Summary
Planare Beweglichkeit wird verwendet, um die Stimulans und Entzugseigenschaften von naturwissenschaftlichen Produkten im Vergleich zur Bewegung der Tiere im Quellwasser allein zu messen.
Abstract
Beschrieben wird ein einfaches, kontrollierbares Mittel zur Verwendung des nicht-parasitären Planariers Dugesia tigrina, eines freilebenden Aqua-Flachwurms, um die Stimulans- und Entzugseigenschaften natürlicher Produkte zu untersuchen. Experimentelle Assays, die von einzigartigen Aspekten der planarischen Physiologie profitieren, wurden auf Studien zur Wundheilung, Regeneration und Tumorgenese angewendet. Da Planarier eine Sensibilität für eine Vielzahl von Umweltreizen aufweisen und in der Lage sind, konditionierte Reaktionen zu lernen und zu entwickeln, können sie in Verhaltensstudien verwendet werden, die Lernen und Gedächtnis untersuchen. Planarier besitzen eine grundlegende bilaterale Symmetrie und ein zentrales Nervensystem, das Neurotransmitter-Systeme verwendet, die für Studien zur Untersuchung der Auswirkungen neuromuskulärer Biomodulatoren geeignet sind. Folglich wurden experimentelle Systeme zur Überwachung der planaren Bewegung und Beweglichkeit entwickelt, um Die Sucht und Denentzug von Substanzen zu untersuchen. Da die planare Beweglichkeit das Potenzial für ein empfindliches, leicht standardisiertes Motilitäts-Assay-System zur Überwachung der Wirkung von Reizen bietet, wurde der planarische Bewegungsgeschwindigkeitstest (pLmV) angepasst, um sowohl das Stimulations- als auch das Entzugsverhalten von Planariern durch die Bestimmung der Anzahl der von den Tieren mit der Zeit gekreuzten Gitterlinien zu überwachen. Hier werden die Technik und ihre Anwendung demonstriert und erklärt.
Introduction
Das beschriebene Protokoll verwendet die planare Beweglichkeit, um die biomodulierende Wirkung natürlicher Substanzen zu bewerten. Es wurde speziell angepasst, um festzustellen, ob diese Substanzen als Stimulanzien funktionieren, und ob sie dann mit einem messbaren Entzugsverhalten in Verbindung gebracht wurden1. Dieser Assay, bekannt als planarianer Lokomotorvelocity (pLmV) Test, wurde zuerst verwendet, um bekannte pharmakologische Wirkstoffe zu testen2,3. Die Anwendung dieses planarrischen Motilitäts-basierten Assays hat seitdem an Popularität gewonnen und wurde von verschiedenen Laboratorien angenommen, die an anderen Stoffen als natürlichenProdukten4,5interessiert sind. Für diesen Test wird ein Planarier in eine Petrischale mit Quellwasser oder Quellwasser mit gelöstem Biomodulator gelegt. Da die Schale selbst auf Graphenpapier platziert wird, kann die Anzahl der Gitterlinien, die das Tier mit der Zeit überquert, während es sich um den Behälter bewegt, verwendet werden, um die Bewegungsgeschwindigkeit in jedem Zustand zu bestimmen. Der Hell-Dunkel-Test, auch als Konditionierter Ortspräferenztest (CPP) bezeichnet, ist eine weitere Variante des Themas der Überwachung der planaren Beweglichkeit und bewertet, wie schnell die Tiere reagieren und in eine abgedunkelte Umgebung wandern6,7. Video-Tracking von planaren Bewegungen kann auch mit Computerprogrammen und Massenzentrum (COM) Tracking8,9,10,11analysiert werden.
Die Verwendung des Planariers als Tiermodell für solche Studien bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Tieren, da der Experimentator die Assay-Umgebung leicht kontrollieren kann. Insbesondere kann das Aushungern der Planarier vor dem Experimentieren ihre Exposition gegenüber anderen Ernährungs- oder pharmakologischen Wirkstoffen verhindern, die die Ergebnisse sonst verwirren könnten, und der spezifische Biomodulator, der untersucht wird, kann einfach durch direkte Zugabe in das Kulturwasser in die Planarier eingeführt werden, wodurch die Exposition standardisiert wird. Da Planarier ein Nervensystem und Neurotransmitter haben, die an Tiere höherer Ordnung erinnern, gelten die Physiologie und die experimentellen Reaktionen dieser Tiere auf neuromuskuläre Reize als biologisch relevant für andere Organismen12,13,14,15,16. Auch weil Planarier relativ kostengünstig und unkompliziert im Labor zu warten sind, bieten sie vielen Forschern ein zugängliches biologisches Modell.
Als Versuchstier eignen sich Planarier für eine Vielzahl von Studien. Zum Beispiel, unsere Gruppe, sowie andere Forscher verwenden Planarier Tumorigenese17,18,19zu studieren. Planarier zeigen auch eine Vielzahl von Reaktionsverhalten auf chemische, thermische, gravitarische, elektrische, Foto- und magnetische Reize, die die Grundlage anderer Assay-Systeme bildeten. Einige dieser Effekte wurden verwendet, um lernen und Gedächtnis bei diesen Tieren zu studieren20,21,22,23,24,25,26,27. Die primäre Verwendung des planarischen Modells in der Literatur konzentriert sich derzeit auf die Aktivität von planarianischen pluripotenten Stammzellen, neoblasten genannt, und ihre Rolle bei der Regeneration28,29,30. Die Annahme des hier beschriebenen Modells ermöglicht daher weitere Studien mit anderen planarianbasierten Assays, um ein breiteres Verständnis dafür zu vermitteln, wie natürliche Produkte und andere Biomodulatoren den Organismus beeinflussen.
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Protocol
1. Planare Haltung
- Verwenden Sie Planarier, die von einem biologischen Versorgungsunternehmen gekauft oder bei Bedarf wild gefangen werden. Die in diesem Protokoll verwendeten Planarier sind Dugesia tigrina, wie in der Versorgungsliste aufgeführt. Diese Art wird auch als Girardia tigrina31bezeichnet. Andere aquatische planare Arten sind auch akzeptabel2,3.
