Summary
プラナリアン運動は、湧水単独で動物の動きと比較した場合の天然物の覚醒剤および離脱特性を測定するために使用されます。
Abstract
非寄生プラナリアンを使用する簡単で制御可能な手段、 ドゥゲシアティグリナ、自由に生きている水生扁平虫は、天然物の覚醒剤および離脱特性を研究するために記述されている。プラナリアン生理学のユニークな側面から恩恵を受ける実験的アッセイは、創傷治癒、再生、および腫瘍形成に関する研究に適用されてきた。また、プラナリアンは様々な環境刺激に対する感受性を示し、条件付き応答を学習・開発することができるため、学習や記憶を調べる行動研究にも利用できます。プラナリアンは、基本的な二国間対称性と神経伝達物質システムを使用する中枢神経系を有し、神経筋バイオモジュレーターの効果を調べる研究に適している。その結果、物質中毒や撤退を調べるために、プラナリアンの動きや運動性を監視する実験システムが開発されました。プラナリアン運動は、刺激の影響を監視する敏感で簡単に標準化された運動アッセイシステムの可能性を提供するため、プラナリアン運動速度(pLmV)試験は、時間とともに動物が交差するグリッド線の数を決定することによって、プラナリアンによる刺激と撤退の両方の行動を監視するように適応されました。ここでは、技法とその応用を示し、説明します。
Introduction
記載されたプロトコルは、自然物質の生体調節効果を評価する手段を提供するためにプラナリアン運動性を使用しています。これらの物質が覚醒剤として機能するかどうか、そしてそれらが測定可能な離脱行動1に関連していたかどうかを判断するために具体的に適応された。このアッセイは、プラナリアン・ロコモーター速度(pLmV)試験として知られており、まず、既知の薬理学的薬剤22,3を試験するために用いられた。このプラナリアン運動性に基づくアッセイの適用は、その後人気が高まり、天然物以外の物質に興味を持つ異なる研究所で採用されています4,5.このアッセイのために、プラナリアンは、溶解したバイオモジュレーターを含む湧水または湧水を含むペトリ皿に置かれる。皿自体はグラフ紙に載せているので、容器のまわりに動物が交差するグリッド線の数は、各条件の移動速度を決定するために使用することができる。ライト/ダークテストは、条件付き場所優先試験(CPP)と呼ばれる、平面運動性を監視するテーマの別のバリエーションであり、動物が暗い環境にどれだけ速く反応し、暗くなった環境に移行するかを評価する66,7。7プラナリアンの動きのビデオ追跡は、コンピュータプログラムと質量の中心(COM)追跡898、9、10、1110,11を使用して分析することもできます。,
このような研究のための動物モデルとしてプラナリアンを使用すると、実験者が簡単にアッセイ環境を制御することができるという点で、他の動物よりもいくつかの利点を提供しています。具体的には、実験前にプラナリアンを飢えさせることで、結果を混乱させる可能性のある他の栄養学的または薬理学的薬剤への暴露を防ぐことができ、調査中の特定のバイオモジュレーターは、培養水に直接添加するだけでプラナリアンに導入され、それによって暴露を標準化することができる。プラナリアンは「高次」動物を連想させる神経系および神経伝達物質を有するため、これらの動物の神経筋刺激に対する生理学的および実験的反応は、他の生物12、13、14、15、16に生物学的に関連すると考えられている。12,13,14,15,16また、プラナリアンは比較的安価で実験室での維持が簡単であるため、多くの研究者にアクセス可能な生物学的モデルを提供します。
実験動物として、プラナリアンは幅広い研究に適している。例えば、我々のグループは、他の研究者と同様に、プラナリアンを使用して、腫瘍形成17、18、1918,19を研究する。17また、プラナリアンは、化学、熱、重力、電気、写真、磁気刺激など、他のアッセイシステムの基礎を形成する多くの応答挙動を示しています。これらの効果のいくつかは、これらの動物の学習と記憶を研究するために使用されています20, 21,,22,,2123,,24,,25,26, 27.,27現在の文献におけるプラナリアンモデルの主な使用は、ネオブラストと呼ばれるプラナリアン多能性幹細胞の活性と、再生28、29、3029,30におけるそれらの役割に焦点を当てている。28したがって、ここで説明するモデルを採用することで、他のプラナリアンベースのアッセイを使用して、天然物やその他のバイオモジュレーターが生物にどのような影響を与えるかをより広く理解することができます。
