Summary
अकेले वसंत पानी में जानवरों के आंदोलन की तुलना में प्राकृतिक उत्पादों के उत्तेजक और निकासी गुणों को मापने के लिए प्लैनेरियन मोटिविटी का उपयोग किया जाता है।
Abstract
प्राकृतिक उत्पादों के उत्तेजक और निकासी गुणों का अध्ययन करने के लिए गैर-परजीवी प्लैनेरियन, डुगेसिया टिग्रिना,एक मुक्त रहने वाले जलीय फ्लैटवार्म का उपयोग करने का एक सीधा, नियंत्रणीय साधन वर्णित है। प्लैनेरियन फिजियोलॉजी के अनूठे पहलुओं से लाभान्वित होने वाले प्रायोगिक परख को घाव भरने, उत्थान और ट्यूमरजीनेसिस पर अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है। इसके अलावा, क्योंकि planarians पर्यावरण उत्तेजनाओं की एक किस्म के प्रति संवेदनशीलता का प्रदर्शन और सीखने और वातानुकूलित प्रतिक्रियाओं के विकास में सक्षम हैं, वे व्यवहार सीखने और स्मृति की जांच अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है । प्लैनेरियन के पास एक बुनियादी द्विपक्षीय समरूपता और एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र होता है जो न्यूरोमस्कुलर बायोमोडुलेटर के प्रभावों की जांच करने वाले अध्ययनों के लिए उत्तरदायी न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम का उपयोग करता है। नतीजतन, पदार्थ की लत और वापसी की जांच करने के लिए प्लैनेरियन आंदोलन और गतिशीलता की निगरानी करने वाली प्रायोगिक प्रणालियां विकसित की गई हैं । चूंकि प्लैनेरियन मोटिविटी उत्तेजनाओं के प्रभाव की निगरानी करने के लिए एक संवेदनशील, आसानी से मानकीकृत गतिशीलता परख प्रणाली की क्षमता प्रदान करती है, इसलिए प्लैनेरियन लोकोमोटर वेग (पीएलएमवी) परीक्षण को समय के साथ जानवरों द्वारा पार की गई ग्रिड लाइनों की संख्या के निर्धारण के माध्यम से प्लानेरियन द्वारा उत्तेजना और निकासी व्यवहार दोनों की निगरानी के लिए अनुकूलित किया गया था। यहां तकनीक और उसके आवेदन का प्रदर्शन कर के समझाया जाता है।
Introduction
वर्णित प्रोटोकॉल प्राकृतिक पदार्थों के जैव-गतिशीलता का आकलन करने का साधन प्रदान करने के लिए प्लैनेरियन मोटिविटी का उपयोग करता है। यह विशेष रूप से यह निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया गया था कि क्या ये पदार्थ उत्तेजक के रूप में कार्य करते हैं, और यदि वे तब एक औसत दर्जे का निकासी व्यवहार 1 से जुड़ेथे। इस परख, जिसे प्लानेरियन लोकोमोटर वेग (पीएलएमवी) परीक्षण के रूप में जाना जाता है, का उपयोग सबसे पहले ज्ञात औषधीयएजेंटों 2, 3,का परीक्षण करने के लिए कियाजाताथा। इस प्लैनेरियन मोटिवेशन आधारित परख के आवेदन की लोकप्रियता बढ़ी है और इसे प्राकृतिक उत्पादों के अलावा अन्य पदार्थों में रुचि रखने वाली विभिन्न प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया गया है4,,5। इस परख के लिए, एक प्लैनेरियन को एक पेट्री डिश में रखा जाता है जिसमें स्प्रिंग वॉटर या स्प्रिंग वॉटर होता है जिसमें घुले हुए बायोमॉडुलेटर होते हैं । क्योंकि पकवान ही ग्राफ कागज पर रखा गया है, ग्रिड लाइनों की संख्या समय के साथ जानवर द्वारा पार के रूप में यह कंटेनर के बारे में चलता है प्रत्येक हालत में आंदोलन की दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रकाश/अंधेरे परीक्षण, अन्यथा वातानुकूलित स्थान वरीयता परीक्षण (सीपीपी) के रूप में जाना जाता है, प्लानेरियन गतिशीलता की निगरानी के विषय पर एक और भिन्नता है, और आकलन करता है कि जानवर कितनी जल्दी प्रतिक्रिया देते हैं और एक अंधेरे वातावरण में स्थानांतरित हो जाते हैं6,,7। कंप्यूटर प्रोग्राम और सेंटर ऑफ मास (कॉम) ट्रैकिंग 8 ,,9,,10, 11का उपयोग करके प्लैनेरियन आंदोलनों की वीडियो ट्रैकिंग का विश्लेषण भी किया जासकताहै।8,
इस तरह के अध्ययनों के लिए एक पशु मॉडल के रूप में प्लैनेरियन का उपयोग करना अन्य जानवरों पर कई फायदे प्रदान करता है जिसमें प्रयोगकर्ता आसानी से परख वातावरण को नियंत्रित कर सकता है। विशेष रूप से, प्रयोग से पहले प्लैनेरियन भूखे अन्य पोषण या औषधीय एजेंटों के संपर्क को रोक सकते हैं जो अन्यथा परिणामों को चकित कर सकते हैं, और जांच के तहत विशिष्ट बायोमॉडुलेटर को सीधे संस्कृति के पानी में जोड़कर प्लैनेरियन से पेश किया जा सकता है, जिससे एक्सपोजर का मानकीकरण हो सकता है। चूंकि प्लैनेरियन में तंत्रिका तंत्र और न्यूरोट्रांसमीटर होते हैं जो 'उच्च-क्रम' जानवरों की याद ताजा करते हैं, इसलिए इन जानवरों की फिजियोलॉजी और प्रयोगात्मक प्रतिक्रियाओं को न्यूरोमस्कुलर उत्तेजनाओं के लिए जैविक रूप से अन्य जीवों12,13, 14,,15, 16,के लिए प्रासंगिक मानाजाताहै।,14, इसके अलावा, क्योंकि प्लैनेरियन प्रयोगशाला में बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती और सरल हैं, वे कई जांचकर्ताओं के लिए एक सुलभ जैविक मॉडल प्रदान करते हैं।
एक प्रयोगात्मक जानवर के रूप में, प्लैनेरियन अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त हैं। उदाहरण के लिए, हमारा समूह, साथ ही अन्य जांचकर्ता ट्यूमरजीनेसिस17, 18,,19का अध्ययन करने के लिए प्लैनेरियन का उपयोगकरते19हैं। प्लानेरियन रासायनिक, थर्मल, गुरुत्वाकर्षण, विद्युत, फोटो और चुंबकीय उत्तेजनाओं के लिए कई प्रतिक्रिया व्यवहार भी प्रदर्शित करते हैं जिन्होंने अन्य परख प्रणालियों का आधार बनाया है। इनमें से कुछ प्रभावों का उपयोग इन जंतुओं में सीखने और स्मृति का अध्ययन करने के लिए किया गया है ,20,21,22,23,24,25,26,27. वर्तमान में साहित्य में प्लानेरियन मॉडल का प्राथमिक उपयोग प्लैनेरियन प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल की गतिविधि पर केंद्रित है, जिसे नियोब्लास्ट कहा जाता है, और28,29,,30के उत्थान में उनकी भूमिका।, इस प्रकार, यहां वर्णित मॉडल को अपनाने से अन्य प्लैनेरियन-आधारित परख का उपयोग करके आगे के अध्ययन की अनुमति दी गई है ताकि प्राकृतिक उत्पादों और अन्य बायोमोडुलेटर्स जीव को प्रभावित करने के तरीके की व्यापक समझ प्रदान की जा सके।
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Protocol
1. प्लानेरियन पशुपालन
- यदि आवश्यक हो तो जैविक आपूर्ति कंपनी या जंगली-पकड़े गए से खरीदे गए प्लानरियंस का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्लैनेरियन डुगेसिया टिग्रिनाहैं, जैसा कि आपूर्ति सूची में सूचीबद्ध है। इस प्रजाति को गिररडिया तिग्रिना31के रूप में भी जाना जाता है । अन्य जलीय योजनावादी प्रजातियां भी स्वीकार्य हैं2,3.
