Summary
플라니안 운동성은 만천성에서 동물의 움직임에 비해 천연물의 자극제 및 철수 특성을 측정하는 데 사용됩니다.
Abstract
비기생 평면을 사용하는 간단하고 제어 가능한 수단인 Dugesia tigrina는천연 제품의 자극제 및 철수 특성을 연구하기 위해 자유로운 살아있는 수생 플랫웜입니다. 평면 생리학의 독특한 양상에서 혜택을 실험 적인 분석 상처 치유에 연구에 적용 되었습니다., 재생, 그리고 종양 발생. 또한, 기획자는 다양한 환경 자극에 민감성을 나타내고 조건부 응답을 학습하고 개발할 수 있기 때문에 학습과 기억을 검토하는 행동 연구에 사용할 수 있습니다. Planarians는 신경 근육 생물 조절기의 효력을 검토하는 연구 결과에 가능한 신경 전달물질 시스템을 사용하는 기본적인 양측 대칭 및 중앙 신경계를 가지고 있습니다. 따라서, 동물 성 운동과 운동성을 모니터링하는 실험 시스템이 개발되어 약물 중독과 철수를 검사합니다. 평면 운동성은 자극의 효과를 모니터링하기 위해 민감하고 쉽게 표준화된 운동성 분석 시스템의 잠재력을 제공하므로, 평면 운동 속도(pLmV) 테스트는 동물에 의해 교차된 그리드 라인의 수를 측정하여 평면주의에 의한 자극및 철수 행동을 모니터링하도록 조정되었습니다. 여기서, 기술과 응용 프로그램은 입증및 설명된다.
Introduction
설명된 프로토콜은 천연 물질의 생체 변조 효과를 평가하는 수단을 제공하기 위해 평면 운동성을 사용합니다. 이러한 물질이 각성제로서 기능하는지, 그리고 측정 가능한 철수 동작1과연관되었는지 여부를 결정하기 위해 특별히 조정되었습니다. 이 분석, 평면 운동 속도 (pLmV) 테스트로 알려진, 먼저 알려진 약리학에이전트를테스트하는 데 사용되었다2,3. 이 평면도 기반 분석의 적용은 이후 인기가 성장하고 천연 제품이외의물질에 관심이 다른 실험실에 의해 채택되었다4,5. 이 분석의 경우, 플라나리안은 용존된 바이오 모둘레이터를 함유한 샘물 또는 샘물을 포함하는 페트리 접시에 배치됩니다. 접시 자체가 그래프 용지에 배치되기 때문에 용기에 대해 이동할 때 시간이 지남에 따라 동물이 교차하는 그리드 라인의 수를 사용하여 각 조건에서 이동 속도를 결정할 수 있습니다. 조건부 장소 선호도 테스트(CPP)라고 도는 빛/어두운 시험은, 평면도 모니터링을 주제로 한 또 다른 변형이며, 동물이 반응하고 어두운 환경으로 얼마나 빨리 이동하고 있는지평가한다 6,,7. 평면 운동의 비디오 추적은 또한컴퓨터프로그램 및 질량 중심 (COM)을 사용하여 분석 할 수 있습니다8,9,,10,,11.
이러한 연구를 위한 동물 모델로 평면을 사용하면 실험자가 분석 환경을 쉽게 제어할 수 있다는 점에서 다른 동물에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 구체적으로, 실험 전에 기획자를 굶주리면 결과를 혼동할 수 있는 다른 영양 또는 약리학 제에 대한 노출을 방지할 수 있으며, 조사 중인 특정 바이오 조절기는 단순히 배양물에 직접 첨가하여 노출을 표준화함으로써 planarians에 도입될 수 있다. 기획자는 '고원' 동물을 연상시키는 신경계와 신경전달물질을 가지고 있기 때문에, 신경근육 자극에 대한 이 동물의 생리학 및 실험반응은 다른 유기체12,,13,,14,,15,16과생물학적으로 관련이 있는 것으로 간주됩니다., 또한, 평면은 실험실에서 유지하기 위해 상대적으로 저렴하고 간단하기 때문에, 그들은 많은 조사자에 대한 접근 가능한 생물학적 모델을 제공합니다.
실험동물로서, 플래나리안은 광범위한 연구에 적합합니다. 예를 들어, 우리 그룹뿐만 아니라 다른 조사자들은 planarians를 사용하여 종양 발생17,,18,,19를연구합니다. Planarians는 또한 화학, 열, 중력, 전기, 사진 및 다른 분석 시스템의 기초를 형성 한 자기 자극에 대한 반응 행동의 호스트를 전시한다. 이러한 효과 중 일부는 이러한 동물에서 학습 및 메모리를 연구 하는 데 사용 되었습니다20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27. 현재 문헌에서 평면 모델의 주요 사용은 신폭발이라고 불리는 평면 만능 줄기 세포의 활성과 재생28,,29,,30에서의역할에 초점을 맞추고 있다. 따라서, 여기에 설명된 모델을 채택하면 다른 플라나리안 기반 의 아세법을 사용하여 천연 제품 및 기타 바이오 변조기가 유기체에 미치는 영향에 대한 광범위한 이해를 제공하는 추가 연구를 가능하게 합니다.