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Protocol
1. プラナリアンの夫
- 必要に応じて、生物学的供給会社から購入したプラナリアンや野生捕獲を使用します。このプロトコルで使用されるプラナリアンは、供給リストに記載されているドゥゲシア・ティグリナです。この種はジラルディア・ティグリナ31とも呼ばれる。他の水生プラナリアン種も22,3を3受け入れられます。
注: 記載されているプロトコルは、生物供給会社から購入した動物を対象にしています。このアッセイシステムは、野生捕獲されたプラナリアンでテストされていません。しかし、野生のプラナリアンを使用する場合は、実験で使用される水と、使用前の少なくとも1週間は実験室環境に慣れすることをお勧めします。 - 到着時に、きれいな湧水を含むプラスチック製の食品貯蔵容器にプラナリアンを転送し、蓋をアジャールに保ちます。
- 暗い環境でプラナリアンを維持する。
- 新しい環境で24-36時間後に新しく配達されたプラナリアンにフィードします。
- プラナリアンが実験の少なくとも1週間前に実験室に順応することを許可する。
- 週に2回のスケジュールでプラナリアンにフィードします。
- プラナリアンが刻んだ有機ゆで卵またはブレンドした有機牛肉の肝臓に1〜2時間アドリビタムを与えることを許可します。
- 餌を与えた後、きれいな容器に供給されたプラナリアンを置きます。
- プラナリアンから汚れた水を取り除きます。
- 小さな平らな水彩絵筆(3~6番)を使って、プラナリアンの周りから容器に付着した食品の破片やスライムをペーパータオルに移します。
- 新鮮な湧き水と穏やかな渦巻きや攪拌で、プラナリアンを取り除き、きれいな容器に注ぎます。
- 容器に付着した平面は、丸い水彩絵筆(番号3~6)を使用して移管するか、広いボアでピペットを移管することができます。
- 転写水をデカントします。
- 平坦な湧水でプラナリアンを覆います。
- 24時間後、上記のようにきれいな容器に移すことによって、排出された食品廃棄物からプラナリアンを取り除きます(ステップ1.6.2.1-1.6.2.6)。
- プラナリアンの夫に使用される容器や調理器具をきれいにするために、石鹸や洗剤を使用しないでください。きれいな水(水道水は許容範囲)できれいに洗い流し、清潔な布やペーパータオルで乾燥させて、これらのアイテムをきれいにしてください。
2. 実験のためのプラナリアンの準備
- 新しく納入されたプラナリアンが実験の少なくとも1週間前に環境に順応することを許可する。
- 実験の前に5〜10日間、プラナリアンを飢える。
- 飢餓期間中に少なくとも1倍の培養水を変更します。
3. 平坦な運動速度(pLmV)試験:覚醒剤の挙動
- 実験の前に、完全で色素沈着した頭と尾で、飢えたプラナリアンが完全に形成されていることを確認してください。
- 実験を開始する前に、ガラスまたはプラスチック10cmペトリ皿とpLmVテスト用の習慣容器を準備します。
- プリラミネートグリッドペーパー(0.5cm角)上のpLmV試験に使用する、直径10cmのペトリ皿を清潔にしてください。
- pLmV試験に使用する直径10cmのペトリ皿に、制御用の20mLの非大人定湧水、または試験される天然物の適切な濃度を含む湧水を加えます。
- 実験中にグリッドペーパー上の平面運動性を記録するために、調製された直径10cmのペトリ皿の上にカメラ(例えば、携帯電話または高解像度カメラ)を配置します。リングスタンドは、10 cmのペトリ皿とグリッドラインの全体のビューを記録できる距離にカメラを配置するための便利な方法です。
- 5~10 mLの無水湧水(コントロール)、または試験対象の天然物の適切な濃度を含む湧水を用いて、慣れ歯液を用意します。シンチレーションバイアルまたは小さい5cmペトリ皿に類似した容器が適当である。
- 小さくて清潔で平らな、丸い水彩絵筆を使用して、平水を備えたストックコンテナから、試験中の天然物を含む5〜10mLの耐用容器にプラナリアンを優しく移します。
注: pLmV アッセイのプラナリアンを操作する場合は、小さくて清潔で平らな水彩画の絵筆(3~6番)を使用してください。プラナリアンを動かす場合、ブラシは動物の下に置いてそっと持ち上げる必要があります。ブラシを使用する際にプラナリアンが損傷しないように、ブラシの毛は動物の下で吹き飛ばされるべきではありません。毛の毛から広がると、ブラシの繊維の間に挟まれば、プラナリアンに害を与える可能性があります。