HINWEIS: Das beschriebene Protokoll richtet sich an Tiere, die von einem biologischen Versorgungsunternehmen gekauft wurden. Dieses Assay-System wurde nicht mit wildgefangenen Planariern getestet. Wenn jedoch wild gefangene Planarier verwendet werden, wird empfohlen, dass sie an das in den Experimenten verwendete Wasser sowie die Laborumgebung für mindestens 1 Woche vor Gebrauch gewöhnt werden. - Nach der Ankunft, Transfer Planarians auf Kunststoff-Lebensmittel-Lagerbehälter mit sauberem Quellwasser und halten Sie die Deckel ajar.
- Halten Sie Planarier in einer abgedunkelten Umgebung.
- Füttern Sie neu gelieferte Planarier nach 24-36 h in ihrer neuen Umgebung.
- Lassen Sie die Planarier sich mindestens 1 Woche vor dem Experimentieren an das Labor akklimatisieren.
- Füttern Sie Planarier nach einem regelmäßigen Zeitplan von zweimal pro Woche.
- Erlauben Sie Planariern, ad libitum auf gehackte Bio-gekochte Eier oder gemischte Bio-Rinderleber für 1-2 h zu füttern.
- Fütternde Planarier nach der Fütterung in einen sauberen Behälter geben.
- Entfernen Sie das verschmutzte Wasser von den Planariern.
- Verwenden Sie einen kleinen flachen Aquarellpinsel (Nummer 3–6), um Lebensmittelreste und Schleim, die an dem Behälter haften, von rund Planariern auf ein Papiertuch zu übertragen.
- Mit frischem Quellwasser und sanftem Wirbeln oder Erregen, vertreiben Sie Planarier und gießen Sie sie in einen sauberen Behälter.
- Alle am Behälter verbliebenen Planarier können mit einem runden Aquarellpinsel (Nummer 3–6) oder einer Transferpipette mit breiter Bohrung übertragen werden.
- Dekantieren Sie das Transferwasser.
- Bedecken Sie die Planarien mit sauberem Quellwasser.
- Entfernen Sie die Planarien aus der ausgestoßenen Lebensmittelverschwendung nach 24 h, indem Sie sie wie oben beschrieben in einen sauberen Behälter überführen (Schritte 1.6.2.1–1.6.2.6).
- Um Behälter und Utensilien für die planare Haltung zu reinigen, verwenden Sie keine Seife oder Reinigungsmittel. Reinigen Sie diese Gegenstände, indem Sie sie gut mit sauberem Wasser spülen (Leitungswasser ist akzeptabel) und trocknen Sie sie mit einem sauberen Tuch oder Papiertuch.
2. Vorbereitung von Planariern für Experimente
- Lassen Sie neu ausgelieferte Planarier sich mindestens 1 Woche vor dem Experimentieren an ihre Umgebung anklimatisieren.
- Verhungern Sie Planarier für 5-10 Tage vor dem Experimentieren.
- Ändern Sie das Kulturwasser mindestens 1x während der Hungerperiode.
3. Planarer Bewegungsgeschwindigkeitstest (pLmV): Stimulanzienverhalten
- Stellen Sie vor dem Experimentieren sicher, dass ausgehungerte Planarier vollständig ausgebildet sind, mit einem vollständigen und pigmentierten Kopf und Schwanz.
- Bereiten Sie vor Beginn des Experiments eine 10 cm-Petrischale aus Glas oder Kunststoff und einen Wohnbehälter für den pLmV-Test vor.
- Legen Sie eine saubere Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm für den pLmV-Test auf vorlaminiertem Gitterpapier (mit 0,5 cm Quadraten) an.
- Fügen Sie 20 ml unverfälschtem Quellwasser für die Kontrollen oder Quellwasser mit der entsprechenden Konzentration des zu prüfenden Naturprodukts zu der Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm hinzu, die für den pLmV-Test verwendet werden soll.
- Positionieren Sie eine Kamera (z. B. Handy oder hochauflösende Kamera) über der vorbereiteten Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm, um während des Experiments planare Motilität über dem Gitterpapier aufzuzeichnen. Ein Ringständer ist eine bequeme Möglichkeit, die Kamera in einer Entfernung zu positionieren, die die gesamte Ansicht der 10 cm Petrischale und Gitterlinien aufzeichnen kann.
- Bereiten Sie einen Wohnbehälter mit 5–10 ml unverfälschtem Quellwasser (Kontrollen) oder Quellwasser vor, das die entsprechende Konzentration des zu prüfenden Naturprodukts enthält. Ein Behälter ähnlich einer Szintillationsdurchstechflasche oder einer kleinen 5 cm Petrischale ist geeignet.
- Verwenden Sie einen kleinen, sauberen, flachen oder runden Aquarellpinsel, um einen Planarier vorsichtig aus dem Lagerbehälter mit Quellwasser in den Gewöhnungsbehälter mit 5–10 ml unverfälschtem Quellwasser oder Quellwasser zu bringen, das das zu prüfende Naturprodukt enthält.
HINWEIS: Verwenden Sie beim Manipulieren von Planariern für den pLmV-Test einen kleinen, sauberen, flachen oder runden Aquarellpinsel (Nummer 3–6). Beim Bewegen von Planariern sollte der Pinsel unter das Tier gelegt werden, um es sanft zu heben. Um sicherzustellen, dass Dieplanare bei der Verwendung der Bürste nicht beschädigt werden, sollten die Borsten der Bürste nicht unter dem Tier ausgespreizt werden. Das Ausbreiten aus den Borsten könnte dem Planarier schaden, wenn er zwischen den Fasern der Bürste gefangen wird.
HINWEIS: Eine weit bohrungstragende Transferpipette kann auch für die Übertragung des Planariers in einen sauberen und trockenen Wohnbehälter verwendet werden.- Wenn Sie die Pipette verwenden, entfernen Sie überschüssiges Wasser, das mit dem Planarier aus dem Wohnbehälter bewegt wird, indem Sie die Transferpipette verwenden.
