Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En planarian motilitet assay at måle biomodulerende egenskaber af naturlige produkter

Published: May 30, 2020 doi: 10.3791/61070
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State University of New York (SUNY) at Morrisville

Summary

Planarian motilitet bruges til at måle de stimulerende og abstinenser af naturlige produkter i forhold til flytning af dyrene i kildevand alene.

Abstract

En enkel, kontrollerbar måde at bruge den ikke-parasitære planarian, Dugesia tigrina, en fritlevende akvatisk fladorm, at studere stimulerende og abstinenser af naturlige produkter er beskrevet. Eksperimentelle analyser nyder godt af unikke aspekter af planarfysiologi er blevet anvendt til undersøgelser af sårheling, regenerering, og tumorigenesis. Desuden, fordi planarians udviser følsomhed over for en række miljømæssige stimuli og er i stand til at lære og udvikle betinget svar, kan de bruges i adfærdsmæssige undersøgelser undersøge læring og hukommelse. Planarians besidder en grundlæggende bilateral symmetri og et centralnervesystem, der bruger neurotransmitter systemer modtagelige for undersøgelser undersøge virkningerne af neuromuskulære biomodulatorer. Derfor er der udviklet eksperimentelle systemer, der overvåger planarbevægelse og motilitet, for at undersøge stofafhængighed og tilbagetrækning. Fordi planarian motilitet giver mulighed for en følsom, let standardiseret motilitet assay system til at overvåge effekten af stimuli, den planarian locomotor hastighed (pLmV) test blev tilpasset til at overvåge både stimulation og tilbagetrækning adfærd af planarians gennem bestemmelse af antallet af gitter linjer krydsede af dyrene med tiden. Her demonstreres og forklares teknikken og dens anvendelse.

Introduction

Den beskrevne protokol anvender planarmotilitet til at tilvejebringe et middel til at vurdere de biomodulerende virkninger af naturlige stoffer. Det blev specielt tilpasset til at afgøre, om disse stoffer fungerer som stimulanser, og hvis de derefter var forbundet med en målbar tilbagetrækning adfærd1. Denne analyse, kendt som den planarian bevægelseshastighed (pLmV) test, blev først brugt til at teste kendte farmakologiske stoffer2,,3. Anvendelsen af denne planarian motilitetsbaserede analyse er siden vokset i popularitet og er blevet vedtaget af forskellige laboratorier, der er interesseret i andre stoffer end naturligeprodukter 4,5. Til denne analyse placeres en planar i en petriskål, der indeholder kildevand eller kildevand indeholdende en opløst biomodulator. Fordi selve skålen er placeret på grafpapir, kan antallet af gitterlinjer, der krydses af dyret med tiden, når den bevæger sig om beholderen, bruges til at bestemme bevægelseshastigheden i hver tilstand. Den lyse/mørke test, også kaldet den betingede præferencetest (CPP), er en anden variation af temaet overvågning af planarisk motilitet og vurderer, hvor hurtigt dyrene reagerer og migrerer til et formørt miljø6,7. Videosporing af planarian bevægelser kan også analyseres ved hjælp af computerprogrammer og COM-sporing (Center of Mass)8,9,10,11.

Brug af planarian som et dyr model for sådanne undersøgelser giver flere fordele i forhold til andre dyr i, at eksperimentatoren nemt kan styre analysen miljø. Specifikt, sultende planarians før eksperimenter kan forhindre deres eksponering for andre ernæringsmæssige eller farmakologiske midler, der ellers kunne forvirre resultaterne, og den specifikke biomodulator under undersøgelse kan indføres til planarians blot ved at tilføje det direkte til kulturvandet, og dermed standardisere eksponering. Da planarianere har et nervesystem og neurotransmittere, der minder om "højere orden" dyr, fysiologi og eksperimentelle reaktioner af disse dyr til neuromuskulære stimuli betragtes biologisk relevante for andre organismer12,13,14,15,16. Også, fordi planarians er relativt billige og ligetil at opretholde i laboratoriet, de tilbyder en tilgængelig biologisk model for mange efterforskere.

Som forsøgsdyr er planarians egnet til en bred vifte af undersøgelser. For eksempel, vores gruppe, samt andre efterforskere bruger planarians at studere tumorigenesis17,,18,19. Planarians udviser også et væld af respons adfærd til kemiske, termiske, gravitationelle, elektriske, foto, og magnetiske stimuli, der har dannet grundlag for andre analysesystemer. Nogle af disse effekter er blevet anvendt til at studere indlæring og hukommelse hos dissedyr 20,21,22,23,24,25,26,27. Den primære anvendelse af den planariske model i litteraturen i øjeblikket fokuserer på aktiviteten af planarian pluripotente stamceller, kaldet neoblaster, og deres rolle i regenerering28,29,30. Således, vedtagelse af den model, der er beskrevet her giver mulighed for yderligere undersøgelse ved hjælp af andre planar-baserede analyser til at give en bredere forståelse af, hvordan naturlige produkter og andre biomodulatorer påvirker organismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Planarian husdyrhold