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Protocol
1. 플래너리안 축산
- 생물학적 공급 회사에서 구입한 평면인을 사용하거나 필요한 경우 야생에서 잡힐 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 플래니언은 공급 목록에 나열된 두게시아 티그리나입니다. 이 종은 지라디아 티그리나(31)라고도합니다. 다른 수중 평면 종도 허용2,,3.
참고: 설명된 프로토콜은 생물학적 공급 회사에서 구입한 동물에 맞게 제작되었습니다. 이 분석 시스템은 야생 으로 잡힌 평면도로 테스트되지 않았습니다. 그러나 야생 발잡한 평면도를 사용하는 경우 실험에 사용되는 물과 사용 전에 최소 1 주일 동안 실험실 환경에 습관화하는 것이 좋습니다. - 도착 시, 깨끗한 샘물이 들어있는 플라스틱 식품 저장 용기에 평면을 옮기고 뚜껑을 아자르를 유지하십시오.
- 어두운 환경에서 평면을 유지합니다.
- 새로운 환경에서 24-36h 후에 새로 배달된 플래니언에게 먹이를 주세요.
- 계획자가 실험 하기 전에 적어도 1 주 전에 실험실에 적응 할 수 있습니다.
- 일주일에 두 번 정기적으로 기획자에게 먹이를 줄 수 있습니다.
- 기획자는 다진 유기농 삶은 계란또는 혼합 된 유기농 쇠고기 간에서 광고 성욕을 1-2 시간 동안 먹일 수 있도록 합니다.
- 먹이를 먹은 후 먹이를 주는 플래너리들을 깨끗한 용기에 넣습니다.
- 플라야어에서 더러운 물을 제거합니다.
- 작은 평평한 수채화 페인트 브러시(3-6번)를 사용하여 음식 파편과 점액을 주변 의 평면에서 종이 타월로 용기에 담그십시오.
- 신선한 샘물과 부드러운 소용돌이 또는 동요로 평면을 빼내고 깨끗한 용기에 붓습니다.
- 컨테이너에 부착된 나머지 모든 평면도는 둥근 수채화 페인트브러시(3-6번)를 사용하여 옮기거나 넓은 보어로 파이펫을 옮길 수 있습니다.
- 이송 물을 데수시합니다.
- 깨끗한 샘물로 기획자들을 덮어보아 보입니다.
- 24 시간 후, 위에서 설명 한 깨끗한 용기로 전송하여 추방 된 음식물 쓰레기에서 평면을 제거하십시오 (단계 1.6.2.1-1.6.2.6).
- 평면 축산에 사용되는 용기와 기구를 청소하려면 비누 나 세제를 사용하지 마십시오. 깨끗한 물 (수돗물은 허용) 잘 씻어 깨끗한 천이나 종이 타월로 건조하여이러한 항목을 청소하십시오.
2. 실험을 위한 기획자 준비
- 새로 납품된 기획자가 실험 1주일 전에 환경에 적응하도록 허용하십시오.
- 실험 전 5~10일 동안 기획자들을 굶어 굶주리고 있습니다.
- 기아 기간 동안 배양수를 1배 이상 변경합니다.
3. 플라나리안 운동 속도 (pLmV) 테스트 : 자극제 행동
- 실험 전에 는 굶주리고 있는 평면도가 완전하고 색소된 머리와 꼬리로 완전히 형성되도록 하십시오.
- 실험을 시작하기 전에 pLmV 테스트를 위해 유리 또는 플라스틱 10cm 페트리 접시와 습관 용기를 준비합니다.
- 깨끗한 10cm 직경의 페트리 접시를 미리 미리 된 그리드 용지 (0.5cm 사각형)에 pLmV 테스트에 사용할 수 있습니다.
- pLmV 테스트에 사용되는 10cm 직경 페트리 접시에, 제어, 또는 천연 제품의 적절한 농도를 포함하는 봄물 20mL을 추가합니다.
- 실험 중에 격자 용지 위에 평면 운동성을 기록하기 위해 준비된 10cm 직경 페트리 접시 위에 카메라(예: 휴대 전화 또는 고해상도 카메라)를 배치합니다. 링 스탠드는 10cm 페트리 접시와 그리드 라인의 전체 뷰를 기록할 수 있는 먼 거리에서 카메라를 배치하는 편리한 방법입니다.
- 5~10mL의 순수하지 않은 샘물(대조군) 또는 천연물의 적절한 농도를 포함하는 샘물을 갖춘 상습 용기를 시험한다. 반짝이는 유리병 또는 작은 5cm 페트리 접시와 유사한 용기가 적합합니다.
- 작고 깨끗하며 평평하거나 둥근 수채화 페인트브러시를 사용하여 천수가 있는 스톡 용기에서 5~10mL의 순수한 샘물 또는 천연물이 함유된 샘물을 갖는 상습 용기로 평면을 부드럽게 전달합니다.
참고: pLmV 분석기의 평면을 조작할 때 작고 깨끗하며 평평하거나 둥근 수채화 페인트브러시(숫자 3-6)를 사용하십시오. 기획자 들을 움직일 때 브러시를 동물 아래에 놓고 부드럽게 들어 올려야 합니다. 브러시를 사용할 때 플라야인이 손상되지 않도록 브러시의 강모는 동물 아래에서 재생되어서는 안됩니다. 칫솔모에서 퍼지면 브러시 의 섬유 사이에 끼어있으면 계획자들에게 해를 끼칠 수 있습니다.