- Fügen Sie die Gewöhnungslösung (d. h. Quellwasser für Kontrollen oder Quellwasser, das die Konzentration des zu prüfenden Naturprodukts enthält) vorsichtig in den Gewöhnungsbehälter ein, der den Planarier enthält.
- Die Besiedlungszeiten hängen von der Stimulationsdynamik ab, die für das zu prüfende Naturprodukt bewertet wird. Eine Gewöhnungszeit von 2 min erwies sich als akzeptabel, um Stimulation in dieser Arbeit zu erkennen1.
- Nach der 2-min-Gewöhnungszeit verwenden Sie einen Aquarellpinsel, um den Planarier für das pLmV Stimulationsexperiment sanft in die Mitte der vorbereiteten 10 cm Petrischale zu übertragen.
- Starten Sie die Kamera, um die Bewegung des Planariers aufzuzeichnen. Aufzeichnung 10–11 min Video.
- Bereiten Sie den Wohnbehälter und die 10 cm Petrischale für das pLmV-Experiment mit frischen Lösungen für jeden Planarier vor.
- Verwenden Sie spezielle Pipetten, Geschirr, Behälter und Pinsel für jede experimentelle Konzentration des zu testenden Naturprodukts, um zu vermeiden, dass Planarier während des Experimentierens versehentlich der falschen Lösung aussetzen.
- Da Planarier erlerntes Verhalten aufweisen, sollte jeder Planarier (Kontrolle oder Test) nur einmal21,22verwendet werden.
4. Planarer Bewegungsgeschwindigkeitstest (pLmV): Entzugsverhalten
- Stellen Sie vor dem Experimentieren sicher, dass ausgehungerte Planarier vollständig ausgebildet sind, mit einem vollständigen und pigmentierten Kopf und Schwanz.
- Bereiten Sie eine 10 cm Petrischale (Glas oder Kunststoff) für das pLmV-Experiment, eine 5 cm Petrischale (Glas oder Kunststoff) zum Spülen des Planariers nach der Gewöhnung und einen Wohnbehälter vor Beginn des Experiments vor.
- Legen Sie eine saubere Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm für das pLmV-Experiment auf vorlaminiertem Gitterpapier mit 0,5 cm Quadraten.
- Fügen Sie der Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm 20 ml unverfälschtes Quellwasser hinzu, das für das pLmV-Experiment verwendet werden soll.
- Positionieren Sie eine Kamera über der vorbereiteten Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm wie in Schritt 3.2.3, um während des Experiments planare Motilität über dem Gitterpapier aufzuzeichnen.
- Bereiten Sie den planaren Spülbehälter vor, indem Sie 5 ml Quellwasser allein auf die 5 cm Petrischale auffügen.
- Bereiten Sie einen Wohnbehälter mit 5–10 ml unverfälschtem Quellwasser (Kontrollen) oder Quellwasser vor, das das zu prüfende Naturprodukt enthält. Ein Behälter ähnlich einer Szintillationsdurchstechflasche oder einer kleinen 5 cm Petrischale (Glas oder Kunststoff) ist geeignet.
- Verwenden Sie einen kleinen, sauberen, flachen oder runden Aquarellpinsel, um einen Planarier vom Quellwasser in den vorbereiteten Wohnbehälter mit 5–10 ml unverfälschtem Quellwasser (Kontrollen) oder Quellwasser zu bringen, das das zu prüfende Naturprodukt enthält. Bewegen Sie das Tier vorsichtig vom Lagerbehälter in den Gewöhnungsbehälter. Stellen Sie sicher, dass der Planarier nicht durch den Pinsel beschädigt wird.
HINWEIS: Verwenden Sie beim Manipulieren von Planariern für den pLmV-Test einen kleinen, sauberen, flachen oder runden Aquarellpinsel (Nummer 3–6). Beim Bewegen von Planariern sollte der Pinsel unter das Tier gelegt werden, um es sanft zu heben. Um sicherzustellen, dass Dieplanare bei der Verwendung der Bürste nicht beschädigt werden, sollten die Borsten der Bürste nicht unter dem Tier ausgespreizt werden. Das Ausbreiten aus den Borsten könnte dem Planarier schaden, wenn er zwischen den Fasern der Bürste gefangen wird.
HINWEIS: Eine breite Bohrung TransferPipette kann auch verwendet werden, um den Planarier in einen sauberen und trockenen Gewöhnungsbehälter zu übertragen.- Bei Verwendung der Pipette sollte überschüssiges Wasser, das mit dem Planarier bewegt wird, mit der Transferpipette aus dem Wohnbehälter entfernt werden.
- Fügen Sie die Gewöhnungslösung (d. h. unverfälschtes Quellwasser für Kontrollen oder Quellwasser, das das zu prüfende Naturprodukt enthält) vorsichtig in den Gewöhnungsbehälter mit dem Planarier ein.
- Die Wartezeiten für die Entnahme hängen von der Stimulationsdynamik ab, die für das zu prüfende Naturprodukt bewertet wird; 2:5 min haben sich als ausreichend erwiesen.
- Nach der Gewöhnungszeit verwenden Sie einen Aquarellpinsel, um den Planarier sanft auf die vorbereitete 5 cm Petrischale mit Quellwasser zu übertragen, um jedes Naturprodukt aus dem Gewöhnungsbehälter abzuspülen. Stellen Sie sicher, dass der Planarier nicht durch den Pinsel beschädigt wird.
- Den Planarier sofort in die Mitte der vorbereiteten 10 cm Petrischale mit Quellwasser für das pLmV-Entzugsexperiment verlegen. Stellen Sie sicher, dass der Planarier nicht durch den Pinsel beschädigt wird.
- Starten Sie die Kamera, um die Bewegung des Planariers aufzuzeichnen. Aufzeichnung 10–11 min Video.
- Bereiten Sie den Wohnbehälter, den Spülbehälter und die 10 cm Petrischale für das pLmV-Experiment mit frischen Lösungen für jeden Planarier vor.
- Verwenden Sie spezielle Pipetten, Geschirr, Behälter und Pinsel für jede experimentelle Konzentration des zu testenden Naturprodukts, um zu vermeiden, dass Planarier während des Experimentierens versehentlich der falschen Lösung aussetzen.