नोट: वर्णित प्रोटोकॉल एक जैविक आपूर्ति कंपनी से खरीदे गए जानवरों के लिए तैयार है। इस परख प्रणाली जंगली पकड़े गए प्लैनेरियन के साथ परीक्षण नहीं किया गया है । हालांकि, यदि जंगली पकड़े गए प्लैनेरियन का उपयोग किया जाता है, तो यह सिफारिश की जाती है कि उन्हें प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले पानी के साथ-साथ उपयोग से कम से कम 1 सप्ताह के लिए प्रयोगशाला वातावरण के लिए आदी किया जाए। - आगमन पर, स्वच्छ वसंत पानी वाले प्लास्टिक खाद्य भंडारण कंटेनरों में प्लैनेरियन स्थानांतरित करें और ढक्कन अजर रखें।
- एक अंधेरे वातावरण में प्लैनेरियन बनाए रखें।
- अपने नए वातावरण में 24-36 घंटे के बाद नए वितरित planarians फ़ीड ।
- प्लैनेरियन को प्रयोग से कम से कम 1 सप्ताह पहले प्रयोगशाला में स्वीकार करने की अनुमति दें।
- एक नियमित रूप से दो बार एक सप्ताह के कार्यक्रम पर planarians फ़ीड ।
- प्लानेरियन को कटे हुए कार्बनिक उबले अंडे या मिश्रित कार्बनिक बीफ लिवर पर विज्ञापन लिबिटम को 1-2 घंटे के लिए खिलाने की अनुमति दें।
- खिलाने के बाद एक साफ कंटेनर में खिलाया प्लैनेरियन रखें।
- प्लैनेरियन से गंदे पानी को हटा दें।
- भोजन के मलबे और कीचड़ को एक कागज तौलिया में चारों ओर से कंटेनर का पालन करने के लिए एक छोटे फ्लैट वाटरकलर तूलिका (संख्या 3-6) का उपयोग करें।
- ताजे झरने के पानी और कोमल घूमता या आंदोलन के साथ, प्लैनेरियन को उखाड़ फेंकना और उन्हें एक साफ कंटेनर में डालना।
- कंटेनर का पालन करने वाले किसी भी प्लैनियन को गोल वाटरकलर तूलिका (संख्या 3-6) या एक विस्तृत बोर के साथ पिपेट स्थानांतरित कर दिया जा सकता है।
- स्थानांतरण पानी को डिकेंट करें।
- प्लानरियंस को साफ स्प्रिंग वॉटर से कवर करें ।
- 24 घंटे के बाद, किसी भी निष्कासित खाद्य अपशिष्ट से प्लानरियंस को ऊपर वर्णित एक साफ कंटेनर में स्थानांतरित करके हटा दें (चरण 1.6.2.1-1.6.6)।
- प्लैनेरियन पशुपालन के लिए उपयोग किए जाने वाले कंटेनर और बर्तनों को साफ करने के लिए, साबुन या डिटर्जेंट का उपयोग न करें। इन वस्तुओं को साफ पानी (नल का पानी स्वीकार्य है) के साथ अच्छी तरह से जोड़कर साफ करें और उन्हें साफ कपड़े या कागज के तौलिया से सुखाएं।
2. प्रयोगों के लिए प्लानरियंस की तैयारी
- नए वितरित प्लैनेरियन को प्रयोग से कम से कम 1 सप्ताह पहले अपने पर्यावरण को स्वीकार करने की अनुमति दें।
- प्रयोग से पहले 5-10 दिनों के लिए योजनावादियों को भूखा।
- भुखमरी की अवधि के दौरान संस्कृति का पानी कम से कम 1x बदलें।
3. प्लानेरियन लोकोमोटर वेग (पीएलएमवी) परीक्षण: उत्तेजक व्यवहार
- प्रयोग से पहले, यह सुनिश्चित करें कि भूखे प्लैनेरियन पूरी तरह से बनते हैं, एक पूर्ण और वर्णक सिर और पूंछ के साथ।
- प्रयोग शुरू करने से पहले पीएलएमवी टेस्ट के लिए एक ग्लास या प्लास्टिक 10 सेमी पेट्री डिश और एक आदत कंटेनर तैयार करें।
- पहले से शुरू ग्रिड पेपर (0.5 सेमी वर्गों के साथ) पर पीएलएमवी परीक्षण के लिए उपयोग की जाने वाली एक साफ 10 सेमी व्यास पेट्री डिश रखें।
- नियंत्रण के लिए 20 एमएल मिलावटरहित स्प्रिंग वॉटर, या प्राकृतिक उत्पाद की उचित एकाग्रता युक्त वसंत पानी को पीएलएमवी परीक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले 10 सेमी व्यास पेट्री डिश में जोड़ें।
- प्रयोग के दौरान ग्रिड पेपर पर प्लानेरियन मोटिविटी रिकॉर्ड करने के लिए तैयार 10 सेमी व्यास पेट्री डिश के ऊपर एक कैमरा (जैसे, सेल फोन या हाई-रेजोल्यूशन कैमरा) रखें। एक रिंग स्टैंड कैमरे को दूरी पर रखने का एक सुविधाजनक तरीका है जो 10 सेमी पेट्री डिश और ग्रिड लाइनों के पूरे दृश्य को रिकॉर्ड कर सकता है।
- 5-10 एमएल के मिलावटी झरने के पानी (नियंत्रण), या प्राकृतिक उत्पाद की उचित एकाग्रता वाले वसंत पानी के साथ एक आदत कंटेनर तैयार करें। प्रस्फुटन शीशी या छोटे 5 सेमी पेट्री डिश के समान कंटेनर उपयुक्त है।
- एक छोटे, साफ, फ्लैट, या गोल पानी के रंग का उपयोग करें धीरे से वसंत पानी के साथ शेयर कंटेनर से एक प्लैनेरियन हस्तांतरण करने के लिए आदत कंटेनर के लिए 5-10 मिलीएल मिलावटी वसंत पानी या प्राकृतिक उत्पाद युक्त वसंत पानी का परीक्षण किया जा रहा है ।
नोट: पीएलएमवी परख के लिए प्लानेरियन में हेरफेर करते समय, एक छोटे, साफ, फ्लैट या गोल पानी के रंग (संख्या 3-6) का उपयोग करें। प्लैनेरियन्स को आगे बढ़ाते समय, ब्रश को धीरे-धीरे उठाने के लिए जानवर के नीचे रखा जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ब्रश का उपयोग करते समय प्लैनेरियन क्षतिग्रस्त न हों, ब्रश के ब्रिस्टल को जानवर के नीचे नहीं खेला जाना चाहिए। ब्रिस्टल से बाहर फैलने से प्लैनेरियन को नुकसान हो सकता है अगर यह ब्रश के फाइबर के बीच पकड़ा जाता है।
नोट: एक विस्तृत बोर ट्रांसफर पिपेट का उपयोग प्लैनेरियन को एक स्वच्छ और शुष्क आदत कंटेनर में स्थानांतरित करने के लिए भी किया जा सकता है।- यदि पिपेट का उपयोग करते हैं, तो स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके आदत कंटेनर से प्लैनेरियन के साथ स्थानांतरित अतिरिक्त पानी निकालें।
- ध्यान से आदत समाधान (यानी, नियंत्रण या वसंत पानी के लिए वसंत पानी प्राकृतिक उत्पाद की एकाग्रता युक्त) को प्लैनेरियन युक्त आदत कंटेनर में जोड़ें।
- आदत अवधि प्राकृतिक उत्पाद का परीक्षण किया जा रहा है के लिए मूल्यांकन उत्तेजना गतिशीलता पर निर्भर करेगा। इस कार्य में उत्तेजना का पता लगाने के लिए 2 मिनट का आदत का समय स्वीकार्य साबित हुआ1.