참고: 넓은 보어 이송 파이펫을 사용하여 평면을 깨끗하고 건조한 습관 용기로 옮길 수도 있습니다.- 파이펫을 사용하는 경우, 이송 파이펫을 사용하여 상습 용기에서 플래너리와 함께 이동된 여분의 물을 제거하십시오.
- 상습용액(즉, 천연물의 농도를 포함하는 제어용 샘물 또는 샘물)을 평면을 포함하는 습관용기에 신중하게 추가합니다.
- 습관화 기간은 테스트중인 천연 제품에 대해 평가된 자극 역학에 따라 달라집니다. 2분의 습관화 시간은 이 작품1에서자극을 감지하는 것이 허용되는 것으로 판명되었습니다.
- 2분 의 습관기간에 따라 수채화 페인트브러시를 사용하여 pLmV 자극 실험을 위해 준비된 10cm 페트리 접시의 중심으로 평면을 부드럽게 전달합니다.
- 카메라를 시작하여 평면의 움직임을 기록합니다. 동영상 10분~11분 녹화.
- 각 플래너에 대한 신선한 솔루션으로 pLmV 실험을 위한 습관 용기와 10cm 페트리 접시를 준비합니다.
- 실험 중에 실수로 잘못된 솔루션에 평면을 노출하지 않도록 테스트중인 천연 제품의 각 실험 농도에 전용 파이펫, 접시, 용기 및 페인트 브러시를 사용합니다.
- 기획자는 배운 행동을 나타내기 때문에 각 기획자 (제어 또는 테스트)는21,22에한 번만 사용해야합니다.
4. 평면 운동 속도 (pLmV) 테스트: 철수 행동
- 실험 전에 는 굶주리고 있는 평면도가 완전하고 색소된 머리와 꼬리로 완전히 형성되도록 하십시오.
- pLmV 실험을 위해 10cm 페트리 접시(유리 또는 플라스틱), 5cm 페트리 접시(유리 또는 플라스틱)를 준비하여, 실험을 시작하기 전에 플래너리를 헹구기 위한 5cm 페트리 접시(유리 또는 플라스틱)를 준비한다.
- 0.5cm 제곱으로 미리 된 그리드 용지에 pLmV 실험에 사용할 깨끗한 10cm 직경 페트리 접시를 놓습니다.
- pLmV 실험에 사용할 직경 10cm 페트리 접시에 순수하지 않은 샘물 20mL를 추가합니다.
- 실험 중에 그리드 용지 위에 평면 모틸성을 기록하기 위해 3.2.3 단계와 같이 준비된 10cm 직경 페트리 접시 위에 카메라를 배치합니다.
- 5cm 페트리 접시에 만 5mL의 샘물을 추가하여 평면 린스 용기를 준비합니다.
- 시험 중인 천연물을 함유한 순수한 샘물(대조군) 또는 샘물의 5~10mL로 상습 용기를 준비한다. 반짝이는 유리병 또는 작은 5cm 페트리 접시(유리 또는 플라스틱)와 유사한 용기가 적합합니다.
- 작고 깨끗하며 평평하거나 둥근 수채화 페인트브러시를 사용하여 30mL의 순수한 샘물(대조군) 또는 천연물이 함유된 샘물을 갖는 준비된 상습 용기로 평면을 전송합니다. 동물을 스톡 용기에서 습관 용기로 부드럽게 옮기십시오. 평면이 브러시에 의해 손상되지 않았는지 확인합니다.
참고: pLmV 분석기의 평면을 조작할 때 작고 깨끗하며 평평하거나 둥근 수채화 페인트브러시(숫자 3-6)를 사용하십시오. 기획자 들을 움직일 때 브러시를 동물 아래에 놓고 부드럽게 들어 올려야 합니다. 브러시를 사용할 때 플라야인이 손상되지 않도록 브러시의 강모는 동물 아래에서 재생되어서는 안됩니다. 칫솔모에서 퍼지면 브러시 의 섬유 사이에 끼어있으면 계획자들에게 해를 끼칠 수 있습니다.
참고: 넓은 보어 이송 파이펫을 사용하여 평면을 깨끗하고 건조한 습관 용기로 옮길 수도 있습니다.- 파이펫을 사용하는 경우, 플래너어로 이동된 여분의 물은 이송 파이펫을 사용하여 습관 용기에서 제거되어야 한다.
- 관상용액(즉, 천연물을 함유하는 제어용 순수한 샘물 또는 천연물을 포함하는 샘물)을 평면을 포함하는 상습 용기에 신중하게 추가합니다.
- 철수에 대한 습관 기간은 테스트되는 천연 제품에 대해 평가 자극 역학에 따라 달라집니다; 2-5분은 충분히 입증되었습니다.
- 습관화 기간에 따라 수채화 페인트 브러시를 사용하여 플라나리안을 스프링워터가 함유된 5cm 페트리 접시로 부드럽게 전달하여 상습 용기에서 천연 제품을 헹구십시오. 평면이 브러시에 의해 손상되지 않았는지 확인합니다.
- pLmV 철수 실험을 위해 스프링워터가 함유된 준비된 10cm 페트리 접시의 중심으로 즉시 플라네아리아를 옮겨야 한다. 평면이 브러시에 의해 손상되지 않았는지 확인합니다.
- 카메라를 시작하여 평면의 움직임을 기록합니다. 동영상 10분~11분 녹화.
