamento convulsivo ou convulsivo, têm sido o foco de estudos usando tipos separados de análises comportamentais que podem ser aplicadas a este método4,39,40. as análises do pLmV podem ser conduzidas utilizando-se uma série de concentrações após curtos tempos de habituação e o número de linhas de grade totais cruzadas em 3 min pontuadas em relação aos controles de água de nascente antes das análises de estimulação e retirada do curso de tempo (Figura 4B)1,2,3,4,5. Os pesquisadores são encorajados a amostrar outras vezes, como 15, 30 e 60 min, para ver se a dinâmica de estimulação muda com o tempo de exposição1. Como foi relatado, em mola de controle de água os vermes mantêm um movimento horizontal constante e direcionado para a frente para o tempo de ensaio de 10 minutos1,4. Em contraste, os vermes tratados com produtos podem parar e cessar sua motilidade direcional durante o ensaio e não mais cruzar linhas de grade. O investigador pode fazer um julgamento se limitar o tempo da execução experimental do pLmV ou obter um meio de avaliar esses comportamentos como descrito. É importante, no entanto, avaliar a frequência desses comportamentos, pois fornecem dados adicionais que afetam a motilidade. Os dados de motilidade e movimento são discutidos separadamente no campo porque a combinação das informações confunde a avaliação desses dados4,35,36,37,38. A título de exemplo, dois comportamentos foram observados quando os vermes pararam e não cruzaram mais as linhas de grade durante o ensaio. Esses movimentos são chamados de "wander" (Figura 5A E Figura 5A Suplemento), e 'pare' (Figura 5B E Figura 5B Suplemento). A frequência desses comportamentos são documentadas como percentuais de todos os animais expostos à concentração específica do produto juntamente com os dados de controle (Figura 5C). É importante ressaltar que comportamentos aleatórios que não impeçam o planário de cruzar linhas de grade devem ser incluídos na análise do pLmV, mesmo que esses movimentos impeçam o progresso constante dos animais (Figura 4B, barras de 3 mM e 10 mM). Como mencionado, os investigadores descreveram uma série de categorias comportamentais que estão além do escopo desta discussão da taxa de imV do protocolo de motilidade4,35,36,37,38.
O ensaio do PLmV conta com a solubilidade da água do produto sob investigação. Muitas dessas substâncias, no entanto, não são totalmente solúveis em água e, como tal, apenas as porções solúveis em água podem ser testadas por este ensaio, enquanto o resto deve ser filtrado a partir da solução como foi feito no trabalho anterior1. Se os ensaios pLmV forem executados usando reagentes solubilizados usando solventes que não sejam água, estes requerem um controle equivalente de volume, além do controle de água da nascente. Embora este método não tenha sido usado com tais substâncias, tais controles vetoriais provavelmente devem ser tratados como um teste, e a motilidade pontuada em relação aos controles como qualquer outra substância de teste. Outro meio possível para testar substâncias não solúveis seria alimentá-las aos planários misturando-as em géis alimentares. Esta técnica é usada para introduzir siRNA para planarianos em experimentos de knock-down/RNAi41. Os planários de alimentação e o siRNA, no entanto, apresentam complicações para este ensaio, pois os planários não estariam famintos e não podem ser transferidos para o recipiente de ensaio de motilidade dentro de um tempo padronizado que garanta a exposição igual ou a ingestão do produto sob investigação pelos animais experimentais antes dos testes.
Uma vez estabelecida a dinâmica estimulante e de retirada utilizando o ensaio pLmV, novas experimentações podem envolver comoduladores, a introdução de siRNA, bem como modificadores de vias biológicas ou medicamentos para testar o aumento ou inibição dos efeitos de motilidade observados em comparação com os resultados iniciais coletados quando não utilizam esses biomoduladores1,,3. Por exemplo, diminuir a expressão de um gene ou adicionar inibidores de vias pode diminuir a taxa de movimento, enquanto outros podem mudar a dinâmica da retirada. Através da observação dos resultados alterados do pLmV, esses experimentos adicionais podem fornecer uma visão da fisiologia subjacente afetada por um produto natural ou outro reagente de teste5,,42,,43,,44.
O procedimento descrito é favorável a qualquer laboratório interessado em determinar os efeitos estimulantes e de retirada de uma variedade de biomoduladores, incluindo muitos produtos naturais. As vantagens da aplicação do ensaio planário pLmV incluem o quão baratos e fáceis de manter esses animais são, e que eles também podem ser sujeitos para outros ensaios planários para fornecer uma ampla compreensão dos efeitos fisiológicos do produto sob investigação.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores desejam reconhecer o escritório de Avanço Institucional, e a Morrisville College Foundation por uma bolsa de publicação para apoiar este trabalho, bem como o SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) por sua assistência contínua e apoio à pesquisa de graduação na SUNY Morrisville. Também gostaríamos de agradecer sophia Hutchens por comentários úteis sobre a técnica descrita.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
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