  1. Brug planarians købt fra en biologisk forsyningsselskab eller vildt-fanget, hvis det er nødvendigt. De planarians, der anvendes i denne protokol er Dugesia tigrina, som anført i forsyningslisten. Denne art kaldes også Girardia tigrina31. Andre akvatiske planarter kan ogsåaccepteres 2,3.
    BEMÆRK: Den beskrevne protokol er rettet mod dyr, der er købt hos et biologisk forsyningsselskab. Dette analysesystem er ikke blevet testet med vildtfangete planarianere. Hvis der anvendes vildtfangete planarer, anbefales det dog, at de vænnes til det vand, der anvendes i forsøgene, samt laboratoriemiljøet i mindst 1 uge før brug.
  2. Ved ankomsten overføres planarians til plastfødevarebeholdere, der indeholder rent kildevand, og hold lågene på klem.
  3. Vedligehold planarianere i et formørt miljø.
  4. Foder nyuddannede planarer efter 24-36 timer i deres nye omgivelser.
  5. Tillad planarians at akklimatisere til laboratoriet mindst 1 uge før eksperimenter.
  6. Feed planarians på en regelmæssig to gange om ugen tidsplan.
    1. Tillad planarians at fodre ad libitum på hakkede økologiske kogte æg eller blandet økologisk oksekød lever til 1-2 timer.
    2. Placer fodret planarians i en ren beholder efter fodring.
      1. Fjern det snavsede vand fra planarianerne.
      2. Brug en lille flad akvarel pensel (nummer 3-6) til at overføre madrester og slim klæber til beholderen fra omkring planarians til en køkkenrulle.
      3. Med frisk kildevand og blid hvirvlende eller agitation, fordrive planarians og hæld dem i en ren beholder.
      4. Alle planarer, der forbliver overholdt beholderen, kan overføres ved hjælp af en rund akvarelbaliste (nummer 3-6) eller overføre pipette med en bred boring.
      5. Dekanter overførselsvandet.
      6. Dæk planarianerne med rent kildevand.
      7. Efter 24 timer fjernes planarerne fra eventuelt bortvist madspild ved at overføre dem til en ren beholder som beskrevet ovenfor (trin 1.6.2.1-1.6.2.6).
  7. Brug ikke sæbe eller rengøringsmiddel til rengøring af beholdere og redskaber, der anvendes til planarholdning. Rengør disse elementer ved at skylle dem godt med rent vand (vand fra hanen er acceptabelt) og tørring dem med en ren klud eller køkkenrulle.

2. Forberedelse af planarians til forsøg

  1. Tillad nyligt leverede planarians at akklimatisere til deres miljø mindst 1 uge før eksperimenter.
  2. Sulteplanarians i 5-10 dage før eksperimenter.
  3. Skift kulturvandet mindst 1x i løbet af sultperioden.

3. Planarian locomotor hastighed (pLmV) test: Stimulerende adfærd

  1. Før eksperimenter, sikre sultede planarer er fuldt dannet, med en komplet og pigmenteret hoved og hale.
  2. Der klargøres en 10 cm petriskål og en tilvænningsbeholder til pLmV-testen, før forsøget påbegyndes.
    1. Der skal anvendes en ren petriskål med en diameter på 10 cm, som skal anvendes til pLmV-testen på forlamentget gitterpapir (med 0,5 cm firkanter).
    2. Der tilsættes 20 ml uforfalsket kildevand til kontrol eller kildevand, der indeholder en passende koncentration af det naturprodukt, der testes, til den 10 cm diameter petriskål, der skal anvendes til pLmV-testen.
    3. Placer et kamera (f.eks. mobiltelefon eller kamera med høj opløsning) over den forberedte petriskål med en diameter på 10 cm for at optage planarian motilitet over gitterpapiret under forsøget. En ring stativ er en bekvem måde at placere kameraet på en afstand, der kan optage hele visningen af 10 cm petriskål og gitter linjer.
    4. Der klargøres en tilvænningsbeholder med 5-10 ml uforfalsket kildevand (kontrol) eller kildevand, der indeholder en passende koncentration af det naturlige produkt, der testes. En beholder svarende til en scintillation hætteglas eller lille 5 cm petriskål er egnet.
  3. Brug en lille, ren, flad eller rund akvarel pensel til forsigtigt at overføre en planar fra lagerbeholderen med kildevand til tilvænningsbeholderen med 5-10 ml uforfalsket kildevand eller kildevand, der indeholder det naturlige produkt, der testes.
    BEMÆRK: Når du manipulerer med planarians til pLmV-analysen, skal du bruge en lille, ren, flad eller rund akvarelbørste (nummer 3-6). Når du flytter planarians, bør børsten placeres under dyret for at løfte den forsigtigt. For at sikre, at planarer ikke beskadiges, når børsten tages i brug, bør børstens børster ikke spilles ud under dyret. Spredning ud af børster kan skade planarian hvis det er fanget mellem fibrene i børsten.
    BEMÆRK: En bred boring overførsel pipette kan også bruges til at overføre planarian i en ren og tør tilvænning beholder.
    1. Hvis pipetten tages i brug, skal du fjerne overskydende vand, der flyttes med planaren, fra tilvænningsbeholderen ved hjælp af overførselspipetten.
    2. Tilfædningsopløsningen (dvs. kildevand til kontrol eller kildevand, der indeholder koncentrationen af det naturlige produkt, der testes) til den tilvænningsbeholder, der indeholder planarianen.
  4. Tilvænningsperioder vil afhænge af den stimuleringsdynamik, der vurderes for det naturlige produkt, der testes. En tilvænningstid på 2 min viste sig at være acceptabel at påvise stimulering i detteværk 1.
  5. Efter 2 min tilvænning periode bruge en akvarel pensel til forsigtigt at overføre planarian til midten af den forberedte 10 cm petriskål til pLmV stimulation eksperiment.
  6. Start kameraet for at optage bevægelsen af planarian. Optag 10-11 min video.
  7. Forbered tilvænningsbeholderen og 10 cm petriskålen til pLmV-eksperimentet med friske opløsninger til hver planar.
  8. Brug dedikerede pipetter, fade, beholdere og pensler til hver eksperimentel koncentration af det naturlige produkt, der testes for at undgå uforvarende at udsætte planarians for den forkerte løsning under eksperimenter.
  9. Fordi planarians udviser lært adfærd, hver planarian (kontrol eller test) bør kun anvendes én gang21,,22.