- 각 플래너에 대한 신선한 솔루션으로 pLmV 실험을 위해 습관 용기, 헹구는 용기 및 10cm 페트리 접시를 준비합니다.
- 실험 중에 실수로 잘못된 솔루션에 평면을 노출하지 않도록 테스트중인 천연 제품의 각 실험 농도에 전용 파이펫, 접시, 용기 및 페인트 브러시를 사용합니다.
- 기획자는 배운 행동을 나타내기 때문에 각 플래너리안 (제어 또는 테스트)을26,,27로한 번만 사용하십시오.
5. 데이터 분석
- pLmV 실행 중에 그리드 라인의 수가 매 분마다 교차함에 따라 데이터 수집 테이블을 준비하여 평면주의의 동작과 운동성을 문서화합니다. 테이블은 평면도에 의해 교차 분당 라인의 누적 된 수를 허용한다. '방황'과 '중지'와 같은 실험 기간 동안의 동작 관찰을 집계하는 메모 라인과 정의 Discussion테이블을 포함합니다(토론 참조).
- 비디오를 사용하여 분당 평면에서 10분 동안 교차하는 전체 그리드 선 수를 계산하고 데이터 테이블에 해당 숫자를 기록합니다. 일반적인 평면 행동 연속 속도, 전방 지향, 수평 이동, 주기적인 회전, 정지 없이 구성된다.
- 플래니언이 10cm 페트리 접시로 옮기는 데 사용되는 페인트 브러시에서 벗어난 시점에서 실험을 시간 시작하십시오. 이 시작 시간을 기록합니다.
- 동물이 전체 그리드 사각형을 교차하는 시기를 확인하려면 머리에 초점을 맞추고 머리가 사각형을 완전히 교차할 때 한 줄의 점수를 매춥니다.
- 웜이 접시 가장자리 를 이동할 때 전체 그리드점수를 매기려면 접시의 여백에서 확장되는 선을 참조하여 0.5cm의 거리를 시각화합니다. 평면이 상자의 모서리를 교차하는 경우, 하나의 그리드 라인을 득점하기 위해 교차 두 번째 라인을 참조하십시오. 다시 말하지만, 이러한 결정을 내리기 위해 머리에 집중하십시오.
- 데이터를 기록하기 위해 매 분마다 비디오를 중지합니다.
- 비디오를 다시 시작하여 다음 순간을 계산할 때 웜의 머리가 비디오가 중지되었을 때 그리드 라인 사이에 있는 경우 첫 번째 줄이 전체 상자로 교차된 것을 기록합니다.
- 10분 동안 교차된 그리드 선의 수를 점수매기.
- 동물이 pLmV 테스트 중에 움직이지 않고 10분 동안 그리드 라인을 교차하지 않는 경우 행동 차트(예: '방랑' 또는 '중지')에서 평면주의의 동작을 기록합니다. pLmV 분석 중에 전진 궤도를 중단하는 동물은 대신 주의해야하며, 그 시약 농도에 노출 된 동물의 총 수의 주파수로 제시 된 데이터. 습관 기간 동안 전방 이동을 방지하는 코일링 또는 경련 적 동작(C 동작이라고 함)은 pLmV 분석이 운동성 기반이기 때문에 pLmV 분석에서 천연 물의 농도가 사용하기에 적합하지 않다는 것을 나타낸다. C형 동작은 다른 유형의 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다(토론참조).
- 가능하면, 플라니언 생리학에 대한 시약의 전반적인 효과를 결정하는 경우, 다른 일 및 하루 중 다른 시간에 적어도 9-12 웜을 사용하여 천연 제품의 다중 실험 농도를 테스트한다. 그러나, 연구원이 circadian 리듬 유도 가변성을 감소시키기 위하여 노력하는 경우에, 실험은 시간 조정된 빛/어두운 주기로 배양되고 공급 시간을 설정하는 벌레를 사용하여 하루 중 정해진 시간에 일정한 조명으로 수행될 수 있습니다. 프로젝트에 참여하는 실험자가 두 개 이상 있으면 개별 레코드 데이터가 하나 있는 옵션을 허용하는 반면, 두 번째 개별은 데이터 수집에 사용되는 조건에 그리드 라인을 '블라인드'로 계산합니다. 데이터 수집에 관련된 다른 개인과 통계 계산 및 분석도 가능한 바이어스를 줄입니다.
- 각 분별 의 제어 수에 비해 매일 각 천연 제품 농도에 대한 그리드 라인 수를 계산하여 다른 일, 시간 및 실험자의 데이터를 결합할 수 있습니다. 이러한 데이터는 학생의 T-테스트를 사용하여 평균화한 다음 분석할 수 있습니다. 각 테스트의 P 값은 대조군과 시약 농도 사이에 비해 분당 평가될 수 있습니다. 다양한 실험 농도에서 파생된 데이터 세트를 사용한 ANOVA 평가는 추가 분석 방법을 제공합니다.
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Representative Results
실험이 시작되기 전에 pLmV 분석 작업을 실행하기 위한 작업 영역을 설정하고 준비해야 합니다. 여기에는 습관 용기의 준비, 필요한 경우 헹구는 용기(철수 실험용), 적층 그리드 용지 위에 페트리 접시, 제대로 배치된카메라(그림 1)가포함됩니다. 모든 비디오를 촬영하면 공통 데이터 시트를 사용하여 조사관 간의 데이터 수집 및 프레젠테이션을 표준화하는 것이좋습니다(그림 2 및 그림 2 보충).