- 2 मिनट की आदत अवधि के बाद एक वाटरकलर तूलिका का उपयोग करने के लिए धीरे से pLmV उत्तेजना प्रयोग के लिए तैयार 10 सेमी पेट्री पकवान के केंद्र में planarian हस्तांतरण ।
- प्लैनेरियन की आवाजाही को रिकॉर्ड करने के लिए कैमरा शुरू करें। रिकॉर्ड 10-11 मिनट का वीडियो।
- प्रत्येक प्लैनियन के लिए ताजा समाधान के साथ पीएलएमवी प्रयोग के लिए आदत कंटेनर और 10 सेमी पेट्री डिश तैयार करें।
- प्रयोग के दौरान गलत समाधान के लिए अनजाने में प्लानरियंस को उजागर करने से बचने के लिए प्राकृतिक उत्पाद की प्रत्येक प्रयोगात्मक एकाग्रता के लिए समर्पित पिपेट, व्यंजन, कंटेनर और पेंटब्रश का उपयोग करें।
- क्योंकि प्लैनेरियन विद्वान व्यवहार प्रदर्शित करते हैं, प्रत्येक प्लानेरियन (नियंत्रण या परीक्षण) का उपयोग केवल एक बार21,,22में किया जाना चाहिए।
4. प्लानेरियन लोकोमोटर वेग (पीएलएमवी) परीक्षण: निकासी व्यवहार
- प्रयोग से पहले, यह सुनिश्चित करें कि भूखे प्लैनेरियन पूरी तरह से बनते हैं, एक पूर्ण और वर्णक सिर और पूंछ के साथ।
- पीएलएमवी प्रयोग के लिए 10 सेमी पेट्री डिश (ग्लास या प्लास्टिक), प्रयोग शुरू करने से पहले प्लानेरियन के बाद आदत को धोने के लिए 5 सेमी पेट्री डिश (ग्लास या प्लास्टिक) तैयार करें।
- 0.5 सेमी वर्गों के साथ पूर्व व्यापी ग्रिड पेपर पर पीएलएमवी प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली एक साफ 10 सेमी व्यास पेट्री डिश रखें)।
- पीएलएमवी प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली 10 सेमी व्यास पेट्री डिश में 20 एमएल मिलावटरहित स्प्रिंग वॉटर जोड़ें।
- प्रयोग के दौरान ग्रिड पेपर पर प्लानेरियन मोटिविटी रिकॉर्ड करने के लिए चरण 3.2.3 में तैयार 10 सेमी व्यास पेट्री डिश के ऊपर एक कैमरा रखें।
- 5 सेमी पेट्री डिश में अकेले स्प्रिंग वॉटर के 5 एमएल डालकर प्लैनेरियन कुल्ला कंटेनर तैयार करें।
- 5-10 एमएल के मिलावटी झरने के पानी (नियंत्रण) या वसंत पानी के साथ एक आदत कंटेनर तैयार करें जिसमें प्राकृतिक उत्पाद का परीक्षण किया जा रहा है। एक प्रस्फुटन शीशी या छोटे 5 सेमी पेट्री डिश (ग्लास या प्लास्टिक) के समान कंटेनर उपयुक्त है।
- एक छोटे, साफ, फ्लैट, या गोल पानी के रंग का उपयोग करें, वसंत पानी से एक प्लैनेरियन को तैयार आदत कंटेनर में स्थानांतरित करने के लिए तैयार आदत कंटेनर में 5-10 मिलीएल मिलावटी वसंत पानी (नियंत्रण) या प्राकृतिक उत्पाद युक्त वसंत पानी का परीक्षण किया जा रहा है। धीरे-धीरे जानवर को स्टॉक कंटेनर से आदत कंटेनर में ले जाएं। सुनिश्चित करें कि प्लानेरियन ब्रश से क्षतिग्रस्त नहीं है।
नोट: पीएलएमवी परख के लिए प्लानेरियन में हेरफेर करते समय, एक छोटे, साफ, फ्लैट या गोल पानी के रंग (संख्या 3-6) का उपयोग करें। प्लैनेरियन्स को आगे बढ़ाते समय, ब्रश को धीरे-धीरे उठाने के लिए जानवर के नीचे रखा जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ब्रश का उपयोग करते समय प्लैनेरियन क्षतिग्रस्त न हों, ब्रश के ब्रिस्टल को जानवर के नीचे नहीं खेला जाना चाहिए। ब्रिस्टल से बाहर फैलने से प्लैनेरियन को नुकसान हो सकता है अगर यह ब्रश के फाइबर के बीच पकड़ा जाता है।
नोट: एक विस्तृत बोर ट्रांसफर पिपेट का उपयोग प्लैनेरियन को एक स्वच्छ और शुष्क आदत कंटेनर में स्थानांतरित करने के लिए भी किया जा सकता है।- यदि पिपेट का उपयोग करते हैं, तो प्लैनेरियन के साथ स्थानांतरित अतिरिक्त पानी को स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके आदत कंटेनर से हटा दिया जाना चाहिए।
- ध्यान से आदत समाधान (यानी, नियंत्रण या वसंत पानी के लिए प्राकृतिक उत्पाद युक्त पानी का परीक्षण किया जा रहा है) को प्लैनेरियन युक्त आदत कंटेनर में जोड़ें।
- वापसी के लिए आदत अवधि प्राकृतिक उत्पाद का परीक्षण किए जाने के लिए मूल्यांकन की गई उत्तेजना गतिशीलता पर निर्भर करेगी; 2-5 मिनट पर्याप्त साबित हो गया है।
- आदत अवधि के बाद एक वाटरकलर तूलिका का उपयोग धीरे से तैयार 5 सेमी पेट्री डिश वसंत पानी युक्त करने के लिए आदत कंटेनर से किसी भी प्राकृतिक उत्पाद कुल्ला करने के लिए planarian हस्तांतरण । सुनिश्चित करें कि प्लानेरियन ब्रश से क्षतिग्रस्त नहीं है।
- तुरंत प्लैमवी निकासी प्रयोग के लिए वसंत पानी युक्त तैयार 10 सेमी पेट्री डिश के केंद्र में प्लैनेरियन स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्लानेरियन ब्रश से क्षतिग्रस्त नहीं है।
- प्लैनेरियन की आवाजाही को रिकॉर्ड करने के लिए कैमरा शुरू करें। रिकॉर्ड 10-11 मिनट का वीडियो।
- प्रत्येक प्लैनियन के लिए ताजा समाधान के साथ पीएलएमवी प्रयोग के लिए आदत कंटेनर, कुल्ला कंटेनर, और 10 सेमी पेट्री डिश तैयार करें।
- प्रयोग के दौरान गलत समाधान के लिए अनजाने में प्लानरियंस को उजागर करने से बचने के लिए प्राकृतिक उत्पाद की प्रत्येक प्रयोगात्मक एकाग्रता के लिए समर्पित पिपेट, व्यंजन, कंटेनर और पेंटब्रश का उपयोग करें।
- क्योंकि प्लानेरियन विद्वान व्यवहार प्रदर्शित करते हैं, प्रत्येक प्लैनेरियन (नियंत्रण या परीक्षण) का उपयोग केवल एक बार26,,27।
5. डेटा विश्लेषण
- पीएलएमवी रन के दौरान प्रत्येक मिनट के लिए ग्रिड लाइनों की संख्या को पार करने के रूप में प्लैनेरियन के व्यवहार और गतिशीलता को दस्तावेज करने के लिए एक डेटा संग्रह तालिका तैयार करें। तालिका को प्रति मिनट लाइनों की संचित संख्या के लिए योजनावादी द्वारा पार करने की अनुमति नुसार भी प्रलेखित की जानी चाहिए । प्रयोगात्मक अवधि के दौरान व्यवहार के अवलोकन का मिलान करने के लिए नोटों के लिए लाइनें और परिभाषाओं की एक तालिका शामिल करें, जैसे 'भटकना' और 'स्टॉप' (चर्चादेखें)।