4. Planarian locomotor hastighed (pLmV) test: Tilbagetrækning adfærd

  1. Før eksperimenter, sikre sultede planarer er fuldt dannet, med en komplet og pigmenteret hoved og hale.
  2. Forbered en 10 cm petriskål (glas eller plast) til pLmV-eksperimentet, en 5 cm petriskål (glas eller plast) til skylning af planarianerne efter tilvænning og en tilvænningsbeholder, inden forsøget påbegyndes.
    1. Der skal anvendes en ren petriskål med en diameter på 10 cm, som skal bruges til pLmV-forsøget på forlamineret gitterpapir med 0,5 cm kvadrater).
    2. Der tilsættes 20 ml uforfalsket kildevand til den 10 cm diameter petriskål, der skal anvendes til pLmV-forsøget.
    3. Placer et kamera over den forberedte 10 cm diameter Petri fad som i trin 3.2.3 at optage planarian motilitet over nettet papir under forsøget.
    4. Forbered planarian skyllebeholderen ved at tilføje 5 ml kildevand alene til 5 cm petriskål.
    5. Der klargøres en tilvænningsbeholder med 5-10 ml uforfalsket kildevand (kontrol) eller kildevand, der indeholder det naturlige produkt, der testes. En beholder svarende til et scintillationsglas eller en lille petriskål på 5 cm (glas eller plast) er egnet.
  3. Brug en lille, ren, flad eller rund akvarelbørste til at overføre en planar fra kildevand til den forberedte tilvænningsbeholder med 5-10 ml uforfalsket kildevand (kontrol) eller kildevand, der indeholder det naturlige produkt, der testes. Flyt forsigtigt dyret fra lagerbeholderen til tilvænningsbeholderen. Sørg for, at planarian ikke beskadiges af børsten.
    BEMÆRK: Når du manipulerer med planarians til pLmV-analysen, skal du bruge en lille, ren, flad eller rund akvarelbørste (nummer 3-6). Når du flytter planarians, bør børsten placeres under dyret for at løfte den forsigtigt. For at sikre, at planarer ikke beskadiges, når børsten tages i brug, bør børstens børster ikke spilles ud under dyret. Spredning ud af børster kan skade planarian hvis det er fanget mellem fibrene i børsten.
    BEMÆRK: En bred boring overførsel pipette kan også bruges til at overføre planarian i en ren og tør tilvænning beholder.
    1. Hvis du bruger pipetten, skal overskydende vand flyttes med planarian fjernes fra tilvænningsbeholderen ved hjælp af overførselspipetten.
    2. Tilfødningsopløsningen (dvs. uforfalsket kildevand til betjenings- eller kildevand, der indeholder det naturlige produkt, der testes), til tilvænningsbeholderen, der indeholder planarianen.
  4. Tilvænningsperioder for tilbagetrækning vil afhænge af den stimuleringsdynamik, der vurderes for det naturlige produkt, der testes. 2-5 min har vist sig at være tilstrækkelig.
  5. Efter tilvænningsperioden skal du bruge en akvarelbørste til forsigtigt at overføre planarianen til den forberedte 5 cm petriskål indeholdende kildevand for at skylle ethvert naturprodukt af fra tilvænningsbeholderen. Sørg for, at planarian ikke beskadiges af børsten.
  6. Overfør straks planarian til midten af den forberedte 10 cm petriskål, der indeholder kildevand til pLmV tilbagetrækning eksperiment. Sørg for, at planarian ikke beskadiges af børsten.
  7. Start kameraet for at optage bevægelsen af planarian. Optag 10-11 min video.
  8. Forbered tilvænningsbeholderen, skyllebeholderen og 10 cm petriskålen til pLmV-eksperimentet med friske opløsninger til hver planar.
  9. Brug dedikerede pipetter, fade, beholdere og pensler til hver eksperimentel koncentration af det naturlige produkt, der testes for at undgå uforvarende at udsætte planarians for den forkerte løsning under eksperimenter.
  10. Da planarians udviser lært adfærd, skal du kun bruge hver planarian (kontrol eller test) én gang26,27.