카메라 설정은 실험 기간 동안 동물의 진행 상황을 정확하게 평가할 수 있도록 평면및 그리드 용지의 명확한 보기를 허용해야한다(그림 3A 및 도 3A 보충). 데이터 수집에는 교차된 그리드 선 수와 실험의 분당 교차된 총 선수(그림 3B)가포함되어야 합니다. pLmV 분석 중에 평면도는 주기적인 회전과 함께 연속 속도, 전방 방향, 수평 움직임을 가지며 멈추지 않습니다. 시작 시 교차한 첫 번째 전체 그리드 상자는 예제 비디오에서 결정된 첫 번째 선이 아니라 하나로 점수를 매겨야 합니다. 평면이 pLmV 접시에 전송하는 데 사용되는 페인트 브러시가 없는 후 방향 이동의 시작 시간을 기록한 다음 그 후 매 분마다 따라가는 것이 중요합니다. 평면이 분 시간에 상자를 통과하는 방법의 일부인 경우, 비디오를 다시 시작한 후 교차한 다음 그리드 선은 전체 상자로 계산되어야 합니다. 동물이 접시 가장자리를 움직일 때, 접시에서 뻗어 나가는 선을 참조하여 0.5cm의 거리를 결정합니다. 웜이 상자의 모서리를 발생하면 교차된 두 번째 선을 참조하여 하나의 그리드 라인을 득점합니다. 항상 이러한 결정을 내릴 머리에 초점을 맞춥니다. 평면이 좁은 영역을 커버하기 시작하면 실험자는 웜의 머리를 다시 따라 전체 그리드 상자의 거리를 모니터링해야 합니다. 이 동작의 예는 보충 비디오에 포함되어 있습니다(그림 3A 보충).
각 평가판의 결과를 표준화하기 위해, pLmV 실행은 일치하는 제어웜(그림 3B)의진행상황에 따라 상자 수가 교차함에 따라 계산되고 플롯되어야 한다. 각 사용자는 관심 있는 시약을 사용하여 테스트를 시작하기 전에 분석 및 그리드 라인을 계산하도록 교육을 받아야 합니다. 벤치 마크로, 실험 설정을 사용하여, 샘물에서 평면은 일반적으로 3 분 에 약 24 상자를 커버(그림 4A;4 사용자에서 데이터, 평균 24.8 ± 4.8). 각각에 사용할 행동 분석의 유형을 결정하기 위해 테스트 시약 농도의 범위를 검사해야합니다. pLmV 분석을 위해, 연구원은 동물이 노출될 때 운동성을 표시하는지 여부를 결정해야한다(도 4B). 다른 유형의 행동 분석은 다양한 유형의 행동에 더 효과적일 수 있습니다(토론 참조). 스프링물 제어에 비해 자극제 데이터는 동물이 시험 시약의 동일한 농도로 습관화된 후, 스프링워터에서 시험 시약의 바람직한 농도를 가진 pLmV 용기를 통해 이동함에 따라 교차되는 그리드 라인의 수가 증가하는 것을 보여줄 것이다. 대조적으로, 철수 데이터는 스프링워터 제어에 비해, 플라니언이 스프링워터를 단독으로 갖는 pLmV 용기를 통과할 때, 샘물(그림4C 및 4D)에혼합된 시약의 원하는 농도로 습관화된 후 교차되는 그리드 라인의 수가 감소하는 것을 보여준다. 특히, 지나친 인출 데이터는 다른 그룹2,,6에의해 약물 유도 인출 데이터에서 관찰된 바와 같이, 대조군의 그리드 수보다 적을 수 있다.
스프링 워터 제어 평면도는 실험 기간 동안 그리드 라인을 통해 이동합니다. 그러나 테스트 플래너가 분석 중에 그리드 라인을 횡단하는 것을 중단할 수 있습니다. 이 경우 이러한 데이터는 그리드 라인을 통해 진행 상황을 유지하는 웜의 데이터와 별도로 강조 표시되어야 합니다. 이러한 데이터를 특정 시약 농도에 노출된 총 동물 수의 백분율로 문서화하는 것은 이러한 발견의 상대적 빈도를 설명하는 효과적인방법입니다(도 5A-C, 도 5A보충 및 도 5B 보충). 이러한 움직임이 동물의 꾸준한 진행을 방해하더라도 평면이 그리드 라인을 교차하는 것을 막지 못하는 동작은 pLmV 분석에 포함되어야 합니다.
그림 1: pLmV 분석기의 대표 설정입니다.
실험실 공간은 분석을 시작하기 전에 준비해야 합니다. 표시된 일반적인 설정은 적층 0.5cm 그리드 용지 위에 배치된 10cm 페트리 접시를 가진 일반적인 설정입니다. 10cm 페트리 접시의 선명한 뷰를 연결된 컴퓨터에 기록할 수 있도록 문서 카메라가 배치됩니다. 그러나 모든 카메라는 링 스탠드를 사용하여 페트리 접시 위에 위치한 휴대 전화 카메라를 포함하여 실험 중에 평면주의의 진행 상황을 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 배경에는 철수 실험을 위해 벌레를 헹구는 5cm 페트리 요리와 평면주의 습관에 사용되는 작은 흰색 용기가 있습니다. 또한, 배경에는 각 제품 농도에 대한 전용 원형 수채화 페인트 브러시, 파이펫 및 페트리 접시가 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: pLmV 데이터 시트.