- वीडियो का उपयोग करके, 10 मिनट के लिए प्रति मिनट प्लैनेरियन द्वारा पार की गई पूर्ण ग्रिड लाइनों की संख्या गिनें, और डेटा टेबल पर उस संख्या को रिकॉर्ड करें। विशिष्ट प्लैनेरियन व्यवहार में निरंतर वेग, आगे निर्देशित, क्षैतिज आंदोलन, आवधिक मोड़ों के साथ, और बिना स्टॉप के होते हैं।
- इस बिंदु पर प्रयोग करना शुरू करें कि प्लैनेरियन इसे 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तूलिका से दूर हो गया है। इस शुरुआत के समय को रिकॉर्ड करें।
- यह निर्धारित करने के लिए कि जानवर एक पूर्ण ग्रिड वर्ग को कब पार करता है, सिर पर ध्यान केंद्रित करें और एक पंक्ति स्कोर करें जब सिर पूरी तरह से एक वर्ग को पार करता है।
- जब कीड़ा पकवान के किनारे के चारों ओर जाता है, तो एक पूर्ण ग्रिड स्कोर करने के लिए, रेखाओं का उल्लेख करके 0.5 सेमी की दूरी की कल्पना करें क्योंकि वे पकवान के हाशिए से बाहर निकलते हैं। यदि प्लानेरियन एक बॉक्स के कोने को पार करता है, तो एक ग्रिड लाइन स्कोर करने के लिए पार की गई दूसरी लाइन का उल्लेख करें। फिर, इन दृढ़ संकल्पों को बनाने के लिए सिर पर ध्यान केंद्रित करें।
- डेटा रिकॉर्ड करने के लिए प्रत्येक मिनट के बाद वीडियो बंद करो।
- जब अगले मिनट गिनती करने के लिए वीडियो पुनः आरंभ, अगर कीड़ा के सिर ग्रिड लाइनों के बीच था जब वीडियो बंद कर दिया गया था, पहली लाइन एक पूर्ण बॉक्स के रूप में पार रिकॉर्ड ।
- ग्रिड लाइनों की संख्या 10 मिनट के लिए पार कर स्कोर ।
- यदि जानवर एक पीएलएमवी परीक्षण के दौरान आगे बढ़ना बंद कर देता है और अब 10 मिनट रिकॉर्डिंग समय के दौरान ग्रिड लाइनों को पार नहीं करता है, तो व्यवहार चार्ट (जैसे, 'भटकना' या 'स्टॉप' में प्लानेरियन के व्यवहार को दस्तावेज़ करें)। पशु है कि pLmV परख के दौरान अपने आगे ट्रैक संघर्ष के बजाय ध्यान दिया जाना चाहिए और डेटा है कि अभिकर्मक एकाग्रता को उजागर जानवरों की कुल संख्या की एक आवृत्ति के रूप में प्रस्तुत किया । आदत अवधि के दौरान किसी भी आगे के आंदोलन को रोकने के लिए कुंडल या आक्षेप व्यवहार (सी व्यवहार के रूप में जाना जाता है) इंगित करता है कि प्राकृतिक उत्पाद की एकाग्रता एक पीएलएमवी परख में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि पीएलएमवी परख गतिशीलता आधारित है। सी-प्रकार के व्यवहार का विश्लेषण एक अलग प्रकार के विश्लेषण का उपयोग करके किया जा सकता है (चर्चादेखें)।
- यदि संभव हो, तो प्लानेरियन फिजियोलॉजी पर रिएजेंट के समग्र प्रभाव का निर्धारण करते हुए विभिन्न दिनों और दिन के विभिन्न समयों पर कम से कम 9-12 कीड़े का उपयोग करके प्राकृतिक उत्पाद की कई प्रयोगात्मक सांद्रता का परीक्षण करें। हालांकि, अगर शोधकर्ताओं ने सर्कैडियन ताल प्रेरित परिवर्तनशीलता को कम करने का प्रयास, प्रयोगों कीड़े है कि समय पर प्रकाश के साथ सुसंस्कृत कर रहे है का उपयोग कर दिन के एक निर्धारित समय पर लगातार प्रकाश व्यवस्था के साथ आयोजित किया जा सकता है/ एक व्यक्तिगत रिकॉर्ड डेटा होने के विकल्प के लिए अनुमति देने के लिए परियोजना में शामिल कम से कम दो प्रयोगकर्ता हों, जबकि दूसरा व्यक्ति डेटा संग्रह के लिए उपयोग की जाने वाली शर्तों के लिए ग्रिड लाइनों 'अंधा' को गिना जाता है। डेटा संग्रह में शामिल विभिन्न व्यक्तियों के साथ-साथ सांख्यिकीय गणना और विश्लेषण भी संभावित पूर्वाग्रह को कम करता है।
- प्रत्येक दिन प्रत्येक प्राकृतिक उत्पाद एकाग्रता के लिए ग्रिड लाइन की गणना करें ताकि प्रत्येक मिनट के लिए नियंत्रित गणनाओं के सापेक्ष ग्रिड लाइन की गणना की जा सके ताकि विभिन्न दिनों, समय और प्रयोगकर्ताओं से डेटा को जोड़ा जा सके। इन डेटा को औसत किया जा सकता है और फिर छात्र के टी-परीक्षणों का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है। प्रत्येक परीक्षण के लिए पी-मानों का मूल्यांकन नियंत्रण की तुलना में और अभिकर्मक सांद्रता के बीच प्रति मिनट किया जा सकता है। विभिन्न प्रयोगात्मक सांद्रता से प्राप्त डेटा सेट का उपयोग करके ANOVA आकलन विश्लेषण की एक और विधि प्रदान करते हैं।
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Representative Results
प्रयोगशाला की स्थापना और pLmV परख चलाने के लिए कार्यक्षेत्र की तैयारी प्रयोग शुरू होने से पहले पूरा किया जाना चाहिए । इसमें आदत कंटेनर की तैयारी, जरूरत पड़ने पर कंटेनर कुल्ला (वापसी प्रयोगों के लिए), टुकड़े टुकड़े ग्रिड पेपर पर पेट्री डिश, और ठीक से रखा गया कैमरा(चित्रा 1)शामिल है। एक बार सभी वीडियो लेने के बाद, जांचकर्ताओं(चित्रा 2 और चित्रा 2 पूरक) के बीच डेटा संग्रह और प्रस्तुति को मानकीकृत करने के लिए एक सामान्य डेटाशीट का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।