- Da Planarier erlernteVerhaltensweisen aufweisen, verwenden Sie jeden Planarier (Kontrolle oder Test) nur einmal26,27.
5. Datenanalyse
- Bereiten Sie eine Datensammlungstabelle vor, um das Verhalten und die Beweglichkeit von Planariern zu dokumentieren, da die Anzahl der Rasterlinien, die während der pLmV-Ausführung für jede Minute überschritten wurden. Die Tabelle sollte es ermöglichen, dass auch die kumulierte Anzahl von Zeilen pro Minute, die vom Planarier überschritten werden, dokumentiert werden kann. Fügen Sie Zeilen für Notizen und eine Tabelle mit Definitionen ein, um die Beobachtung von Verhaltensweisen während des Versuchszeitraums zu zählen, z. B. "wandern" und "anhalten" (siehe Diskussion).
- Zählen Sie mithilfe des Videos die Anzahl der vollständigen Rasterlinien, die vom Planarier pro Minute für 10 minuten überschritten werden, und notieren Sie diese Zahl in der Datentabelle. Typisches planares Verhalten besteht aus kontinuierlicher Geschwindigkeit, vorwärts gerichteter, horizontaler Bewegung, mit periodischen Drehungen und ohne Stopps.
- Beginnen Sie, das Experiment an dem Punkt zu beginnen, an dem der Planarier den Pinsel, mit dem er verwendet wurde, auf die 10 cm Petrischale übertragen hat. Zeichnen Sie diese Startzeit auf.
- Um zu bestimmen, wann das Tier ein vollständiges Rasterquadrat kreuzt, konzentrieren Sie sich auf den Kopf und punkten Sie eine Linie, wenn der Kopf ein Quadrat vollständig kreuzt.
- Um ein vollständiges Raster zu erzielen, wenn sich der Wurm um den Rand der Schale bewegt, visualisieren Sie einen Abstand von 0,5 cm, indem Sie auf die Linien verweisen, die sich von den Rändern der Schale erstrecken. Wenn der Planarier die Ecke eines Felds kreuzt, beziehen Sie sich auf die zweite Linie, die überschritten wird, um eine Rasterlinie zu erzielen. Konzentrieren Sie sich erneut auf den Kopf, um diese Entscheidungen zu treffen.
- Beenden Sie das Video nach jeder Minute, um die Daten aufzuzeichnen.
- Wenn das Video neu gestartet wird, um die nächste Minute zu zählen, wenn sich der Kopf des Wurms zwischen Gitternetzlinien befand, als das Video angehalten wurde, zeichnen Sie die erste Zeile auf, die als vollständige Sendebox gekreuzt wurde.
- Noten Sie die Anzahl der Gitterlinien, die für 10 min gekreuzt wurden.
- Wenn sich das Tier während eines pLmV-Tests nicht mehr bewegt und während der 10-minuten-Aufzeichnungszeit keine Gitterlinien mehr kreuzt, dokumentieren Sie das Verhalten des Planariers im Verhaltensdiagramm (z. B. "wandern" oder "Stopp"). Tiere, die während des pLmV-Testes ihre Vorwärtsspur einstellen, sollten stattdessen zur Kenntnis genommen und die Daten als Häufigkeit der Gesamtzahl der Tiere dargestellt werden, die dieser Reagenzkonzentration ausgesetzt sind. Coiling oder Krampfverhalten (bekannt als C-Verhalten), das eine Vorwärtsbewegung während der Gewöhnungsperiode verhindert, weist darauf hin, dass die Konzentration des Naturprodukts nicht für die Verwendung in einem pLmV-Test geeignet ist, da der pLmV-Test auf Beweglichkeit basiert. C-Typ-Verhalten kann mit einem anderen Analysetyp analysiert werden (siehe Diskussion).
- Wenn möglich, testen Sie mehrere experimentelle Konzentrationen des Naturprodukts mit mindestens 9–12 Würmern an verschiedenen Tagen und zu verschiedenen Tageszeiten, wenn die Gesamtwirkung des Reagenzes auf die planarische Physiologie bestimmt wird. Wenn Forscher jedoch versuchen, die zirkadiane Rhythm-induzierte Variabilität zu reduzieren, können Experimente mit konstanter Beleuchtung zu einer festgelegten Tageszeit mit Würmern durchgeführt werden, die mit zeitlichen Licht-/Dunkelzyklen kultiviert werden und Fütterungszeiten einstellen. Mindestens zwei Experimentatoren am Projekt beteiligt haben, um die Möglichkeit zu ermöglichen, eine einzelne Datensatzdaten zu haben, während die zweite Person die Rasterlinien "blind" zu den Bedingungen für die Datenerfassung zählt. Die Beteiligung verschiedener Personen an der Datenerhebung sowie an statistischen Berechnungen und Analysen verringert auch mögliche Verzerrungen.
- Berechnen Sie die Anzahl der Rasterlinien für jede natürliche Produktkonzentration an jedem Tag relativ zur Kontrollanzahl für jede Minute, damit Daten aus verschiedenen Tagen, Zeiten und Experimentatoren kombiniert werden können. Diese Daten können gemittelt und dann mit den T-Tests von Student analysiert werden. Die P-Werte für jeden Test können pro Minute im Vergleich zur Kontrolle und zwischen den Reagenzkonzentrationen bewertet werden. ANOVA-Bewertungen mit Datensätzen aus verschiedenen experimentellen Konzentrationen bieten eine weitere Analysemethode.
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Representative Results
Das Labor, das den Arbeitsbereich für den Betrieb des pLmV-Tests eingerichtet und vorbereitet, sollte vor Beginn der Experimente abgeschlossen sein. Dazu gehören die Vorbereitung des Gewöhnbehälters, Spülbehälter bei Bedarf (für Entzugsexperimente), Petrischale über laminiertem Gitterpapier und ordnungsgemäß platzierte Kamera(Abbildung 1). Sobald alle Videos aufgenommen wurden, ist es ratsam, ein gemeinsames Datenblatt zu verwenden, um die Datenerfassung und -darstellung zwischen den Prüfern zu standardisieren (Abbildung 2 und Abbildung 2 Beilage).