교차된 그리드 선 수, 제어 데이터에 대응하는 데이터 및 모든 동작을 집계하는 수단을 기록하기 위해 준비된 데이터 시트는 데이터 수집을 위해 유용합니다. 이 그림의 다운로드 가능한 PDF 버전에 대한 그림 2 보충을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표적인 pLmV 실험 및 데이터 시트.
(A)카메라는 pLmV 분석에 사용되는 10cm 페트리 접시 위에 배치되어야 하며, 접시 밑에 있는 플래니언과 전체 0.5cm 그리드가 명확하게 볼 수 있도록 한다. 전체 pLmV 실행은 기록되어야한다(그림 3A 보충),(B)그리드 라인의 수는 준비된 데이터 테이블에 배치된 각 분교차. 교차누적된 총 그리드 라인은 집계되어야 하며, 이를 해당 스프링워터 제어 웜에 비해 교차된 누적 된 선의 수로 변환해야합니다. 제공된 그림 표의데이터(B)는보충 영상을 사용하여 카운트와 일치합니다(그림3A 보충). 해당 제어 수가 표시되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 자극제 및 인출 데이터의 대표적인 그래프입니다.
연구원은 실험 전에 단독으로 샘물을 사용하여 pLmV 분석 그리드 라인을 사용하고 점수를 주도록 훈련되어야 합니다. 일반적으로, 플래너리들은 3분 만에 약 25개의 그리드 라인을 이동합니다.(A)4명의 사용자로부터의 데이터가 표시되고, 각각 10개의 샘물 제어 웜이 있습니다. 시약이 평면 운동성에 미치는 영향을 이해하기 위해 pLmV 분석기를 사용하여 일련의 농도를 조사하고 교차하는 총 그리드 라인 수를 3분 에 비해 검사합니다. (B)제어 데이터는 흰색 막대로 표시됩니다. 테스트 데이터는 mM에 사용되는 농도와 함께 검은 막대로 표시됩니다. 제어 데이터를 기준으로 수집된 데이터를 가장 잘 나타내기 위해 플롯해야 합니다. (C)블루 라인/다이아몬드로 표현되는 자극제 데이터는, 교차된 그리드 라인의 상승을 나타내며,(D)철수 데이터도 블루 라인/다이아몬드로 나타내며, 제어 데이터에 비해 초기 시작 값에서 감소하는 경사를 나타내게된다(C 및 D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 행동 데이터의 관찰 및 문서화.
실험 중에 방향 이동을 유지하지 않는 pLmV 분석의 Planarians는 특성 적 행동으로 멈추고 더 이상 그리드 위로 이동하지 않는 것을 집계해야합니다. 일반적인 동작에는 디스플레이가 '방랑자'(A 및 그림 5A 보충)및 '정지'(B 및 그림 5B 보충)로표시될 수 있습니다.A B 행동 데이터의 이러한 집계는 해당 제품 농도(C)에 노출된 모든 동물에 비해 이러한 동작의 빈도를 문서화하기 위해 제시되어야 합니다. 도시된 견본 데이터는 스프링물 대조군 동물(Ci)의 백분율을 문서화하고, 자극제(Cii)에 노출된 동물, 방황(파란색), 정지(red) 또는 노(녹색) 동작을 갖는 것으로 나타났다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
간단하고 접근 가능한 평면 운동성 분석은 천연 제품의 자극제 및 철수 효과를 결정하기 위해 설명됩니다. 행동 모델로서 는 다양한 실험자 간의 관찰을 표준화하기 위해 모든 동작의 점수 매기기 동작과 명확한 정의를 위한 엄격한 프로토콜을 가질 필요가 있습니다. 제시된 아이디어는 이것이 어떻게 달성될 수 있는지에 대한 시연을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하는 각 실험실은 테스트 중인 특정 제품의 효과에 맞게 제시된 정보를 조정해야 합니다. 연구에 참여한 각 구도자가 일관된 조건에서 테스트를 수행할 수 있도록 작업 영역을 신중하게 설정하는 것이좋습니다(그림 1). 표준화된 레코딩 시트는 모틸성 및 동작에 대한 정확한 기록 보관 및 데이터 수집을 지원하기 위해 컴파일할 수있습니다(그림 2 및 그림 3B).