注:広いボア転送ピペットは、清潔で乾燥した習慣化容器にプラナリアンを移すためにも使用できます。- ピペットを使用する場合は、移管ピペットを使用して習慣化容器からプラナリアンと一緒に移動した余分な水を除去する。
- プラナリアンを含む習慣容器に習慣化液(すなわち、試験される天然物の濃度を含む制御用の湧水または湧水)を慎重に加える。
- 習慣的期間は、試験される天然物について評価される刺激ダイナミクスに依存する。2分の習慣時間は、この仕事1で刺激を検出することが許容可能であることが判明した。
- 2分慣れ期間に続いて、水彩絵筆を使用して、pLmV刺激実験のために準備された10cmのペトリ皿の中央にプラナリアンを穏やかに移します。
- プラナリアンの動きを記録するためにカメラを起動します。ビデオの10-11分を記録します。
- 各プラナリアンのための新鮮なソリューションでpLmV実験のための習慣化容器と10センチペトリ皿を準備します。
- 実験中に誤ってプラナリアンを間違った溶液に露出させないように、試験中の天然物の実験濃度ごとに専用のピペット、皿、容器、およびペイントブラシを使用してください。
- プラナリアンは学習した行動を示すため、各プラナリアン(制御またはテスト)は21、22,22回1回しか使用できません。
4. 平坦な運動速度(pLmV)テスト:離脱行動
- 実験の前に、完全で色素沈着した頭と尾で、飢えたプラナリアンが完全に形成されていることを確認してください。
- pLmV実験用に10cmのペトリ皿(ガラスまたはプラスチック)、プラナリアンの後の習慣をすすくうための5cmのペトリ皿(ガラスまたはプラスチック)、および実験を開始する前に習慣化容器を準備する。
- 0.5 cmの正方形のプリラミネートグリッドペーパー上のpLmV実験に使用されるきれいな10 cm直径のペトリ皿を置く)。
- pLmV実験に使用する直径10cmのペトリ皿に20mLの無帯水を加えます。
- 実験中にグリッドペーパー上の平面運動性を記録するために、ステップ3.2.3のように準備された直径10cmのペトリ皿の上にカメラを置いて、グリッドペーパーの上にプラナリアンの運動性を記録します。
- 5cmペトリ皿に5mLの湧水を一人で加えて、プラナリアンリンス容器を用意します。
- 5~10 mLの大人げない湧水(コントロール)または試験中の天然物を含む湧水を使用して、慣れ歯を作ります。シンチレーションバイアルまたは小さい5cmペトリ皿(ガラスまたはプラスチック)に類似した容器が適当である。
- 小さくて清潔で平らな水彩画の絵筆を使用して、平水から5~10mLの未集水(コントロール)または試験対象の天然物を含む湧水を備えた調理済みの習慣容器にプラナリアンを移します。動物をストックコンテナから習慣容器にそっと動かします。ブラシでプラナリアンが破損していないことを確認します。
注: pLmV アッセイのプラナリアンを操作する場合は、小さくて清潔で平らな水彩画の絵筆(3~6番)を使用してください。プラナリアンを動かす場合、ブラシは動物の下に置いてそっと持ち上げる必要があります。ブラシを使用する際にプラナリアンが損傷しないように、ブラシの毛は動物の下で吹き飛ばされるべきではありません。毛の毛から広がると、ブラシの繊維の間に挟まれば、プラナリアンに害を与える可能性があります。
注:広いボア転送ピペットは、清潔で乾燥した習慣化容器にプラナリアンを転送するために使用することができます。- ピペットを使用する場合、プラナリアンと一緒に移動した余分な水は、移管ピペットを使用して習慣容器から取り除く必要があります。
- プラナリアンを含む習慣容器に習慣化液(すなわち、試験中の天然物を含む制御用の大人げない湧水または湧水)を慎重に加える。
- 撤退のための習慣期間は、試験されている天然物のために評価される刺激ダイナミクスに依存します;2-5分は十分に証明されています。
- 慣れ継ぎ期間に続いて、水彩画の絵筆を使用して、平水を含む準備された5cmのペトリ皿にプラナリアンを穏やかに移し、習慣化容器から天然物を洗い流します。ブラシでプラナリアンが破損していないことを確認します。
- pLmV離脱実験のために、すぐに水を含む調製された10cmペトリ皿の中央にプラナリアンを移します。ブラシでプラナリアンが破損していないことを確認します。
- プラナリアンの動きを記録するためにカメラを起動します。ビデオの10-11分を記録します。
- 各プラナリアンのための新鮮なソリューションを用いて、習慣化容器、すすい容器、およびpLmV実験のための10 cmペトリ皿を準備します。