5. Dataanalyse

  1. Forbered en dataindsamlingstabel for at dokumentere planarianernes funktionsmåde og motilitet, efterhånden som antallet af gitterlinjer krydses i hvert minut under pLmV-kørslen. Tabellen skal gøre det muligt at dokumentere det akkumulerede antal linjer pr. minut, som planarianerne krydser. Medtag linjer til noter og en tabel over definitioner til at stemme overens observation af adfærd i den eksperimentelle periode, såsom 'vandre' og 'stop' (se Diskussion).
  2. Ved hjælp af videoen skal du tælle antallet af fulde gitterlinjer, der krydses af planariansen pr. minut i 10 min, og registrere dette tal i datatabellen. Typisk planarian adfærd består af kontinuerlig hastighed, fremadrettet, vandret bevægelse, med periodiske sving, og uden stop.
    1. Begynd at gang eksperimentet på det punkt, at planarian har bevæget sig ud af pensel bruges til at overføre det til 10 cm petriskål. Optag dette starttids.
    2. For at bestemme, hvornår dyret krydser en fuld gitter firkant, fokusere på hovedet og score en linje, når hovedet fuldt krydser en firkant.
    3. For at score et fuldt gitter, når ormen bevæger sig rundt om kanten af skålen, visualisere en afstand på 0,5 cm ved at henvise til de linjer, som de strækker sig ud fra margenerne af skålen. Hvis planarianen krydser hjørnet af en boks, skal du henvise til den anden linje, der krydses, for at score en gitterlinje. Igen, fokusere på hovedet for at gøre disse bestemmelser.
    4. Stop videoen efter hvert minut for at optage dataene.
    5. Når du genstarter videoen for at tælle det næste minut, skal du optage den første linje, der krydses, som en fuld boks, hvis ormens hoved var mellem gitterlinjerne, da videoen blev stoppet.
    6. Score antallet af gitterlinjer krydsede i 10 min.
  3. Hvis dyret holder op med at bevæge sig under en pLmV-test og ikke længere krydser gitterlinjer i løbet af 10 min-optagetingstiden, skal du dokumentere planarianernes adfærd i adfærdsdiagrammet (f.eks. Dyr, der ophører med at være på sporet under pLmV-analysen, bør i stedet noteres, og de data, der præsenteres som en hyppighed af det samlede antal dyr, der udsættes for den pågældende reagenskoncentration. Oprullende eller krampeanholdende adfærd (kendt som en C-adfærd), der forhindrer enhver fremadrettet bevægelse i indædningsperioden, indikerer, at koncentrationen af det naturlige produkt ikke er egnet til brug i en pLmV-analyse, fordi pLmV-analysen er motilitetsbaseret. Funktionsmåden af C-typen kan analyseres ved hjælp af en anden type analyse (se Diskussion).
  4. Hvis det er muligt, testes flere eksperimentelle koncentrationer af naturproduktet ved hjælp af mindst 9-12 orme på forskellige dage og forskellige tidspunkter af dagen, hvis reagensets samlede virkning fastlægges på planarianfysiologi. Men hvis forskerne bestræber sig på at reducere døgnrytme-induceret variabilitet, eksperimenter kan udføres med konstant belysning på et bestemt tidspunkt af dagen ved hjælp af orme, der er dyrket med timet lys / mørke cykler og sæt fodring gange. Har mindst to eksperimentatorer involveret i projektet for at give mulighed for at have en individuel post data, mens den anden person tæller gitterlinjerne 'blind' til de betingelser, der anvendes til dataindsamling. At have forskellige personer involveret i dataindsamling, samt statistiske beregninger og analyser, reducerer også mulige bias.
  5. Beregn gitterlinjetællinger for hver enkelt koncentration af naturlige produkter på hver dag i forhold til kontroltællinger for hvert minut, så data fra forskellige dage, tidspunkter og eksperimentatorer kan kombineres. Disse data kan beregnes som et gennemsnit og derefter analyseres ved hjælp af Student's T-tests. P-værdier for hver test kan vurderes pr. minut sammenlignet med kontrol og mellem reagenskoncentrationer. ANOVA-vurderinger ved hjælp af datasæt fra forskellige eksperimentelle koncentrationer giver en yderligere analysemetode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Laboratoriet, der er oprettet, og forberedelse af arbejdsområdet til drift af pLmV-analysen skal være afsluttet, før forsøg påbegyndes. Dette omfatter fremstilling af tilvænningsbeholderen, skyl beholderen, hvis det er nødvendigt (til abstinenser), petriskål over lamineret gitterpapir og korrekt placeret kamera (Figur 1). Når alle videoerne er taget, er det tilrådeligt at bruge et fælles datablad til at standardisere dataindsamling og præsentation mellem efterforskere(Figur 2 og Figur 2 Supplement).