Motility 테스트는 가능한 경우 다양한 평면 인을 사용하여 하루 중 다양한 시간에 수행되어야하며 내재 된 circadian 활동을 분기해야합니다. 이러한 분석은 수행되지 않았지만, 조사관은 평면 순환 리듬이 표준 조명 / 어두운 주기 (예 : 12/12)를 사용하여 평면을 유지하고 pLmV 분석을 수행 할 때 표준 조명 조건을 사용하고 32 일32,,33,,34의동시에 테스트를 실행하여 발성도에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 모니터링하는 것이 좋습니다. 연구원은 pLmV 분석기의 역학을 연습하고 평면의 처리와 평면 운동성의 평가를 모두 표준화하기 위해 그리드 라인을 계산하는 법을 배워야한다(그림 3). 이것은 순수한 샘물 제어를 사용하여 수행해야합니다. 일반적으로 10-20개의 연습 이 실행된 후 모든 실험실 구성원에게 데이터가 매우 표준이 됩니다. 설정된 pLmV 시간 이후에 는 분석 학습의 진행 상황을 비교하도록 선택해야 합니다. 조사관은 일반적으로 샘물에서 2 분 습관화 다음 샘물에서 pLmV 분석에서 약 24 그리드 라인을 관찰(그림 4A; 10 무작위 샘물 제어와 4 명의 조사관에 대한 대표 데이터 각; 24.8 ± 4.8 그리드 라인). 각 테스트 집합을 수행하는 두 개 또는 세 개의 숙련된 조사자를 갖는 것은 방법 및 카운트에 대한 사용자별 효과를 오류 분석에서 고려할 수 있기 때문에 결과의 신뢰성을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 이러한 방식으로 검사와 카운트는 조사자 간에 교환하여 실험 조건에 '블라인드'를 수행할 수 있습니다. 편견의 가능성을 줄이기 위해 다른 개인은 카운트 데이터에 대한 통계 테스트를 수행하고 후속 분석을 수행할 수 있습니다. 시험 중인 제품의 존재 이외에 온도 및 pH와 같은 수질의 환경 적 변화를 피해야 합니다. 평면도는 빛에 민감하기 때문에 실험의 설정은 작업 공간의 조명이 균일하도록 해야합니다. 마지막으로, 평면도는 학습된 행동을 나타낼 수 있기 때문에 컨트롤을 포함한 각 웜은26,,27로한 번만 사용해야 합니다.
여러 실험자가 분석, 특히 학부 실험실에서 분석 작업을 하는 경우 결과의 통계적 가치에 영향을 미치는 pLmV 테스트를 실행할 때 발생할 수 있는 일반적인 함정을 방지하는 것이 유용합니다. 모든 솔루션은 낮은 온도에서 평면 적 운동성이 감소하기 때문에 실온에 있어야합니다. 표본이 사용하기 5-10일 전에 굶주리고 각 표본이 완전히 색소된 머리와 꼬리로 완전히 형성되도록 주의를 기울여야 합니다. 또한 각 실험 농도별로 플랫 또는 라운드 수채화 페인트브러시(3~6번), 습관용기, 페트리 접시를 사용하여 실험자의 워크플로우를 원활하게 만드는 것이 좋습니다. 작은 평면 또는 둥근 수채화 페인트 브러시를 사용하여 평면을 전송하는 기술은 동물에게 부상이나 고통을 일으키지 않고 컨테이너 사이의 웜을 효율적으로 전송하기 위해 조사관에 의해 광범위하게 수행되어야합니다 (위의 토론 참조; 그림 4A). 이러한 페인트 브러시를 사용하면 용기 간에 액체 가연을 최소화하고 계획자의 잠재적 인 스트레스를 줄입니다. 그러나, 동물에 연락할 때 섬유가 퍼지거나 밖으로 재생되는 경우 planarians는 강모에 의해 손상될 수 있습니다.
pLmV 분석은 동작 데이터에 의존하기 때문에 선천적인 웜-웜 응답 가변성에도 불구하고 강력한 데이터를 보장하기 위해 충분히 큰 데이터 집합을 사용하는 것이 필수적입니다. 따라서, 대부분의 실험실은 검사되는 제품의 각 농도를 테스트하기 위해 최소 9~12명의 평면을 사용하며, 특히 천연제품이,표준 의약품,,,,,,,1,2,3,4,5,6,7,,14, 15,13,1516,35, 36,,36으로표시되지 않았을 수 있기 때문이다., 매 분마다 교차하는 그리드 라인의 수는 각 테스트 일 및 시간에 대한 스프링 워터 제어 데이터에 따라 계산됩니다. 이러한 데이터는 각 분마다 평균되며 제어 데이터와 비교되며 학생의 T 테스트와 ANOVA를 모두 사용하는 다른 시간 일치 농도와 비교됩니다.