- 実験中に誤ってプラナリアンを間違った溶液に露出させないように、試験中の天然物の実験濃度ごとに専用のピペット、皿、容器、およびペイントブラシを使用してください。
- プラナリアンは学習した行動を示すため、各プラナリアン(制御またはテスト)は26、27,27回のみ使用します。
5. データ分析
- pLmV の実行中に毎分交差するグリッド線の数として、平面の動作と運動性を文書化するデータ収集テーブルを準備します。この表では、平坦化によって交差する 1 分あたりの累積行数も文書化できる必要があります。「放浪」や「停止」など、実験期間中の行動の観察を集計するためのノートの行と定義の表を含めます( 説明を参照)。
- ビデオを使用して、1 分間に 1 分間に planarian が交差するグリッド線の数を 10 分間カウントし、その数をデータ テーブルに記録します。標準的な平面の動作は、連続速度、順方向、水平移動、周期的な回転、および停止なしで構成されます。
- プラナリアンが10cmのペトリ皿に移すために使用される絵筆から移動した時点で実験を開始します。この開始時刻を記録します。
- 動物が完全なグリッド正方形を横切るタイミングを決定するには、頭に焦点を合わせ、頭が正方形を完全に横切るときに1行を獲得します。
- ワームが皿の端の周りを移動したときに完全なグリッドを獲得するには、皿の余白から伸びる線を参照して0.5cmの距離を視覚化します。プラナリアンがボックスの角を横切る場合は、2 番目の線を参照して 1 本のグリッドラインをスコア付けします。繰り返しますが、頭に焦点を当ててこれらの決定を行います。
- データを記録するには、毎分経過してビデオを停止します。
- ビデオを再起動して次の分をカウントする際に、ビデオが停止したときにワームの頭部がグリッドラインの間にあった場合は、最初の線を完全なボックスとして記録します。
- 10分間交差するグリッド線の数をスコア。
- 動物がpLmVテスト中に動きを止め、10分の記録時間中にグリッドラインを横切らなくなった場合は、行動チャート(例えば、「さまよう」または「停止」)でプラナリアンの動作を文書化します。pLmVアッセイ中に前方追跡を停止する動物は、代わりに注意し、データは、その試薬濃度にさらされた動物の総数の頻度として提示する必要があります。習慣期の前進の動きを妨げるコイル化または痙攣行動(C挙動と呼ばれる)は、pLmVアッセイが運動性に基づいているため、天然物の濃度がpLmVアッセイでの使用に適していないことを示している。C 型の動作は、異なるタイプの分析を使用して分析できます (「 ディスカッション」を参照)。
- 可能であれば、試薬がプラナリアン生理学に及ぼす全体的な影響を決定する場合は、少なくとも9〜12のワームを使用して、1日の異なる日と異なる時間に天然物の複数の実験濃度をテストします。しかし、研究者が概日リズムによる変動を減らそうであれば、時間指定の明暗サイクルで培養され、給餌時間を設定するワームを使用して、一定の時間に一定の照明で実験を行うことができます。プロジェクトに少なくとも 2 人の実験者を参加させ、1 つの個別レコード データを持つオプションを選択できるようにし、2 番目の個人はグリッド線をデータ収集に使用される条件に 「ブラインド」とカウントします。データ収集に関与する個人が異なるだけでなく、統計計算や分析も、可能なバイアスを減らします。
- 各日の自然製品濃度ごとのグリッド線数を、毎分の制御カウントに対する相対的な値として計算し、異なる日、時間、および実験者のデータを組み合わせることができます。これらのデータは、学生のT検定を使用して平均化し、分析することができます。各試験のP値は、対照と比較して、試薬濃度の間で毎分評価することができる。異なる実験濃度から得られたデータセットを用いたANOVA評価は、さらなる分析方法を提供します。
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Representative Results
実験を開始する前に、pLmVアッセイを実行するためのワークスペースの設置と準備を行う必要があります。これには、習慣化容器の調製、必要に応じて容器のすき取り(離脱実験用)、層皿を積層グリッド紙、および適切に配置されたカメラを含む(図1)。すべてのビデオを撮影したら、共通のデータシートを使用して、調査員間のデータ収集とプレゼンテーションを標準化することをお勧めします(図2 と 図2補足)。