Die eingesetzte Kamera sollte eine klare Sicht auf den Planarier und das Rasterpapier ermöglichen, um eine genaue Beurteilung des Fortschritts des Tieres für die Dauer des Versuchs zu ermöglichen (Abbildung 3A und Abbildung 3A Ergänzung). Die Datenerfassung sollte die Anzahl der gekreuzten Rasterlinien sowie die gesamtzahle Gesamtzahl der pro Minute des Experiments gekreuzten Linien umfassen(Abbildung 3B). Während der pLmV-Analyse haben Planarier eine kontinuierliche Geschwindigkeit, vorwärts gerichtete, horizontale Bewegung, mit periodischen Drehungen, und nicht anhalten. Am Anfang sollte das erste vollständige Gitterfeld als eine, nicht als die erste Zeile, wie im Beispielvideo festgelegt, bewertet werden. Es ist wichtig, die Startzeit der Richtungsbewegung aufzuzeichnen, nachdem der Planarier frei von dem Pinsel ist, der verwendet wird, um ihn auf die pLmV-Schale zu übertragen, und dann für jede Minute danach zu folgen. Wenn ein Planarier zum Minutentakt durch eine Box führt, sollte die nächste Gitterlinie, die nach dem Neustart des Videos überschritten wurde, als vollständige Box gezählt werden. Wenn sich das Tier um den Rand der Schale bewegt, beziehen Sie sich auf die Linien, die sich von der Schale ausstrecken, um einen Abstand von 0,5 cm zu bestimmen. Wenn Würmer auf die Ecke eines Felds treffen, beziehen Sie sich auf die zweite Linie, die überschritten wird, um eine Rasterlinie zu erzielen. Konzentrieren Sie sich immer auf den Kopf, um diese Entscheidungen zu treffen. Wenn der Planarier beginnt, einen engen Bereich zu bedecken, sollte der Experimentator wieder dem Kopf des Wurms folgen, um den Abstand eines vollständigen Gitterkastens zu überwachen. Ein Beispiel für dieses Verhalten ist im Zusatzvideo enthalten (Abbildung 3A Beilage).
Um die Ergebnisse jeder Studie zu standardisieren, sollten die pLmV-Läufe berechnet und als Anzahl der Kästchen gekreuzt werden, die relativ zum Fortschritt des übereinstimmenden Steuerwurms gekreuzt wurden (Abbildung 3B). Jeder Benutzer sollte geschult werden, die Assay- und Zählgitterlinien vor Beginn der Tests mit rezianten Reagenzien von Interesse durchzuführen. Als Benchmark decken Die Planarien im Quellwasser anhand des Versuchsaufbaus in der Regel etwa 24 Boxen in 3 Minuten ab(Abbildung 4A; Daten von 4 Benutzern, Durchschnitt 24,8 ± 4,8). Es sollte eine Reihe von Testreagenzkonzentrationen untersucht werden, um die Art der Verhaltensanalyse zu bestimmen, die für jede zu verwendenist. Für die pLmV-Analyse sollten die Forscher bestimmen, ob die Tiere bei belichtender Beweglichkeit Beweglichkeit aufweisen (Abbildung 4B). Andere Arten von Verhaltensanalysen können für verschiedene Arten von Verhaltensweisen effektiver sein (siehe Diskussion). Im Vergleich zur Quellwasserkontrolle zeigen die Stimulanzien eine zunehmende Anzahl von Gitterleitungen, die überschritten werden, wenn sich das Tier durch den pLmV-Behälter mit der gewünschten Konzentration des Testreagenzes im Quellwasser bewegt, nachdem es in derselben Konzentration des Testreagenzes gewöhnt wurde. Im Gegensatz dazu zeigen die Entnahmedaten eine abnehmende Anzahl von Gerasterlinien, die im Verhältnis zur Quellwasserkontrolle gekreuzt werden, wenn sich der Planarier durch den pLmV-Behälter bewegt, der allein Quellwasser enthält, nachdem er in der gewünschten Konzentration des in Quellwasser vermischten Reagenzs in Quellwasser gewöhnt wurde(Abbildung 4C und 4D). Insbesondere können unauffällige Entnahmedaten zu Netzzählungen führen, die geringer sind als die der Kontrollen, wie in drogeninduzierten Entzugsdaten anderer Gruppen beobachtet wurde2,6.
Die Planare nder Wasserwerden werden sich für die Dauer des Experiments über Gitterleitungen bewegen. Es ist jedoch möglich, dass Testplanarier während des Tests keine Netzlinien mehr überqueren. In diesem Fall sollten diese Daten getrennt von Daten über Würmer hervorgehoben werden, die ihren Fortschritt über die Rasterlinien aufrechterhalten. Die Dokumentation dieser Daten als Prozentsatz der Gesamtzahl der Tiere, die dieser speziellen Reagenzkonzentration ausgesetzt sind, ist eine wirksame Möglichkeit, die relative Häufigkeit dieser Befunde zu veranschaulichen (Abbildung 5A-C, Abbildung 5A Ergänzung und Abbildung 5B Ergänzung). Verhaltensweisen, die die Planarier nicht daran hindern, Gitterleitungen zu überqueren, sollten in die pLmV-Analyse einbezogen werden, auch wenn diese Bewegungen den stetigen Fortschritt der Tiere behindern.
Abbildung 1: Repräsentative Einrichtung für den pLmV-Test.
Der Laborraum sollte vor Beginn des Tests vorbereitet werden. Gezeigt wird ein typisches Setup mit einer 10 cm Petrischale, die über laminiertem 0,5 cm Rasterpapier platziert ist. Eine Dokumentenkamera ist so positioniert, dass eine klare Sicht auf die 10 cm Petrischale auf einem verknüpften Computer aufgezeichnet werden kann. Jede Kamera kann jedoch verwendet werden, um den Fortschritt der Planarier während des Experiments aufzuzeichnen, einschließlich einer Handykamera, die über der Petrischale mit einem Ringständer positioniert ist. Im Hintergrund befindet sich eine 5 cm Petrischale zum Spülen von Würmern für Entzugsexperimente sowie kleine weiße Behälter, die zur Gewöhnung der Planarier verwendet werden. Auch im Hintergrund sind beschriftet, gewidmet eige runde Aquarell Pinsel, Pipetten und Petri Schalen für jede Produktkonzentration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: pLmV-Datenblatt.