Kameraet, der er oprettet, bør give et klart overblik over planarpapiret og gitterpapiret, så der kan foretages en nøjagtig vurdering af dyrets udvikling under forsøgets varighed (figur 3A og figur 3A-tillæg). Dataindsamlingen bør omfatte antallet af krydsede gitterlinjer samt det samlede samlede antal strækninger, der krydses pr. minut af forsøget (figur 3B). Under pLmV analyse, planarians har en kontinuerlig hastighed, fremadrettet, vandret bevægelse, med periodiske sving, og stopper ikke. Når du begynder, skal den første fulde gitterboks, der krydses, scores som én, ikke den første linje som bestemt i eksempelvideoen. Det er vigtigt at registrere starttids for retningsbestemt bevægelse efter planarian er fri for pensel bruges til at overføre det til pLmV parabol, og derefter følge op for hvert minut derefter. Hvis en planarian er en del af vejen gennem en boks på minuttet, skal den næste gitterlinje, der krydses efter genstart af videoen, tælles som en fuld boks.  Når dyret bevæger sig rundt om kanten af skålen, henvises til linjerne, da de strækker sig ud fra skålen for at bestemme en afstand på 0,5 cm. Når orme støder på hjørnet af en boks, skal du henvise til den anden linje, der krydses, for at score en gitterlinje. Altid fokusere på hovedet for at gøre disse bestemmelser. Hvis planarian begynder at dække et stramt område, bør eksperimentatoren igen følge hovedet af ormen til at overvåge afstanden af en fuld gitter boks. Et eksempel på denne funktionsmåde er inkluderet i den supplerende video (Figur 3A supplement).

For at standardisere resultaterne fra hvert forsøg skal pLmV-kørslerne beregnes og afbildes som antallet af krydsede bokse i forhold til forløbet af den matchende kontrolorm (Figur 3B). Hver bruger skal uddannes til at udføre analyse- og tællegitterlinjer før påbegyndelse af prøvninger ved hjælp af reagenser af interesse. Som benchmark dækker planarer i kildevand typisk ca. 24 kasser på 3 minutter (Figur 4A; data fra 4 brugere, gennemsnit på 24,8 ± 4,8). Der bør undersøges en række testreagenskoncentrationer for at bestemme, hvilken type adfærdsanalyse der skal anvendes for hver enkelt. Til pLmV-analyse bør forskerne afgøre, om dyrene udviser motilitet, når de eksponeres (Figur 4B). Andre typer adfærdsanalyser kan være mere effektive til forskellige typer adfærd (se diskussion). I forhold til kildevandskontrollen vil stimulerende data vise et stigende antal gaslinjer, der krydses, når dyret bevæger sig gennem pLmV-beholderen med den ønskede koncentration af testreageksen i kildevand, efter at det er blevet vænnet i samme koncentration af testreageksen. I modsætning hertil vil tilbagetrækningsdata vise et faldende antal krydsede netlinjer i forhold til kildevandskontrollen, når den planarian bevæger sig gennem pLmV-beholderen, der alene har kildevand, efter at være blevet vænnet i den ønskede koncentration af reagenset blandet i kildevand (Figur 4C og 4D). Især kan data om tilbagetrækning af overt føre til nettællinger, der er mindre end dem, der anvendes i kontrollerne, som det er blevet observeret i lægemiddelinducerede tilbagetrækningsdata fra andregruppe 2,6.

Kildevandskontrolplanarians vil bevæge sig over gitterlinjer under hele eksperimentet. Det er dog muligt for testplanarians at ophøre med at krydse netlinjer under analysen. Hvis dette sker, skal disse data fremhæves adskilt fra data om orme, der bevarer deres fremskridt over gitterlinjerne. Dokumentation af disse data i procent af det samlede antal dyr, der eksponeres for den pågældende reagenskoncentration, er en effektiv metode til at illustrere den relative hyppighed af disse fund(figur 5A-C, figur 5A-tillægget og figur 5B-tillægget). Adfærd, der ikke forhindrer planarianerne i at krydse netlinjer, bør indgå i pLmV-analysen, selv om disse bevægelser hindrer dyrenes konstante udvikling.