カメラをセットアップすると、実験の間の動物の進行状況を正確に評価できるように、プラナリアンとグリッドペーパーを明確に表示できる必要があります(図3A と 図3A補足)。データ収集には、交差するグリッド線の数と、実験の1分間に交差する合計線の合計数を含める必要があります(図 3B)。pLmV解析の間、平面は連続的な速度、前方方向、水平の動き、周期的な回転を有し、止まらない。最初に、最初のグリッド ボックスは、例のビデオで決定された最初の行ではなく、1 としてスコア付けする必要があります。プラナリアンがpLmV皿に移すために使用される絵筆を含まない後の方向運動の開始時間を記録し、その後1分間に従うことが重要です。プラナリアンが分の時間にボックスを通る途中の一部である場合、ビデオを再起動した後に交差した次のグリッド線は、完全なボックスとしてカウントする必要があります。 動物が皿の端の周りを移動するとき、彼らは0.5センチメートルの距離を決定するために皿から伸びてラインを参照してください。ワームが箱の隅に遭遇した場合、2本目の線を参照して1本のグリッドラインをスコア付けします。常に頭に焦点を当てて、これらの決定を行います。プラナリアンが狭い領域をカバーし始めた場合、実験者は再びワームの頭部に従って、完全なグリッドボックスの距離を監視する必要があります。この動作の例は、補足ビデオ (図 3A 補足)に含まれています。
各試行の結果を標準化するには、pLmV の実行を計算し、マッチング制御ワームの進行に対して交差するボックスの数としてプロットする必要があります (図 3B)。各ユーザーは、対象の試薬を使用してテストを開始する前に、アッセイとカウントグリッドラインを実行するように訓練する必要があります。ベンチマークとして、実験用のセットアップを使用して、湧水中のプラナリアンは通常、約24箱を3分でカバーします(図4A;4ユーザーからのデータ、平均24.8±4.8)。テスト試薬濃度の範囲を調べて、それぞれに使用する行動分析の種類を決定する必要があります。pLmV分析の場合、研究者は、動物が露出したときに運動性を示すかどうかを判断する必要があります(図4B)。他のタイプの行動分析は、さまざまなタイプの行動に対してより効果的である可能性があります(説明を参照)。湧水制御に対して、覚醒剤データは、動物が試験試薬の同じ濃度で慣れ親しまれた後、湧水中の試験試薬の所望の濃度でpLmV容器を通過するにつれて交差するグリッド線の増加を示す。対照的に、離脱データは、湧水制御に対して、平坦が湧水を有するpLmV容器を単独で移動する際に、湧水に混合された試薬の所望の濃度に慣れた後、交差する格子線の数の減少を示す(図4Cおよび4D)。特に、他のグループ,2、6による薬物誘発離脱データで観察されているように、明発離脱データは、コントロールのものよりもグリッド数が少2なくなる可能性がある。
スプリング水制御プラナリアンは、実験の期間中、グリッドライン上を移動します。しかし、テストプラナリアンがアッセイ中にグリッドラインを越えるのをやめる可能性があります。この場合、これらのデータは、グリッド線上での進行状況を維持するワームのデータとは別に強調表示する必要があります。これらのデータを、その特定の試薬濃度にさらされた動物の総数の割合として文書化することは、これらの所見の相対的な頻度を示す有効な方法である(図5A-C、図5Aサプリメントおよび図5Bサプリメント )。 これらの動きが動物の着実な進行を妨げるとしても、プラナリアンがグリッド線を越えるのを妨げない行動は、pLmV分析に含まれるべきです。
図1:pLmVアッセイの代表的なセットアップ。
実験室のスペースは、アッセイを開始する前に準備する必要があります。図示は、積層0.5cmグリッド紙の上に置かれた10センチペトリ皿との典型的なセットアップです。ドキュメントカメラは、10cmのペトリ皿の明確なビューがリンクされたコンピュータに記録できるように配置されています。しかし、任意のカメラは、リングスタンドを使用してペトリ皿の上に配置された携帯電話のカメラを含む実験中にプラナリアンの進行状況を記録するために使用することができます。背景には、撤退実験のためにワームを洗いすがる5cmのペトリ皿と、プラナリアンを習慣付けるために使用される小さな白い容器があります。また、背景には、各製品濃度のための専用の丸い水彩絵筆、ピペット、およびペトリ皿にラベルが付けられています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: pLmV データ シート