Ein vorbereitetes Datenblatt zur Aufzeichnung der Anzahl der gekreuzten Rasterlinien, des entsprechenden relativen Relativzusteuerdaten sowie eines Mittels zur Zählung von Verhaltensweisen ist für Datenerfassungszwecke nützlich. Siehe Abbildung 2 Beilage für eine herunterladbare PDF-Version dieser Abbildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentatives pLmV-Experiment und Datenblatt.
(A) Eine Kamera sollte über der 10 cm Petrischale platziert werden, die für den pLmV-Test verwendet wird, so dass das planare und das volle 0,5 cm Raster unter der Schale deutlich sichtbar ist. Der vollständige pLmV-Lauf sollte aufgezeichnet werden (Abbildung 3A Supplement) und (B) die Anzahl der Rasterlinien, die jede Minute in eine vorbereitete Datentabelle eingefügt werden. Die gesammelten Gesamtgitterlinien sollten ausgezählt werden, und dann sollten diese in die Anzahl der akkumulierten Linien umgewandelt werden, die relativ zum entsprechenden Quellwasserkontrollwurm gekreuzt werden. Die Daten in der Tabelle (B) entsprechen den Zählungen anhand des Zusatzvideos (Abbildung 3A Supplement). Entsprechende Kontrollzahlen werden nicht angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Graphiken von Stimulans- und Entnahmedaten.
Die Forscher sollten geschult werden, die pLmV-Assay-Rasterlinien zu verwenden und zu bewerten, indem sie Quellwasser allein vor dem Experimentieren verwenden. Typischerweise reisen Planarier etwa 25 Gitterlinien in 3 Min. (A) Daten von vier Benutzern werden angezeigt, die jeweils 10 Quellwasserregelwürmer haben. Um die Wirkung eines Reagenzes auf die planare Beweglichkeit zu erkennen, werden mit dem pLmV-Assay eine Reihe von Konzentrationen untersucht und die Gesamtzahl der gekreuzten Gitterlinien relativ zu den entsprechenden Kontrollzahlen bei 3 Minuten untersucht. (B) Steuerdaten werden durch den weißen Balken dargestellt. Die Testdaten werden durch die schwarzen Balken dargestellt, wobei die Konzentrationen in mM verwendet werden. Relativ zu den Kontrolldaten sollten so dargestellt werden, dass sie die gesammelten Daten am besten darstellen. (C) Stimulierende Daten, die durch die blaue Linie/Diamanten dargestellt werden, zeigen einen Anstieg der gekreuzten Rasterlinien, im Vergleich zu (D) Rückzugsdaten, die auch durch die blaue Linie/Diamanten dargestellt werden, zeigen eine abnehmende Neigung von einem anfänglichen Startwert, relativ zu den Steuerdaten, wie die rote Linie/Quadrate in beiden (C und D) zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beobachtung und Dokumentation von Verhaltensdaten.
Planarier im pLmV-Test, die während des Experiments keine Richtungsbewegung beibehalten, aber mit charakteristischen Verhaltensweisen aufhören und sich nicht mehr über die Gitter bewegen, sollten ausgezählt werden. Typische Verhaltensweisen können Anzeigen als "Wander" (A und Abbildung 5A Ergänzung) und "Stop" (B und Abbildung 5B Supplement) umfassen. Diese Zählungen von Verhaltensdaten sollten dargestellt werden, um die Häufigkeit dieser Verhaltensweisen im Vergleich zu allen Tieren, die dieser Produktkonzentration (C) ausgesetzt sind, zu dokumentieren. Gezeigt werden Beispieldaten, die den Prozentsatz von Quellwasserkontrolltieren (Ci) und Tieren, die einem Stimulans (Cii) ausgesetzt sind, mit einem Wanderverhalten (blau), Stopp (rot) oder kein (grünes) Verhalten dokumentieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Ein einfacher und zugänglicher planarer Motilitätstest wird beschrieben, um die Stimulans- und Entzugserscheinungen natürlicher Produkte zu bestimmen. Als Verhaltensmodell ist es notwendig, strenge Protokolle für scoring Bewegung und klare Definitionen von Verhaltensweisen zu haben, um Beobachtungen zwischen verschiedenen Experimentatoren zu standardisieren. Die vorgestellten Ideen zeigen, wie dies erreicht werden kann. Jedes Labor, das dieses Protokoll verwendet, sollte die vorgelegten Informationen an die Auswirkungen des zu prüfenden Produkts anpassen. Es wird empfohlen, den Arbeitsbereich sorgfältig einzurichten, um sicherzustellen, dass Tests unter einheitlichen Bedingungen von jedem an der Studie beteiligten Prüfer durchgeführt werden können (Abbildung 1). Standardisierte Aufzeichnungsblätter können zusammengestellt werden, um die Genaue Aufzeichnung und Datenerfassung über Beweglichkeit und Verhalten zu unterstützen(Abbildung 2 und Abbildung 3B).