pLmV 분석은 분석 시간 동안 planarians의 운동성에 영향을 미치는 시약의 연구에 맞춰져 있습니다. 문헌에 설명된 여러 가지 다른 평가를 사용하여 평면 주의 운동에 대한 상세한 연구가 수행될 수 있습니다.4,35,36,37,38. 따라서, 일련의 상습 실험을 수행하여 평면인들이 다양한 농도를 이용하여 시험 시약에 어떻게 반응하는지 주목하고 행동 시험에 착수하기 전에 샘물에서 벌레의 행동과 어떤 영향을 비교하는 것이 신중하다. 이러한 방식으로, 적절한 행동 시험은 평면에 시약에 의해 유도된 개별 매너리즘을 연구하기 위하여 선택될 수 있다. 플래니언은 5-10 분 동안 시약의 다양한 농도에 배치하여 농도가 전형적인 수영 행동을 유지할 수 있는지 확인할 수 있습니다. C-타입, 또는 경련또는 발작 같이 행동을 초래하는 것과 같은 운동성을 허용하지 않는 행동은 이 방법에 적용될 수 있는 행동 분석의 별도 모형을 사용하여 연구 결과의 초점이었습니다4,39,40. pLmV 분석은 짧은 습관 시간 후 농도의 범위를 사용하여 수행 할 수 있으며, 총 그리드 라인의 수는 시간 과정 자극 및 철수 분석 전에 샘물 제어에 비해 3 분 점수에 교차 ()그림 4B)1,2,3,4,5. 조사관은 15, 30 및 60 분과 같은 다른 시간을 샘플링하여 노출 시간으로 자극 역학이 변화하는지 확인하는 것이 좋습니다.1. 보고된 바와 같이, 봄철물 제어 웜에서 10분 분석 시간 동안 안정적이고 전방 방향의 수평 이동을 유지합니다.1,4. 대조적으로, 제품 처리된 벌레는 분석 중에 방향성 운동성을 중지하고 중단할 수 있으며 더 이상 그리드 라인을 교차하지 않을 수 있습니다. 조사관은 실험pLmV 실행의 길이를 제한할지 또는 설명된 바와 같이 이러한 동작을 평가하는 수단을 도출할지 판단할 수 있다. 그러나 운동성에 영향을 미치는 추가 데이터를 제공하기 때문에 이러한 동작의 빈도를 평가하는 것이 중요합니다. 모틸리티 및 이동 데이터는 해당 데이터의 평가를 혼동하는 정보를 결합하기 때문에 현장에서 별도로 논의됩니다.4,35,36,37,38. 예를 들어 웜이 중지되고 분석 중에 그리드 선을 넘어가지 때 두 가지 동작이 관찰되었습니다. 이러한 움직임은 '방황'이라고합니다(그림 5A 및 그림 5A 보충) 및 '중지'(그림 5B 및 그림 5B 보충). 이러한 동작의 빈도는 대조군 데이터와 함께 특정 제품 농도에 노출된 모든 동물의 백분율로 문서화됩니다(그림 5C). 중요한 것은, 이러한 움직임이 동물의 꾸준한 진행을 방해하더라도, 플라니어가 그리드 라인을 교차하는 것을 막지 못하는 임의의 행동은 pLmV 분석에 포함되어야 한다(그림 4B, 3 mM 및 10 mM 바). 언급 했듯이, 조사관은 운동성 프로토콜의 pLmV 비율에 대한 이 논의의 범위를 벗어난 여러 행동 범주를 설명했습니다.4,35,36,37,38.
pLmV 분석은 조사 중인 제품의 용해도에 의존합니다. 그러나 이들 물질의 대부분은 물에 완전히 용해되지 않으며, 따라서, 용해성 부분만 이 분석법에 의해 테스트될 수 있으며 나머지는 이전 작업1에서수행된 바와 같이 용액으로부터 여과되어야 한다. pLmV 작용체가 물 이외의 용매를 사용하여 용해된 시약을 사용하여 실행되는 경우, 이들은 샘물 제어 이외에 부피 동등한 제어가 필요합니다. 이 방법은 이러한 물질과 함께 사용되지 않았지만, 이러한 벡터 컨트롤은 테스트로 처리될 가능성이 높으며 다른 시험 물질과 마찬가지로 컨트롤에 비해 운동성이 득점될 수 있습니다. 비 수용 성 물질을 테스트 하는 또 다른 가능한 수단 식품 젤에 그들을 혼합 하 여 planarians에 게 그들을 공급 하는 것입니다. 이 기술은 유전자 노크 다운 / RNAi 실험41에서planarianssiRNA를 소개하는 데 사용됩니다. 그러나, 공급 planarians 생물학적 제품 및 siRNA는, 계획자가 굶어 되지 않을 것이고 시험의 앞에 실험동물에 의해 조사되는 실험동물에 의해 조사되는 제품의 동등한 노출 또는 섭취를 보장하는 표준화된 시간 안에 운동성 분석 용기로 전송될 수 없다는 점에서 이 분석서에 합병증을 제시합니다.
pLmV 분석기를 이용하여 자극제 및 철수 역학이 확립되면, 추가 실험은 혼수기, siRNA의 도입뿐만 아니라 생물학적 통로 수정제 또는 약물을 포함할 수 있으며, 이러한 생체변조제1,,3을사용하지 않을 때 수집된 초기 결과에 비해 관찰된 운동성 효과의 확대 또는 억제를 시험할 수 있다. 예를 들면, 유전자의 발현을 다운조절하거나 통로 억제제추가는 운동의 비율을 감소시킬 수 있는 반면, 그 외는 철수의 역학을 바꿀 수 있다. 변경된 pLmV 결과의 관찰을 통해, 이러한 추가 실험은 천연 제품 또는 다른 시험 시약5,,42,,43,,44에의해 영향을 받는 근본적인 생리학에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
설명된 절차는 많은 천연 제품을 포함하여 다양한 바이오 변조기의 자극제 및 철수 효과를 결정하는 데 관심이있는 실험실에 순종합니다. planarian pLmV 분석기의 적용의 장점은 이러한 동물을 얼마나 저렴하고 쉽게 유지 관리할 수 있는지를 포함하고 있으며, 조사 중인 제품의 생리적 효과에 대한 폭넓은 이해를 제공하기 위해 다른 평면 기반 분석법의 대상이 될 수도 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 기관 발전의 사무실을 인정하고자, 이 작업을 지원하기 위해 출판 보조금모리스빌 대학 재단뿐만 아니라 SUNY 모리스빌대학에서 학부 연구의 지속적인 지원과 지원을 위한 SUNY 모리스빌 대학 과학 기술 입학 프로그램 (CSTEP). 우리는 또한 설명 된 기술에 대한 유용한 의견에 대한 소피아 허첸스에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
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