交差するグリッド線の数を記録する準備済みデータシート、コントロールデータに対応する相対、並びに任意の動作を集計する手段は、データ収集の目的に有用である。この図のダウンロード可能な PDF バージョンについては、 図 2 補足を 参照してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:代表的なpLmV実験およびデータシート。
(A)プラナリアンと皿の下の完全な0.5 cmグリッドがはっきりと見えるように、pLmVアッセイに使用される10cmのペトリ皿の上にカメラを置く必要があります。完全な pLmV 実行を記録する必要があります (図 3A 補足) と (B) 準備されたデータ テーブルに配置された各分を交差するグリッド線の数。合計グリッド線の合計を合計し、これらの線分を対応する湧水制御ワームに対して交差する累積線の数に変換する必要があります。図表のデータ (B) は、補足ビデオを使用したカウントと一致します (図 3A 補足) 。対応する制御カウントは表示されません。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:覚醒剤と離脱データの代表的なグラフ。
研究者は、実験の前に湧水だけでpLmVアッセイグリッドラインを使用してスコアを付ける訓練を受けるべきです。通常、プラナリアンは3分で約25本のグリッドラインを移動します(A)4人のユーザーからのデータが表示され、それぞれに10の湧水制御ワームが表示されます。 試薬がプラナリアン運動性に及ぼす影響を理解するために、pLmVアッセイを用いて一連の濃度を調査し、交差するグリッド線の総数を3分で対応する制御カウントに対して調べる。(B) コントロールデータは白いバーで表されます。テストデータは黒いバーで表され、濃度はmMで使用されます。制御データに対しては、収集したデータを最もよく表すためにプロットする必要があります。(C)青い線/ダイヤモンドで表される覚醒剤データは、交差したグリッド線の上昇を示し、青い線/ダイヤモンドで表されるD(D)引き出しデータは、コントロールデータに対して、初期開始値から減少する傾きを示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:行動データの観察と文書化
実験中に方向の動きを維持しないが、特徴的な動作で停止し、もはやグリッド上を移動しないpLmVアッセイのプラナリアンは集計されるべきです。一般的な動作には、表示が 'wander' (A および 図 5A 補足) と 'stop' (B および 図 5B 補足) が含まれます。これらの行動データの集計は、その産物濃度(C)にさらされているすべての動物と比較して、これらの行動の頻度を文書化するために提示されるべきである。示されているサンプルデータは、湧水制御動物(Ci)の割合を記録し、覚醒剤(Cii)にさらされた動物、放浪者(青)、停止(赤)または無停止(緑)の挙動を有する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
天然物の覚醒剤と離脱効果を決定するために、簡単でアクセス可能なプラナリアン運動アッセイが記載されています。行動モデルとして、異なる実験者間で観測を標準化するために、動きを採点するための厳格なプロトコルと、あらゆる行動の明確な定義が必要です。提示されたアイデアは、これを達成する方法のデモンストレーションを提供します。このプロトコルを使用する各研究室は、テストされる特定の製品の効果に合わせて提示された情報を適応させる必要があります。研究に関与する各調査員が一貫した条件でテストを行えるようにワークスペースを慎重に設定することをお勧めします (図 1)。標準化された記録シートをコンパイルして、正確な記録保持と、運動性と動作に関するデータ収集を支援することができます(図2および図3B)。
運動性テストは、可能であれば、プラナリアンの異なるバッチを使用して、固有の概日活動を発散するために、一日の様々な時間に行われるべきです。これらの分析は行われていないが、調査官は、標準的な明暗サイクル(例えば、12/12)を使用してプラナリアンを維持することによって、プラナリアン概日リズムが運動性にどのような影響を与えるかを監視し、pLmVアッセイを実施する際には、標準的な照明条件を使用し、同じ,33,時間にテストを実行することが示唆されている。研究者は、pLmVアッセイの仕組みを実践し、平面の取り扱いと平面運動性の評価の両方を標準化するためにグリッド線を数えることを学ぶべきである(図3)。これは、大人げない湧水制御を使用して行う必要があります。