Motilitätstests sollten zu verschiedenen Tageszeiten durchgeführt werden, indem möglichst verschiedene Chargen von Planariern verwendet werden, um divergierende inhärente zirkadiane Aktivitäten zu berücksichtigen. Obwohl diese Analysen nicht durchgeführt wurden, wird vorgeschlagen, dass die Forscher überwachen, wie der planarische zirkadiane Rhythmus die Beweglichkeit beeinflussen könnte, indem sie Planarier mit einem Standard-Licht-Dunkel-Zyklus (z. B. 12/12) aufrechterhalten und bei der Durchführung des pLmV-Tests Standardlichtbedingungen verwenden und die Tests zur gleichen Tageszeit32,33,34ausführen. Die Forscher sollten die Mechanik des pLmV-Assays üben und lernen, Rasterlinien zu zählen, um sowohl den Umgang mit den Planariern als auch die Bewertung der planarischen Beweglichkeit zu standardisieren (Abbildung 3). Dies sollte mit unverfälschten Quellwasserkontrollen erfolgen. In der Regel werden Daten nach 10-20 solchen Übungsläufen für alle Labormitglieder zum Standard. Zählt nach einer eingestellten pLmV-Zeit sollte ausgewählt werden, um den Fortschritt beim Erlernen des Assays zu vergleichen. Die Ermittler beobachten in der Regel etwa 24 Gitterlinien, die im pLmV-Test im Quellwasser nach einer 2 min Gewöhnung im Quellwasser durch 3 min gekreuzt werden(Abbildung 4A; repräsentative Daten für vier Prüfer mit jeweils 10 zufälligen Quellwasserkontrollen; 24,8 ± 4,8 Gitterleitungen). Zwei oder drei ausgebildete Prüfer, die jeden Testsatz durchführen, können die Zuverlässigkeit der Ergebnisse weiter verbessern, da alle benutzerspezifischen Auswirkungen auf die Methode und die Anzahl bei der Fehleranalyse berücksichtigt werden können. Auf diese Weise können Tests und Zählungen zwischen den Prüfern ausgetauscht werden, so dass Zählungen "blind" zu den experimentellen Bedingungen durchgeführt werden können. Um die Wahrscheinlichkeit von Verzerrungen zu verringern, könnten verschiedene Personen statistische Tests an den Zähldaten durchführen und die nachfolgenden Analysen durchführen. Außerhalb des Vorhandenseins des zu prüfenden Produkts sollten Umweltschwankungen in der Wasserqualität wie Temperatur und pH-Wert vermieden werden. Da Planarier lichtempfindlich sind, sollte die Einrichtung des Experiments sicherstellen, dass die Beleuchtung des Arbeitsbereichs gleichmäßig ist. Da Planarier gelernte Verhaltensweisen aufweisen können, sollte jeder Wurm, einschließlich Steuerelementen, nur einmal26,27verwendet werden.
Es ist nützlich, eine experimentelle Checkliste im Labor zu haben, wenn mehrere Experimentatoren mit dem Test arbeiten, insbesondere in einem Forschungslabor, um häufige Fallstricke zu vermeiden, die beim Ausführen des pLmV-Tests auftreten können, was sich auf den statistischen Wert der Ergebnisse auswirken würde. Alle Lösungen sollten bei Raumtemperatur sein, da die planare Beweglichkeit bei niedrigeren Temperaturen reduziert wird. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Proben 5-10 Tage vor ihrer Verwendung verhungern und dass jede Probe vollständig ausgebildet ist, mit einem vollständig pigmentierten Kopf und Schwanz. Es wird auch vorgeschlagen, dass spezielle flache oder runde Aquarellpinsel (Nummer 3–6), Wohnbehälter und Petrischalen für jede experimentelle Konzentration verwendet werden, um den Arbeitsablauf für den Experimentator reibungsloser zu gestalten. Die Technik der Übertragung der Planarier mit kleinen flachen oder runden Aquarellpinsel sollte von den Forschern ausgiebig geübt werden, um eine effiziente Übertragung der Würmer zwischen Behältern zu gewährleisten, ohne die Tiere zu verletzen oder zu beunruhigen (siehe Diskussion oben; Abbildung 4A). Der Einsatz dieser Pinsel minimiert den Flüssigkeitstransfer zwischen den Behältern und reduziert die potenzielle Belastung der Planarier. Planarier können jedoch durch die Borsten beschädigt werden, wenn die Fasern ausgebreitet oder ausgespreizt werden, wenn sie das Tier kontaktieren.
Da der pLmV-Test auf Verhaltensdaten basiert, ist es wichtig, einen ausreichend großen Datensatz zu verwenden, um robuste Daten trotz angeborener Wurm-zu-Wurm-Antwortvariabilität sicherzustellen. Daher verwenden die meisten Laboratorien mindestens neun bis zwölf Planarier, um jede Konzentration des untersuchten Produkts zu testen, insbesondere weil naturelle Produkte möglicherweise keine so ausgeprägte Wirkung haben wie Standardarzneimittel1,2,3,4,5,6,7,13,14,15,16,35,36. Die Anzahl der pro Minute gekreuzten Rasterlinien wird relativ zu den Quellwasserkontrolldaten für jeden Testtag und jede Testzeit berechnet. Diese Daten werden für jede Testkonzentration für jede Minute gemittelt und mit den Steuerdaten sowie mit anderen zeitgleichen Konzentrationen verglichen, die sowohl die T-Tests von Student als auch ANOVA verwenden.