सेट किए गए कैमरे को प्रयोग की अवधि(चित्रा 3 ए और चित्रा 3ए पूरक) के लिए जानवर की प्रगति के सटीक आकलन की अनुमति देने के लिए प्लानेरियन और ग्रिड पेपर के स्पष्ट दृश्य की अनुमति चाहिए। डेटा संग्रह में ग्रिड लाइनों की संख्या को पार करना शामिल होना चाहिए, साथ ही प्रयोग के प्रति मिनट पार की गई लाइनों की संचयी कुल संख्या(चित्रा 3 बी)। पीएलएमवी विश्लेषण के दौरान, प्लैनेरियन में आवधिक मोड़ों के साथ निरंतर वेग, आगे निर्देशित, क्षैतिज आंदोलन होता है, और बंद नहीं होता है। शुरुआत करते समय, पहले पूर्ण ग्रिड बॉक्स को एक के रूप में रन आउट किया जाना चाहिए, न कि उदाहरण वीडियो में निर्धारित पहली पंक्ति। प्लैनेरियन को पीएलएमवी डिश में स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तूलिका से मुक्त होने के बाद दिशात्मक आंदोलन के शुरुआती समय को रिकॉर्ड करना महत्वपूर्ण है, और फिर उसके बाद प्रत्येक मिनट के लिए पालन करें। यदि एक प्लैनेरियन मिनट समय पर एक बॉक्स के माध्यम से रास्ते का हिस्सा है, अगले ग्रिड लाइन वीडियो पुनः आरंभ करने के बाद पार एक पूर्ण बॉक्स के रूप में गिना जाना चाहिए । जब जानवर पकवान के किनारे के चारों ओर जाता है, तो रेखाओं को संदर्भित करें क्योंकि वे 0.5 सेमी की दूरी निर्धारित करने के लिए पकवान से बाहर निकलते हैं। जब कीड़े एक बॉक्स के कोने का सामना करते हैं, तो एक ग्रिड लाइन स्कोर करने के लिए पार की गई दूसरी लाइन का उल्लेख करें। इन संकल्पों को करने के लिए हमेशा सिर पर ध्यान केंद्रित करें। यदि प्लैनेरियन एक तंग क्षेत्र को कवर करना शुरू कर देता है, तो प्रयोगकर्ता को पूर्ण ग्रिड बॉक्स की दूरी की निगरानी करने के लिए फिर से कीड़े के सिर का पालन करना चाहिए। इस व्यवहार का एक उदाहरण अनुपूरक वीडियो(चित्रा 3 ए पूरक)में शामिल है।
प्रत्येक परीक्षण से परिणामों को मानकीकृत करने के लिए, पीएलएमवी रन की गणना की जानी चाहिए और मिलान नियंत्रण कृमि(चित्रा 3 बी)की प्रगति के सापेक्ष बक्से की संख्या को पार करने के रूप में प्लॉट किया जाना चाहिए। प्रत्येक उपयोगकर्ता को ब्याज के अभिकर् स का उपयोग करके परीक्षण शुरू करने से पहले परख करने और ग्रिड लाइनों की गिनती करने के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए। एक बेंचमार्क के रूप में, प्रायोगिक सेट अप का उपयोग करके, वसंत पानी में प्लैनेरियन आमतौर पर 3 मिनट में लगभग 24 बक्से को कवर करते हैं(चित्रा 4A;4 उपयोगकर्ताओं से डेटा, औसत 24.8 ± 4.8)। प्रत्येक के लिए उपयोग किए जाने वाले व्यवहार विश्लेषण के प्रकार को निर्धारित करने के लिए परीक्षण अभिकर्षक सांद्रता की एक श्रृंखला की जांच की जानी चाहिए। PLmV विश्लेषण के लिए, शोधकर्ताओं को निर्धारित करना चाहिए कि जानवरों के उजागर होने पर गतिशीलता प्रदर्शितकरते हैं (चित्रा 4B)। अन्य प्रकार के व्यवहार विश्लेषण विभिन्न प्रकार के व्यवहारों के लिए अधिक प्रभावी हो सकते हैं (चर्चा देखें)। वसंत जल नियंत्रण के सापेक्ष, उत्तेजक डेटा ग्रिड लाइनों की बढ़ती संख्या को पार कर जाएगा क्योंकि पशु परीक्षण रिएजेंट की वांछित एकाग्रता के साथ पीएएमवी कंटेनर के माध्यम से चलता है, परीक्षण रिएजेंट की एक ही एकाग्रता में आदी होने के बाद। इसके विपरीत, निकासी डेटा वसंत जल नियंत्रण के सापेक्ष ग्रिड लाइनों की घटती संख्या दिखाएगा, जब प्लैनेरियन अकेले वसंत पानी वाले पीएलएमवी कंटेनर के माध्यम से चलता है, वसंत जल(चित्रा 4C और 4D)में मिश्रित अभिकर्मक की वांछित एकाग्रता में आदी होने के बाद। विशेष रूप से, खुलकर निकासी डेटा ग्रिड की गिनती नियंत्रणों की तुलना में कम हो सकती है, जैसा कि अन्य समूहों2, 6,द्वारा दवा प्रेरित निकासी डेटा मेंदेखागया है।
स्प्रिंग वॉटर कंट्रोल प्लानेरियन प्रयोग की अवधि के लिए ग्रिड लाइनों पर आगे बढ़ेंगे । हालांकि, परीक्षण प्लानरियंस के लिए परख के दौरान ग्रिड लाइनों को पार करना बंद करना संभव है। यदि ऐसा होता है, तो इन आंकड़ों को ग्रिड लाइनों पर अपनी प्रगति को बनाए रखने वाले कीड़े पर डेटा से अलग से हाइलाइट किया जाना चाहिए। इन आंकड़ों का दस्तावेजीकरण उस विशेष अभिकर्षक एकाग्रता के संपर्क में आने वाले जानवरों की कुल संख्या के प्रतिशत के रूप में करना इन निष्कर्षों की सापेक्ष आवृत्ति(चित्रा 5A-C, चित्रा 5Aपूरक और चित्रा 5B पूरक) की सापेक्ष आवृत्ति को चित्रित करने का एक प्रभावी तरीकाहै। ग्रिड लाइनों को पार करने से प्लानरियंस को रोकने वाले व्यवहार को पीएलएमवी विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए, भले ही ये आंदोलन जानवरों की निरंतर प्रगति में बाधा उत्पन्न करें।
चित्रा 1: पीएलएमवी परख के लिए प्रतिनिधि सेटअप।
परख शुरू करने से पहले प्रयोगशाला की जगह तैयार की जानी चाहिए। दिखाया गया है एक ठेठ सेटअप है जिसमें 10 सेमी पेट्री डिश है जो टुकड़े टुकड़े 0.5 सेमी ग्रिड पेपर पर रखी गई है। एक दस्तावेज़ कैमरा इस तरह तैनात है कि 10 सेमी पेट्री डिश का एक स्पष्ट दृश्य एक लिंक्ड कंप्यूटर पर दर्ज किया जा सकता है । हालांकि, किसी भी कैमरे का उपयोग प्रयोग के दौरान प्लानरियंस की प्रगति को रिकॉर्ड करने के लिए किया जा सकता है जिसमें रिंग स्टैंड का उपयोग करके पेट्री डिश के ऊपर तैनात सेल फोन कैमरा शामिल है। पृष्ठभूमि में वापसी प्रयोगों के लिए कीड़े कुल्ला करने के लिए एक 5 सेमी पेट्री डिश है, साथ ही साथ प्लैनेरियन को आदत बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले छोटे सफेद कंटेनर भी हैं। इसके अलावा, पृष्ठभूमि में प्रत्येक उत्पाद एकाग्रता के लिए लेबल, समर्पित गोल वाटरकलर पेंटब्रश, पिपेट और पेट्री व्यंजन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: पीएलएमवी डेटा शीट।
ग्रिड लाइनों की संख्या को पार करने के लिए एक तैयार डेटा शीट, डेटा को नियंत्रित करने के लिए संबंधित सापेक्ष, साथ ही किसी भी व्यवहार का मिलान करने का एक साधन डेटा संग्रह उद्देश्यों के लिए उपयोगी है। इस आंकड़े के डाउनलोड करने योग्य पीडीएफ संस्करण के लिए चित्रा 2 पूरक देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: प्रतिनिधि पीएलएमवी प्रयोग और डेटा शीट।