通常、10~20回の実習が実行されると、データはすべての研究室メンバーにとって非常に標準的なものになります。設定されたpLmV時間後のカウントは、アッセイの学習の進捗状況を比較するために選択されるべきです。研究者は通常、湧水の2分の慣化に続いて、湧水中のpLmVアッセイで約24分を横切るグリッド線を観察します(図4A;それぞれ10のランダムな湧水制御を持つ4人の研究者の代表的なデータ、24.8±4.8グリッドライン)。各テストセットを実施する訓練を受けた 2 ~ 3 人の調査員が、メソッドとカウントに対するユーザー固有の影響をエラー分析で考慮できるため、結果の信頼性をさらに向上させることができます。このようにして、試験とカウントを調査官間で交換して、実験条件に対して「ブラインド」でカウントすることができます。偏りの可能性を減らすには、異なる個人がカウントデータに対して統計的検定を行い、その後の分析を行います。試験される製品の存在の外では、温度やpHなどの水質の環境変動を避けるべきです。プラナリアンは光に敏感であるため、実験の設定は、ワークスペースの照明が均等であることを確認する必要があります。最後に、プラナリアンは学習した行動を示すことができるので、コントロールを含む各ワームは26、27,271回しか使用しないでください。
複数の実験者がアッセイ、特に学部の研究室で試用している場合は、pLmVテストを実行する際に発生する可能性のある一般的な落とし穴を避けるために、実験チェックリストをラボに持つことは有用であり、結果の統計的価値に影響を与えます。プラナリアン運動性は低温で低下するため、すべてのソリューションは室温で行う必要があります。試料が使用の5〜10日前に飢え、各標本が完全に着色された頭と尾で完全に形成されていることを確認するために注意する必要があります。また、専用の平らまたは丸い水彩絵筆(3~6本)、習慣化容器、ペトリ皿を実験集中ごとに使用して、実験者のワークフローをよりスムーズにすることも示唆されています。小さな平らまたは丸い水彩画の絵筆を使用してプラナリアンを転送する技術は、動物に怪我や苦痛を引き起こすことなく、容器間のワームの効率的な移動を確実にするために調査官によって広範囲に実践されるべきです(上記の議論を参照してください。 図 4A)。これらの絵筆を使用すると、容器間の液体の移動を最小限に抑え、平面上の潜在的なストレスを軽減します。しかし、動物に接触したときに繊維が広がったり、吹き出されたりすると、プラナリアンは毛先によって損傷を受ける可能性があります。
pLmV アッセイは行動データに依存しているため、ワーム間の応答の変動が生じ、堅牢なデータを確保するためには十分に大きなデータセットを使用することが不可欠です。そのため、ほとんどの研究所は、検査対象の製品の各濃度をテストするために最低9〜12のプラナリアンを使用しますが、特に天然物は、標準の医薬品,,,,,,11、2、3、4、5、6、7、13、14、15、16、35、362,3として顕著な効果を持っていない可能性があるためです。35,3615,164,514,6713毎分交差するグリッド線の数は、各テストの日と時間の湧水制御データに対して計算されます。これらのデータは、1分ごとに各テスト濃度について平均化され、制御データと比較され、またスチューデントのT検定とANOVAの両方を使用して他の時間一致濃度と比較されます。
pLmVアッセイは、アッセイ時間の間、プラナリアンの運動性に影響を与える試薬の研究に向けられています。プラナリアン運動の詳細な研究は、文献に記載されている他の多くの評価を使用して行うことができます4,35,36,37,38.したがって、一連の習慣的な実験を行い、プラナリアンが様々な濃度を使用して試験試薬にどのように反応するかに注意し、行動テストに着手する前に湧水中のワームの挙動とどのような影響を比較するかを知ることは賢明です。このようにして、適切な行動テストを選択して、試薬によって誘発される個々のマナーをプラナリアン上で研究することができる。プラナリアンは、5〜10分間試薬の様々な濃度に置き、濃度が彼らの典型的な水泳行動を維持することを可能にするかどうかを決定することができます。運動性を許さない行動(C型、痙攣的、発作のような行動など)は、この方法に適用できる別のタイプの行動分析を用いた研究の焦点となっている4,39,40.pLmV分析は、短い習慣時間後の濃度の範囲と、時間経過刺激および離脱分析の前に湧水制御に対して3分で交差するグリッド線の総数を使用して行うことができます(図 4B)1,2,3,4,5.