Der pLmV-Test ist auf Studien von Reagenzien ausgerichtet, die die Beweglichkeit der Planarien für die Dauer der Testzeit beeinflussen. Detaillierte Studien über planare Bewegungen können mit einer Reihe anderer in der Literatur beschriebener4,35,36,37,38. Daher ist es ratsam, eine Reihe von Gewöhnungsexperimenten durchzuführen, um zur Kenntnis zu nehmen, wie die Planarien auf das Testreagenz mit einer Reihe von Konzentrationen reagieren und alle Auswirkungen mit dem Verhalten der Würmer im Quellwasser vergleichen, bevor sie Verhaltenstests beginnen. Auf diese Weise kann der entsprechende Verhaltenstest ausgewählt werden, um die individuellen Manierismen zu untersuchen, die durch das Reagenz auf dem Planarier induziert werden. Die Planarier können in verschiedenen Konzentrationen des Reagenzes für 5-10 min platziert werden, um festzustellen, ob eine Konzentration es ihnen erlaubt, ihr typisches Schwimmverhalten aufrechtzuerhalten. Verhaltensweisen, die keine Beweglichkeit zulassen, wie z. B. Verhaltensweisen, die zu einem C-Typ führen, oder krampfhaftes oder anfallsähnliches Verhalten standen im Mittelpunkt von Studien, die verschiedene Arten von Verhaltensanalysen verwenden, die auf diese Methode angewendet werden können.4,39,40. pLmV-Analysen können mit einer Reihe von Konzentrationen nach kurzen Gewöhnungszeiten und der Anzahl der mit 3 min gekreuzten Gesamtrasterlinien im Vergleich zu Denkwasserkontrollen vor der Stimulation des Zeitverlaufs und den Entnahmeanalysen durchgeführt werden (Abbildung 4B)1,2,3,4,5. Die Ermittler werden ermutigt, andere Zeiten, wie 15, 30 und 60 min, zu testen, um zu sehen, ob sich die Stimulationsdynamik mit der Belichtungszeit ändert.1. Wie berichtet, halten im Frühjahr Wasserregelwürmer eine stetige, vorwärts gerichtete horizontale Bewegung für die 10 min Assay-Zeit aufrecht.1,4. Im Gegensatz dazu können produktbehandelte Würmer ihre Richtungsmotilität während des Testes anhalten und beenden und keine Gitterlinien mehr kreuzen. Der Prüfer kann beurteilen, ob die Dauer des experimentellen pLmV-Laufs begrenzt werden soll, oder ob er ein Mittel zur Bewertung dieser Verhaltensweisen wie beschrieben ableiten soll. Es ist jedoch wichtig, die Häufigkeit dieser Verhaltensweisen zu bewerten, da sie zusätzliche Daten liefern, die die Beweglichkeit beeinflussen. Motilitäts- und Bewegungsdaten werden vor Ort getrennt diskutiert, da die Kombination der Informationen die Bewertung solcher Daten verwirrt.4,35,36,37,38. Als Beispiel wurden zwei Verhaltensweisen beobachtet, wenn die Würmer während des Testes anhielten und keine Gitterlinien mehr kreuzten. Diese Bewegungen werden als "Wandern" (Abbildung 5A Und Abbildung 5A Ergänzung) und "Stop" (Abbildung 5B Und Abbildung 5B Ergänzung). Die Häufigkeit dieser Verhaltensweisen wird als Prozentsatz aller Tiere, die der jeweiligen Produktkonzentration ausgesetzt sind, zusammen mit den Kontrolldaten (Abbildung 5C). Wichtig ist, dass zufällige Verhaltensweisen, die den Planarier nicht daran hindern, Gitterlinien zu überqueren, in die pLmV-Analyse einbezogen werden, auch wenn diese Bewegungen den stetigen Fortschritt der Tiere behindern (Abbildung 4B, 3 mM und 10 mM Bar). Wie bereits erwähnt, haben die Ermittler eine Reihe von Verhaltenskategorien beschrieben, die über den Rahmen dieser Diskussion des pLmV-Motilitätsprotokolls hinausgehen.4,35,36,37,38.
Der pLmV-Test stützt sich auf die Wasserlöslichkeit der untersuchten Ware. Viele dieser Stoffe sind jedoch nicht vollständig in Wasser löslich, und als solche können nur die wasserlöslichen Teile mit diesem Test getestet werden, während der Rest aus der Lösung gefiltert werden muss, wie es in früheren Arbeiten getan wurde1. Wenn pLmV-Assays mit Reagenzien durchgeführt werden, die mit anderen Lösungsmitteln als Wasser verlupft werden, erfordern diese zusätzlich zur Quellwasserkontrolle eine volumenäquivalente Kontrolle. Obwohl diese Methode bei solchen Stoffen nicht angewendet wurde, sollten solche Vektorkontrollen wahrscheinlich als Test behandelt werden, und die Beweglichkeit wurde wie jede andere Prüfsubstanz im Vergleich zu Kontrollen bewertet. Ein weiteres mögliches Mittel, um nicht lösliche Substanzen zu testen, wäre, sie den Planariern zu füttern, indem sie sie in Lebensmittelgele mischen. Diese Technik wird verwendet, um siRNA an Planarier in Gen-Knock-down/RNAi-Experimenteneinzuführen 41. Die Fütterung von Bioprodukten und siRNA stellt jedoch Komplikationen in diesem Test dar, da die Planarier nicht ausgehungert würden und nicht innerhalb einer standardisierten Zeit in den Motilitäts-Assay-Behälter übertragen werden können, die eine gleichmäßige Exposition oder Aufnahme des untersuchten Produkts durch die Versuchstiere vor der Prüfung gewährleistet.
Sobald Stimulans und Entzugsdynamik mit dem pLmV-Assay etabliert sind, können weitere Experimente Komodulatoren, die Einführung von siRNA, sowie biologische Signalmodifizierer oder Medikamente, um für die Augmentation oder Hemmung der beobachteten Motilitätseffekte im Vergleich zu den ersten Ergebnissen gesammelt, wenn diese Biomodulatorennicht,1 ,3. Zum Beispiel könnte die Downregulation der Expression eines Gens oder das Hinzufügen von Signalweginhibitoren die Bewegungsgeschwindigkeit verringern, während andere die Dynamik des Entzugs verändern können. Durch die Beobachtung veränderter pLmV-Ergebnisse können diese zusätzlichen Experimente Einblicke in die zugrunde liegende Physiologie geben, die von einem Naturprodukt oder einem anderen Testreagenz5,42,43,44beeinflusst wird.
Das beschriebene Verfahren ist jedem Labor zugänglich, das an der Bestimmung der Stimulans- und Entzugserscheinungen einer Vielzahl von Biomodulatoren interessiert ist, darunter viele natürliche Produkte. Zu den Vorteilen der Anwendung des planaririschen pLmV-Tests gehört, wie kostengünstig und einfach diese Tiere zu warten sind und dass sie auch Gegenstand anderer planarbasierter Assays sein können, um ein breites Verständnis der physiologischen Auswirkungen des untersuchten Produkts zu vermitteln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren möchten das Büro von Institutional Advancement und die Morrisville College Foundation für ein Publikationsstipendium zur Unterstützung dieser Arbeit sowie das SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) für ihre laufende Unterstützung und Unterstützung der Bachelor-Forschung bei SUNY Morrisville würdigen. Wir möchten auch Sophia Hutchens für die hilfreichen Kommentare zu der beschriebenen Technik danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
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