(ए)पीएलएमवी परख के लिए इस्तेमाल होने वाली 10 सेमी पेट्री डिश के ऊपर एक कैमरा रखा जाना चाहिए, जिससे डिश के नीचे प्लानेरियन और फुल ०.५ सेमी ग्रिड साफ नजर आए । पूर्ण पीएलएमवी रन(चित्रा 3A पूरक)दर्ज किया जाना चाहिए, और(ख)ग्रिड लाइनों की संख्या एक तैयार डेटा तालिका में रखा प्रत्येक मिनट को पार कर गया । संचित कुल ग्रिड लाइनों को पार किया जाना चाहिए, और फिर इन्हें इसी वसंत जल नियंत्रण कीड़ा के सापेक्ष पार की गई संचित लाइनों की संख्या में परिवर्तित किया जाना चाहिए। प्रदान की गई फिगर टेबल(बी)के आंकड़े पूरक वीडियो(चित्रा 3A पूरक)का उपयोग करके गिनती से मेल खाता है। इसी नियंत्रण गिनती नहीं दिखाई जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: उत्तेजक और निकासी डेटा के प्रतिनिधि रेखांकन।
शोधकर्ताओं का उपयोग करें और प्रयोग से पहले अकेले वसंत पानी का उपयोग कर pLmV परख ग्रिड लाइनों स्कोर करने के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए । आमतौर पर, प्लानेरियन 3 मिनट में लगभग 25 ग्रिड लाइनों की यात्रा करते हैं।(ए)चार उपयोगकर्ताओं के डेटा दिखाए जाते हैं, प्रत्येक में 10 स्प्रिंग वॉटर कंट्रोल कीड़े होते हैं। प्लैनेरियन मोटिविटी पर एक अभिकर्मक के प्रभाव की सराहना करने के लिए, पीएलएमवी परख का उपयोग करके सांद्रता की एक श्रृंखला का सर्वेक्षण किया जाता है और पार की गई ग्रिड लाइनों की कुल संख्या 3 मिनट पर इसी नियंत्रण गिनती के सापेक्ष जांच की जाती है। (ख)नियंत्रण डेटा सफेद बार द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । परीक्षण डेटा का प्रतिनिधित्व काले सलाखों द्वारा किया जाता है, जिसमें एमएमए में उपयोग की जाने वाली सांद्रता होती है। डेटा को नियंत्रित करने के सापेक्ष एकत्र किए गए डेटा का प्रतिनिधित्व करने के लिए सबसे अच्छा प्लॉट किया जाना चाहिए। (ग)ब्लू लाइन/हीरे द्वारा प्रतिनिधित्व उत्तेजक डेटा, ग्रिड लाइनों में वृद्धि दिखाएगा, बनाम(डी)निकासी डेटा, ब्लू लाइन/हीरे द्वारा भी प्रतिनिधित्व किया, नियंत्रण डेटा के सापेक्ष, एक प्रारंभिक शुरू मूल्य से एक कम ढलान दिखाएगा, जैसा कि रेड लाइन/दोनों(सी और डी)में वर्गों द्वारा दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: अवलोकन और व्यवहार डेटा के प्रलेखन।
पीएलएमवी परख में प्लानेरियन जो प्रयोग के दौरान दिशात्मक आंदोलन को बनाए नहीं रखते हैं, लेकिन विशिष्ट व्यवहार के साथ रुकते हैं और अब ग्रिडों पर नहीं जाते हैं, उनका मिलान किया जाना चाहिए। विशिष्ट व्यवहारों में ' भटकने'(ए और फिगर 5ए सप्लीमेंट),और 'स्टॉप'(बी और फिगर 5 बी पूरक) केरूप में प्रदर्शित हो सकते हैं। व्यवहार डेटा के इन टैलियों को उस उत्पाद एकाग्रता (सी) के संपर्क में आने वाले सभी जानवरों की तुलना में इन व्यवहारों की आवृत्ति को दस्तावेज करने के लिए प्रस्तुत किया जाना चाहिए। दिखाया नमूना डेटा वसंत पानी नियंत्रण जानवरों (Ci) के प्रतिशत का दस्तावेजीकरण कर रहे हैं, और एक उत्तेजक (Cii) के संपर्क में जानवरों, एक भटकना (नीला), बंद करो (लाल) या नहीं (हरे) व्यवहार होने । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
प्राकृतिक उत्पादों के उत्तेजक और वापसी प्रभावों को निर्धारित करने के लिए एक सीधा और सुलभ प्लैनेरियन गतिशीलता परख का वर्णन किया गया है। एक व्यवहार मॉडल के रूप में विभिन्न प्रयोगकर्ताओं के बीच टिप्पणियों को मानकीकृत करने के लिए आंदोलन और किसी भी व्यवहार की स्पष्ट परिभाषाओं के लिए कड़े प्रोटोकॉल होना आवश्यक है। प्रस्तुत विचारों का एक प्रदर्शन की पेशकश कैसे यह हासिल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाली प्रत्येक प्रयोगशाला को विशेष उत्पाद के प्रभावों के अनुरूप प्रस्तुत जानकारी को अनुकूलित करना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कार्यस्थान को सावधानीपूर्वक स्थापित करने की सिफारिश की जाती है कि अध्ययन में शामिल प्रत्येक अन्वेषक(चित्रा 1)द्वारा परीक्षण लगातार परिस्थितियों में किए जा सकते हैं। मानकीकृत रिकॉर्डिंग शीट को गतिशीलता और व्यवहार(चित्रा 2 और चित्रा 3 बी)पर सटीक रिकॉर्ड रखने और डेटा संग्रह के साथ सहायता करने के लिए संकलित किया जा सकता है।
यदि संभव हो तो प्लानरियंस के विभिन्न बैचों का उपयोग करके, अंतर्निहित सर्कैडियन गतिविधियों को हट जाने के लिए, दिन के विभिन्न समयों पर गतिशीलता परीक्षण किए जाने चाहिए। हालांकि ये विश्लेषण नहीं किए गए हैं, यह सुझाव दिया गया है कि जांचकर्ता यह निगरानी करते हैं कि प्लैनेरियन सर्कैडियन ताल एक मानक प्रकाश/अंधेरे चक्र (जैसे, 12/12) का उपयोग करके प्लैनेरियन को बनाए रखने के द्वारा गतिशीलता को कैसे प्रभावित कर सकती है, और जब पीएलएमवी परख का संचालन करते हैं, तो मानक प्रकाश स्थितियों का उपयोग करें और दिन32,33,,34के एक ही समय में परीक्षण चलाएं।, शोधकर्ताओं को पीएलएमवी परख के यांत्रिकी का अभ्यास करना चाहिए और प्लानेरियन की हैंडलिंग और प्लानेरियन मोटिविटी(चित्र 3)के आकलन दोनों को मानकीकृत करने के लिए ग्रिड लाइनों की गिनती करना सीखना चाहिए। यह मिलावटी वसंत जल नियंत्रण का उपयोग करके किया जाना चाहिए। आमतौर पर, 10-20 इस तरह के अभ्यास रन के बाद, डेटा सभी प्रयोगशाला सदस्यों के लिए काफी मानक बन जाता है । परख सीखने में प्रगति की तुलना करने के लिए एक सेट पीएलएमवी समय के बाद गिना जाता है। जांचकर्ता आम तौर पर वसंत पानी में 2 मिनट की आदत के बाद वसंत पानी में पीएलएमवी परख में लगभग 24 ग्रिड लाइनों का निरीक्षणकरते हैं (चित्रा 4A; 10यादृच्छिक वसंत जल नियंत्रण के साथ चार जांचकर्ताओं के लिए प्रतिनिधि डेटा; २४.