研究者は、刺激ダイナミクスが暴露時に変化するかどうか確認するために、15、30、60分などの他の時間をサンプリングすることをお勧めしています1.報告されているように、湧水制御ワームでは、10分間のアッセイ時間の安定した前方方向の水平移動を維持します。1,4.対照的に、製品処理されたワームは、アッセイ中に指向性運動を停止し、もはやグリッド線を越えなくなる可能性があります。研究者は、実験pLmVの実行の長さを制限するか、または説明したようにこれらの挙動を評価する手段を導出するかを判断することができる。しかし、運動性に影響を与える追加データを提供するため、これらの行動の頻度を評価することが重要です。この情報を組み合わせることで、そのようなデータの評価が混乱するため、運動性と移動データは現場で別々に議論されます。4,35,36,37,38.例として、ワームが停止し、アッセイ中にグリッドラインを越えなくなったときに2つの挙動が観察されました。これらの動きは「放浪」と呼ばれます (図 5A そして 図 5A サプリメント)、および'停止' (図 5B そして 図 5B の補足).これらの行動の頻度は、制御データと一緒に特定の製品濃度にさらされたすべての動物の割合として文書化されています(図5C).重要なことに、これらの動きが動物の着実な進行を妨げるとしても、プラナリアンがグリッド線を越えるのを妨げないランダムな振る舞いをpLmV分析に含めるべきである(図 4B、3 mMおよび10 mM棒)。前述のように、研究者は、運動プロトコルのpLmV率のこの議論の範囲を超えている行動カテゴリの数を説明しています4,35,36,37,38.
pLmVアッセイは、調査中の製品の水溶性に依存します。しかし、これらの物質の多くは水に完全に溶けなくて、水溶性部分のみがこのアッセイによって試験され、残りは前の作業1で行われたように溶液から濾過しなければならない。pLmVアッセイを水以外の溶媒を用いて可溶化した試薬を用いて実行する場合、これらは、湧水制御に加えて、体積相当の制御を必要とする。この方法はそのような物質では使用されていませんが、そのようなベクターコントロールは、おそらくテストとして扱われるべきであり、運動性は他の試験物質と同様にコントロールに対して得点されるべきである。非可溶性物質をテストするもう一つの可能な手段は、それらを食品ゲルに混合することによってプラナリアンに供給することです。この技術は、遺伝子ノックダウン/RNAi実験41におけるプラナリアンにsiRNAを導入するために使用される。しかし、プラナリアンの生物学的産物およびsiRNAを供給することは、プラナリアンが飢えせず、試験前に実験動物によって調査中の製品の同等の暴露または摂取を保証する標準化された時間内に運動性アッセイ容器に移すことができないというこのアッセイに合併症を提示する。
刺激剤および離脱ダイナミクスがpLmVアッセイを用いて確立されると、さらなる実験には、コモドレーター、siRNAの導入、ならびにこれらのバイオモジュレーターを,使用していない場合に収集された初期結果と比較して、観察された運動効果の増強または阻害を検査するための生物学的経路修飾剤または薬物が含まれる可能性がある。例えば、遺伝子の発現を減調したり、経路阻害剤を加えたりすると移動速度が低下し、他の遺伝子は離脱のダイナミクスを変化させる可能性があります。変化したpLmV結果の観察を通じて、これらの追加実験は、天然物または他の試験試薬5、42、43、4442,43によって影響を受ける基礎生理学への洞察を44提供することができる。5
記載された手順は、多くの天然物を含む様々なバイオモジュレーターの覚醒剤および離脱効果を決定することに興味のある任意の実験室に適している。プラナリアンpLmVアッセイの適用の利点は、これらの動物がどれほど安価で容易に維持できること、および調査中の製品の生理学的影響を広く理解するために他のプラナリアンベースのアッセイの対象になることも含まれる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、この研究を支援するための出版助成金のための制度的進歩のオフィスとモリスビル大学財団、およびSUNYモリスビル大学の学部研究の継続的な支援と支援のためのSUNYモリスビル大学科学技術エントリープログラム(CSTEP)を認めたいと考えています。また、ソフィア・ハッチェンスに関する有益なコメントに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
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