Figure 1
Figur 1: Repræsentativ opsætning for pLmV-analysen.
Laboratorierummet skal være forberedt, inden analysen påbegyndes. Vist er en typisk opsætning med en 10 cm petriskål placeret over lamineret 0,5 cm gitterpapir. Et dokumentkamera er placeret således, at et klart overblik over 10 cm petriskålen kan optages på en forbundet computer. Men ethvert kamera kan bruges til at registrere udviklingen af planarians under eksperimentet, herunder en mobiltelefon kamera placeret over petriskålen ved hjælp af en ring stativ. I baggrunden er en 5 cm petriskål til at skylle orme til tilbagetrækning eksperimenter, samt små hvide beholdere, der anvendes til habituating planarians. Også i baggrunden er mærket, dedikeret runde akvarel pensler, pipetter, og petriskåle for hvert produkt koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: pLmV-datablad.
Et forberedt datablad til registrering af antallet af krydsede gitterlinjer, den tilsvarende i forhold til kontroldata samt et middel til at tælle eventuelle funktionsmåder er nyttigt til dataindsamlingsformål. Se Figur 2-tillægget for en PDF-version, der kan downloades, af dette tal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativt pLmV-eksperiment og datablad.
(A)Et kamera skal placeres over den 10 cm petriskål, der anvendes til pLmV-analysen, således at det planarianske og hele 0,5 cm gitteret under skålen er klart synligt. Den fulde pLmV-kørsel registreres (Figur 3A-tillæg), ogb) antallet af gitterlinjer, der krydses hvert minut, og som placeres i en forberedt datatabel. De akkumulerede samlede linjelinjer, der krydses, skal optjenes, og derefter skal disse konverteres til antallet af akkumulerede linjer, der krydses i forhold til den tilsvarende kildevandskontrolorm. Dataene i den angivne figurtabel (B) svarer til optællingerne ved hjælp af den supplerende video (Figur 3A-tillæg). Tilsvarende kontroloptællinger vises ikke. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative grafer over stimulerende data og tilbagetrækningsdata.
Forskere bør uddannes til at bruge og score pLmV assay gitter linjer ved hjælp af kildevand alene før eksperimenter. Typisk, planarians rejse omkring 25 gitter linjer i 3 min. (A) Data fra fire brugere vises, hver med 10 kildevand kontrol orme.  For at vurdere virkningen af et reagens på planarian motilitet undersøges en række koncentrationer ved hjælp af pLmV-analysen, og det samlede antal krydsede netlinjer undersøges i forhold til de tilsvarende kontroltal efter 3 minutter. (B) Kontroldata repræsenteres af den hvide bjælke. Testdataene repræsenteres af de sorte bjælker, hvor koncentrationerne anvendes i mM. I forhold til kontroldata bør afbildes, så de bedst repræsenterer de indsamlede data. ( C) Stimulerende data repræsenteret ved den blå linje / diamanter, vil vise en stigning i gitter linjer krydsede, versus(D) tilbagetrækning data, også repræsenteret ved den blå linje / diamanter, vil vise en faldende hældning fra en indledende startværdi, i forhold til kontroldata, som vist ved den røde linje / firkanter i både (C og D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Observation og dokumentation af adfærdsmæssige data.
Planarians i pLmV-analysen, der ikke opretholder retningsbestemt bevægelse under eksperimentet, men stopper med karakteristisk adfærd og ikke længere bevæger sig over gitrene bør optalt. Typisk adfærd kan omfatte skærme som 'vandre' (A og Figur 5A Supplement),og 'stop' (B og Figur 5B Supplement). Disse tal for adfærdsmæssige data bør præsenteres for at dokumentere hyppigheden af disse adfærdsmønstre i forhold til alle de dyr, der udsættes for denne produktkoncentration (C). Vist er prøve data, der dokumenterer procentdelen af kildevand kontrol dyr (Ci), og dyr, der udsættes for en stimulans (Cii), der har en vandre (blå), stop (rød) eller ingen (grøn) adfærd. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En enkel og tilgængelig planarian motilitet assay er beskrevet for at bestemme stimulerende og abstinens virkninger af naturlige produkter. Som en adfærdsmodel er det nødvendigt at have strenge protokoller for scoring bevægelse og klare definitioner af enhver adfærd til at standardisere observationer mellem forskellige eksperimentatorer. De fremlagte idéer er et bevis på, hvordan dette kan opnås. Hvert laboratorium, der anvender denne protokol, bør tilpasse de præsenterede oplysninger, så de passer til virkningerne af det pågældende produkt, der testes. Det anbefales omhyggeligt at opsætte arbejdsområdet for at sikre, at test kan udføres under ensartede forhold af hver enkelt investigator, der er involveret i undersøgelsen (figur 1). Standardiserede optagelsesark kan kompileres for at hjælpe med præcis registrering og dataindsamling om motilitet og adfærd (Figur 2 og Figur 3B).

Motilitetstest bør udføres på forskellige tidspunkter af dagen, ved hjælp af forskellige partier af planarians, hvis det er muligt, for at tage højde for divergerende iboende døgnrytmen aktiviteter. Selv om disse analyser ikke er blevet udført, foreslås det, at efterforskerne overvåger, hvordan den planarianske døgnrytme kan påvirke motiliteten ved at opretholde planarianere ved hjælp af en standard lys/mørk cyklus (f.eks. 12/12), og når pLmV-analysen udføres, skal du bruge standardlysforhold og køre testene på samme tidspunkt afdag 32,33,34. Forskere bør praktisere mekanikken i pLmV assay og lære at tælle gitter linjer til at standardisere både håndtering af planarians og vurderingen af planarian motilitet (Figur 3). Dette bør gøres ved hjælp af uforfalsket kildevand kontrol. Typisk, efter 10-20 sådan praksis kører, data bliver helt standard for alle laboratoriemedlemmer. Tæller efter et sæt pLmV tid bør vælges til at sammenligne fremskridt i at lære analysen. Efterforskere observerer typisk ca. 24 gitterlinjer, der krydses med 3 min i pLmV-analysen i kildevand efter en 2 min tilvænning i kildevand (Figur 4A; repræsentative data for fire efterforskere med 10 tilfældige fjedervandkontroller hver; 24,8 ± 4,8 netlinjer). At have to eller tre uddannede efterforskere, der udfører hvert sæt test, kan yderligere forbedre pålideligheden af resultaterne, fordi eventuelle brugerspecifikke virkninger på metoden og tæller kan tages i betragtning i fejlanalysen. På denne måde kan test og tællinger byttes mellem investigatorer, så optællinger kan gøres "blinde" til forsøgsbetingelserne. For at mindske risikoen for bias kunne forskellige personer gennemføre statistiske test af optællingsdataene og udføre de efterfølgende analyser. Uden for tilstedeværelsen af det produkt, der testes, bør miljømæssige variationer i vandkvaliteten såsom temperatur og pH undgås. Da planarians er lysfølsomme, bør opsætningen af eksperimentet sikre, at belysningen af arbejdsområdet er jævn. Endelig, fordi planarians kan udstille lært adfærd, hver orm, herunder kontrol, bør kun anvendes én gang26,27.