८ ± ४.८ ग्रिड लाइनें) । दो या तीन प्रशिक्षित परीक्षणों के प्रत्येक सेट का आयोजन जांचकर्ताओं होने और परिणामों की विश्वसनीयता में सुधार कर सकते है क्योंकि विधि और मायने रखता है पर किसी भी उपयोगकर्ता विशिष्ट प्रभाव त्रुटि विश्लेषण में ध्यान में रखा जा सकता है । इस तरह, परीक्षण और गिनती जांचकर्ताओं के बीच बदली जा सकती है ताकि गणनाएं प्रायोगिक स्थितियों के लिए ' अंधा ' किया जा सके । पूर्वाग्रह की संभावना को कम करने के लिए, विभिन्न व्यक्ति गिनती डेटा पर सांख्यिकीय परीक्षण कर सकते हैं और बाद के विश्लेषण कर सकते हैं। उत्पाद की उपस्थिति के बाहर परीक्षण किया जा रहा है, तापमान और पीएच जैसे पानी की गुणवत्ता में पर्यावरणीय विविधताओं से बचा जाना चाहिए। चूंकि प्लानरियंस प्रकाश संवेदनशील हैं, इसलिए प्रयोग के सेटअप को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि कार्यक्षेत्र की प्रकाश व्यवस्था भी हो। अंत में, क्योंकि प्लैनेरियन विद्वान व्यवहारों का प्रदर्शन कर सकते हैं, नियंत्रण सहित प्रत्येक कीड़ा का उपयोग केवल एक बार26,,27किया जाना चाहिए।
यह प्रयोगशाला में एक प्रयोगात्मक चेकलिस्ट है उपयोगी है अगर कई प्रयोगकर्ता परख के साथ काम कर रहे हैं, विशेष रूप से एक स्नातक अनुसंधान प्रयोगशाला में, आम नुकसान है कि जब pLmV परीक्षण है, जो परिणामों के सांख्यिकीय मूल्य को प्रभावित करेगा चल रहा है से बचने के लिए । सभी समाधान कमरे के तापमान पर होने चाहिए क्योंकि कम तापमान पर प्लैनेरियन गतिशीलता कम हो जाती है। यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि नमूनों को उनके उपयोग से 5-10 दिन पहले भूखा रखा जाता है और प्रत्येक नमूना पूरी तरह से गठित होता है, जिसमें पूरी तरह से वर्णक सिर और पूंछ होती है। यह भी सुझाव दिया जाता है कि समर्पित फ्लैट या गोल पानी के रंग वाले पेंटब्रश (संख्या 3-6), आदत कंटेनर, और पेट्री व्यंजन का उपयोग प्रत्येक प्रयोगात्मक एकाग्रता के लिए प्रयोगकर्ता के लिए वर्कफ़्लो को चिकनी बनाने के लिए किया जाए। छोटे फ्लैट या गोल पानी के रंग वाले पेंटब्रश का उपयोग करके प्लैनेरियन को स्थानांतरित करने की तकनीक का जांचकर्ताओं द्वारा बड़े पैमाने पर अभ्यास किया जाना चाहिए ताकि जानवरों को चोट या संकट पैदा किए बिना कंटेनरों के बीच कीड़े का कुशल हस्तांतरण सुनिश्चित किया जा सके (ऊपर चर्चा देखें; चित्रा 4A)। इन तूलिकाओं का उपयोग कंटेनरों के बीच तरल पदार्थ के हस्तांतरण को कम करता है और प्लैनेरियन पर संभावित तनाव को कम करता है। हालांकि, यदि फाइबर फैलते हैं या जानवर से संपर्क करते हैं तो प्लैनेरियन को ब्रिस्टल से क्षतिग्रस्त किया जा सकता है।
क्योंकि पीएलएमवी परख व्यवहार डेटा पर निर्भर करती है, इसलिए जन्मजात कृमि-से-कृमि प्रतिक्रिया परिवर्तनशीलता के बावजूद मजबूत डेटा सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त रूप से बड़े डेटा सेट का उपयोग करना आवश्यक है। इस प्रकार, अधिकांश प्रयोगशालाएं उत्पाद की प्रत्येक एकाग्रता का परीक्षण करने के लिए न्यूनतम नौ से बारह प्लैनियन का उपयोग करती हैं, विशेष रूप से क्योंकि प्राकृतिक उत्पादों का मानक फार्मास्यूटिकल्स,1,,2, 3,,4,,5,6,,7,,13,,14, 15,,,716,35,36केरूप में चिह्नित प्रभाव नहीं हो सकता है।15,, प्रत्येक मिनट पार ग्रिड लाइनों की संख्या प्रत्येक परीक्षण दिन और समय के लिए वसंत जल नियंत्रण डेटा के सापेक्ष गणना की जाती है । इन डेटा प्रत्येक मिनट के लिए प्रत्येक परीक्षण एकाग्रता के लिए औसत रहे है और नियंत्रण डेटा की तुलना में, साथ ही साथ अंय समय मिलान सांद्रता दोनों छात्र टी परीक्षण और ANOVA का उपयोग कर ।
पीएलएमवी परख परख की अवधि के लिए प्लानरियंस की गतिशीलता को प्रभावित करने वाले अभिकर्मकों के अध्ययन के लिए तैयार है। साहित्य में वर्णित कई अन्य मूल्यांकनों का उपयोग करके प्लैनेरियन आंदोलनों का विस्तृत अध्ययन किया जा सकता है4,35,36,37,38. इसलिए, यह आदत प्रयोगों की एक श्रृंखला का संचालन करने के लिए समझदारी है कि कैसे planarians सांद्रता की एक श्रृंखला का उपयोग कर परीक्षण अभिकर्मक पर प्रतिक्रिया और वसंत पानी में कीड़े के व्यवहार के साथ किसी भी प्रभाव की तुलना व्यवहार परीक्षण पर तैयार कर से पहले । इस तरह, उचित व्यवहार परीक्षण को प्लानेरियन पर अभिकर्मक द्वारा प्रेरित व्यक्तिगत व्यवहार का अध्ययन करने के लिए चुना जा सकता है। प्लानरियंस को 5-10 मिनट के लिए रिएजेंट की विभिन्न सांद्रता में रखा जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या एकाग्रता उन्हें अपने विशिष्ट तैराकी व्यवहार को बनाए रखने की अनुमति देती है। व्यवहार जो गतिशीलता की अनुमति नहीं देते हैं, जैसे सी-प्रकार, या आक्षेप या जब्ती जैसे व्यवहार, विभिन्न प्रकार के व्यवहार विश्लेषणों का उपयोग करके अध्ययनों का ध्यान केंद्रित किया गया है जिन्हें इस विधि पर लागू किया जा सकता है4,39,40. पीएलएमवी विश्लेषण कम आदत के समय के बाद सांद्रता की एक श्रृंखला का उपयोग करके आयोजित किया जा सकता है और समय पाठ्यक्रम उत्तेजना और वापसी विश्लेषण से पहले वसंत जल नियंत्रण के सापेक्ष 3 मिनट पर पार की गई कुल ग्रिड लाइनों की संख्या (चित्रा 4B)1,2,3,4,5. जांचकर्ताओं को