Det er nyttigt at have en eksperimentel tjekliste i laboratoriet, hvis flere eksperimentatorer arbejder med analysen, især i en bachelor forskningslaboratorium, for at undgå fælles faldgruber, der kan opstå, når du kører pLmV test, hvilket ville påvirke den statistiske værdi af resultaterne. Alle opløsninger skal være ved stuetemperatur, fordi planarmotiliteten reduceres ved lavere temperaturer. Det skal sikres, at prøverne sultes 5-10 dage før deres anvendelse, og at hver prøve er fuldt dannet med et fuldstændigt pigmenteret hoved og hale. Det foreslås også, at dedikerede flade eller runde akvarel pensler (nummer 3-6), tilvænningsbeholdere og petriskåle anvendes til hver eksperimentel koncentration for at gøre arbejdsgangen glattere for eksperimentatoren. Teknikken med at overføre planarianerne ved hjælp af små flade eller runde akvarelbørster bør praktiseres i udstrakt grad af efterforskerne for at sikre en effektiv overførsel af ormene mellem beholderne uden at forårsage skade eller angst for dyrene (se diskussionen ovenfor; Figur 4A). Brugen af disse pensler minimerer overførslen af væsker mellem beholderne og reducerer potentielle stress på planarians. Men, planarians kan blive beskadiget af børster, hvis fibrene spredes eller spilles ud, når de kontakter dyret.

Da pLmV-analysen er afhængig af adfærdsdata, er det vigtigt at bruge et tilstrækkeligt stort datasæt til at sikre robuste data på trods af medfødte orm-til-orm-responsvariationer. Som sådan anvender de fleste laboratorier mindst ni til tolv planarianere til at teste hver koncentration af det undersøgte produkt, især fordi naturlige produkter måske ikke har en så markant virkning som standardlægemidler1,2,3,4,,5,6,7,13,14,15,16,35,36. Antallet af gaslinjer, der krydses hvert minut, beregnes i forhold til kildevandskontroldataene for hver testdag og -tid. Disse data beregnes i gennemsnit for hver testkoncentration for hvert minut og sammenlignet med kontroldataene samt andre tidsmatchede koncentrationer ved hjælp af både Student's T-test og ANOVA.

PLmV-analysen er gearet til undersøgelser af reagenser, der påvirker planarianernes motilitet i hele analysetiden. Detaljerede undersøgelser af planarian bevægelser kan udføres ved hjælp af en række andre vurderinger, der er beskrevet i litteraturen4,35,36,37,38. Derfor er det klogt at gennemføre en række tilvænningsforsøg for at notere sig, hvordan planarianerne reagerer på testreagementet ved hjælp af en række koncentrationer og sammenligner eventuelle virkninger med ormenes adfærd i kildevand, før de påbegynder adfærdstest. På denne måde kan den relevante adfærdsmæssige test vælges til at studere de enkelte manerer induceret af reagensen på planarian. Den planarians kan placeres i forskellige koncentrationer af reagens i 5-10 min at afgøre, om en koncentration tillader dem at opretholde deres typiske svømning adfærd. Adfærd, der ikke tillader motilitet, såsom dem, der resulterer i en C-type, eller kramper eller beslaglæggelse-lignende adfærd, har været i fokus for undersøgelser ved hjælp af separate typer af adfærdsmæssige analyser, der kan anvendes på denne metode4,39,40. pLmV-analyser kan udføres ved hjælp af en række koncentrationer efter korte tilvænningstider, og antallet af samlede netlinjer, der krydses ved 3 min. scoret i forhold til kildevandsstyringer før tidstræning og abstinensanalyser (Figur 4B)1,2,3,4,5. Efterforskere opfordres til at prøve andre gange, såsom 15, 30 og 60 min, for at se, om stimuleringsdynamikken ændrer sig med eksponeringstidstid1. Som det er blevet rapporteret, i kildevand kontrol orme opretholde en stabil, fremadrettet vandret bevægelse for 10 min assay tid1,4. I modsætning hertil kan produktbehandlede orme stoppe og ophøre med deres retningsbestemte motilitet under analysen og ikke længere krydse gitterlinjer. Investigator kan foretage en vurdering, om at begrænse længden af den eksperimentelle pLmV køre eller udlede et middel til at vurdere disse adfærd som beskrevet. Det er dog vigtigt at vurdere hyppigheden af disse adfærdsmønstre, da de giver yderligere data, der påvirker motilitet. Motilitets- og bevægelsesdata drøftes særskilt på området, fordi en kombination af oplysningerne forvirrer vurderingen af sådanne data4,35,36,37,38. Som et eksempel blev der observeret to adfærdsmønstre, da ormene stoppede og ikke længere krydsede gitterlinjer under analysen. Disse bevægelser kaldes »vandre« (Figur 5A Og Figur 5A-tillæg), og "stop" (Figur 5B Og Figur 5B-tillæg). Hyppigheden af denne adfærd dokumenteres som procentdel af alle de dyr, der udsættes for den pågældende produktkoncentration, sammen med kontroldataene (Figur 5C). Det er vigtigt, at tilfældig adfærd, der ikke forhindrer planaren i at krydse netlinjer, medtages i pLmV-analysen, selv om disse bevægelser hindrer dyrenes stadige fremskridt (Figur 4B, 3 mM og 10 mM stænger). Som nævnt, efterforskere har beskrevet en række adfærdsmæssige kategorier, der er uden for rammerne af denne diskussion af pLmV sats af motilitet protokol4,35,36,37,38.