अन्य बार नमूना लेने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है, जैसे 15, 30, और 60 मिनट, यह देखने के लिए कि क्या उत्तेजना गतिशीलता एक्सपोजर के समय के साथ बदलती है1. जैसा कि बताया गया है, वसंत जल नियंत्रण कीड़े में 10 मिनट परख समय के लिए एक स्थिर, आगे निर्देशित क्षैतिज आंदोलन बनाए रखने1,4. इसके विपरीत, उत्पाद-उपचारित कीड़े परख के दौरान अपनी दिशात्मक गतिशीलता को रोक सकते हैं और बंद कर सकते हैं और अब ग्रिड लाइनों को पार नहीं कर सकते हैं। अन्वेषक एक निर्णय कर सकता है कि क्या प्रायोगिक पीएलएमवी रन की लंबाई को सीमित करना है या वर्णित इन व्यवहारों का आकलन करने का साधन प्राप्त करना है। हालांकि, इन व्यवहारों की आवृत्ति का आकलन करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे गतिशीलता को प्रभावित करने वाले अतिरिक्त डेटा प्रदान करते हैं। गतिशीलता और आंदोलन डेटा क्षेत्र में अलग से चर्चा कर रहे है क्योंकि जानकारी के संयोजन ऐसे डेटा के आकलन confounds4,35,36,37,38. एक उदाहरण के माध्यम से, दो व्यवहार देखे गए जब कीड़े बंद हो गए और अब परख के दौरान ग्रिड लाइनों को पार नहीं किया गया। इन आंदोलनों को 'भटकना' कहा जाता है (चित्रा 5A और चित्रा 5A पूरक), और 'स्टॉप' (चित्रा 5B और चित्रा 5B पूरक). इन व्यवहारों की आवृत्ति को नियंत्रण डेटा के साथ विशेष उत्पाद एकाग्रता के संपर्क में आने वाले सभी जानवरों के प्रतिशत के रूप में प्रलेखित किया जाता है (चित्रा 5C). महत्वपूर्ण बात यह है कि यादृच्छिक व्यवहार जो प्लैनेरियन को ग्रिड लाइनों को पार करने से नहीं रोकते हैं, उन्हें पीएलएमवी विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए, भले ही ये आंदोलन जानवरों की निरंतर प्रगति में बाधा उत्पन्न करें (चित्रा 4B, 3 एमएमएम और 10 एमएमएम बार)। जैसा कि उल्लेख किया गया है, जांचकर्ताओं ने कई व्यवहार श्रेणियों का वर्णन किया है जो गतिशीलता प्रोटोकॉल की पीएलएमवी दर की इस चर्चा के दायरे से बाहर हैं4,35,36,37,38.
पीएलएमवी परख जांच के तहत उत्पाद की पानी की घुलनशीलता पर निर्भर करती है। इनमें से कई पदार्थ, हालांकि, पानी में पूरी तरह से घुलनशील नहीं हैं और, इस प्रकार, केवल पानी में घुलनशील भागों का परीक्षण इस परख द्वारा किया जा सकता है जबकि बाकी को समाधान से फ़िल्टर किया जाना चाहिए जैसा कि पिछले काम में किया गया है1। यदि पीएलएमवी परख पानी के अलावा अन्य सॉल्वैंट्स का उपयोग करके रिएजेंट्स का उपयोग करके चलाया जाता है, तो इन्हें स्प्रिंग वॉटर कंट्रोल के अलावा वॉल्यूम समकक्ष नियंत्रण की आवश्यकता होती है। हालांकि इस विधि का उपयोग ऐसे पदार्थों के साथ नहीं किया गया है, इस तरह के वेक्टर नियंत्रण को परीक्षण के रूप में माना जाना चाहिए, और किसी अन्य परीक्षण पदार्थ के रूप में नियंत्रण के सापेक्ष गतिशीलता अर्जित की गई। गैर-घुलनशील पदार्थों का परीक्षण करने का एक और संभावित साधन उन्हें खाद्य जैल में मिलाकर प्लैनेरियन को खिलाना होगा। इस तकनीक का उपयोग जीन नॉक-डाउन/आरएनएआईप्रयोगों ४१में प्लानरियंस को सिर्ना पेश करने के लिए किया जाता है । हालांकि, प्लानेरियन जैविक उत्पादों और सिरना को खिलाना इस परख के लिए जटिलताओं को प्रस्तुत करता है कि प्लैनियन भूखे नहीं होंगे और एक मानकीकृत समय के भीतर गतिशीलता परख कंटेनर में स्थानांतरित नहीं किए जा सकते हैं जो परीक्षण से पहले प्रायोगिक जानवरों द्वारा जांच के तहत उत्पाद के समान जोखिम या सेवन सुनिश्चित करता है।
एक बार उत्तेजक और वापसी की गतिशीलता को पीएलएमवी परख का उपयोग करके स्थापित किया जाता है, आगे के प्रयोग में कोमोडुलेटर, सिरना की शुरूआत, साथ ही जैविक मार्ग संशोधक या दवाएं शामिल हो सकती हैं, जो इन बायोमोड्यूलेटर्स1,,3का उपयोग न करते समय एकत्र किए गए प्रारंभिक परिणामों की तुलना में अवलोकन गतिशीलता प्रभावों की वृद्धि या अवरोध के लिए परीक्षण करने के लिए हैं। उदाहरण के लिए, जीन की अभिव्यक्ति को कम करना या मार्ग अवरोधकों को जोड़ने से आंदोलन की दर में कमी आ सकती है, जबकि अन्य वापसी की गतिशीलता को बदल सकते हैं। बदले हुए पीएलएमवी परिणामों के अवलोकन के माध्यम से, ये अतिरिक्त प्रयोग प्राकृतिक उत्पाद या अन्य परीक्षण रिएजेंट5,,42, 43,,44से प्रभावित अंतर्निहित शरीर विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।,44
वर्णित प्रक्रिया कई प्राकृतिक उत्पादों सहित विभिन्न बायोमोडुलेटर के उत्तेजक और निकासी प्रभावों का निर्धारण करने में रुचि रखने वाली किसी भी प्रयोगशाला के लिए उत्तरदायी है। प्लैनेरियन पीएलएमवी परख के आवेदन के लाभों में शामिल हैं कि इन जानवरों को बनाए रखने के लिए सस्ती और आसानी से, और वे जांच के तहत उत्पाद के शारीरिक प्रभावों की व्यापक समझ प्रदान करने के लिए अन्य प्लैनेरियन-आधारित परख के लिए भी विषय हो सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक संस्थागत उन्नति के कार्यालय को स्वीकार करना चाहते हैं, और इस काम का समर्थन करने के लिए एक प्रकाशन अनुदान के लिए मॉरिसविले कॉलेज फाउंडेशन, साथ ही साथ SUNY मॉरिसविले कॉलेजिएट साइंस एंड टेक्नोलॉजी एंट्री प्रोग्राम (सीएसटीईपी) को उनकी चल रही सहायता और SUNY मॉरिसविले में स्नातक अनुसंधान के समर्थन के लिए। हम वर्णित तकनीक पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए सोफिया हचेन्स को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
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