PLmV-analysen bygger på vandopløseligheden af den pågældende vare. Mange af disse stoffer er imidlertid ikke fuldt opløselige i vand, og som sådan er det kun de vandopløselige portioner, der kan testes ved denne analyse, mens resten skal filtreres fra opløsningen, som det er gjort i tidligere arbejde1. Hvis pLmV-analyser køres ved hjælp af reagenser opløses ved hjælp af andre opløsningsmidler end vand, kræver disse en volumenækvivalent kontrol ud over kildevandskontrollen. Selv om denne metode ikke har været anvendt med sådanne stoffer, bør sådanne vektorkontroller sandsynligvis behandles som en test, og motiliteten scorede i forhold til kontrollerne, som ville ethvert andet teststof. Et andet muligt middel til at teste ikke-opløselige stoffer ville være at fodre dem til planarianerne ved at blande dem i madgeler. Denne teknik bruges til at indføre siRNA til planarians i gen knock-down/RNAi eksperimenter41. Fodring planarians biologiske produkter og siRNA, dog præsenterer komplikationer til denne analyse i, at planarians ikke ville blive sultet og ikke kan overføres til motilitet assay beholder inden for en standardiseret tid, der sikrer lige eksponering eller indtagelse af det produkt, der undersøges af forsøgsdyr forud for test.

Når stimulerende og tilbagetrækning dynamik er etableret ved hjælp af pLmV assay, yderligere eksperimenter kan involvere comodulatorer, indførelse af siRNA, samt biologiske vej modifikatorer eller lægemidler til at teste for forøgelse eller hæmning af de observerede motilitet effekter i forhold til de første resultater indsamlet, når de ikke bruger disse biomodulatorer1,3. For eksempel kan nedregulere udtrykket af et gen eller tilføje pathway hæmmere reducere bevægelseshastigheden, mens andre kan ændre dynamikken i tilbagetrækning. Ved observation af ændrede pLmV-resultater kan disse yderligere forsøg give indsigt i den underliggende fysiologi, der påvirkes af et naturligt produkt eller et andet testreagens5,42,43,44.

Den beskrevne procedure er modtagelig for ethvert laboratorium interesseret i at bestemme stimulerende og abstinens virkninger af en række forskellige biomodulatorer, herunder mange naturlige produkter. Fordelene ved anvendelsen af den planarian pLmV analyse omfatter, hvor billigt og let at vedligeholde disse dyr er, og at de også kan være genstand for andre planar-baserede analyser for at give en bred forståelse af de fysiologiske virkninger af det produkt, der undersøges.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende kontoret for Institutional Advancement, og Morrisville College Foundation for en publikation tilskud til at støtte dette arbejde, samt SUNY Morrisville Kollegiale Science and Technology Entry Program (CSTEP) for deres løbende bistand og støtte til bachelor forskning på SUNY Morrisville. Vi vil også gerne takke Sophia Hutchens for nyttige kommentarer til den beskrevne teknik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottled Water - 1 Gal. Poland Spring N/A Spring water for planarian culture and to prepare solutions
Brown Planaria (Dugesia tigrina) Carolina Biological Supply Company 132954 Brown planaria living (other species are acceptable)
Flat Paintbrush Royal Crafter's Choice 9159 Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers
Glass Petri Dish - 10 cm Kimax N/A 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay
Glass Petri Dish - 5 cm Kimax N/A 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation
Grid Paper Any N/A Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay
iPEVO Visualizer (software) iPEVO https://www.ipevo.com/software/visualizer Document camera software for video capture and recording
Metalware Set with Support Stand and Retort Ring Any N/A Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used
Organic Egg Any N/A Organic egg or beef liver for feeding planarains
Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL Beckman N/A Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation
Round Storage Container - 10 cm Ziploc N/A 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer
Round Water Paint Brush LOEW-Cornell N/A Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft
Transfer Pipette Any N/A Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians
USB Document Camera iPEVO CDVU-06IP Document camera (or other camera or cell phone camera)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
  2. Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
  3. Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
  4. Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
  5. Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
  6. Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. 0, 8-13 (2013).
  7. Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
  8. Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
  9. Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
  10. Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
  11. Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
  12. Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
  13. Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
  14. Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
  15. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
  16. Raffa, R. B., Rawls, S. M. A model for drug action and abuse. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2008).
  17. Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
  18. Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
  19. Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
  20. Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
  21. Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
  22. Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
  23. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
  24. Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
  25. de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
  26. Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
  27. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, Pt 20 3799-3810 (2013).
  28. Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
  29. Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
  30. Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
  31. Animal Diversity. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Dugesia_tigrina/ (2019).
  32. Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
  33. Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
  34. Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
  35. Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
  36. Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
  37. Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
  38. Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
  39. Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
  40. Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
  41. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
  42. Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
  43. Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
  44. Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).

Tags

Biokemi planarian pLmV motilitet adfærd stimulerende tilbagetrækning
En planarian motilitet assay at måle biomodulerende egenskaber af naturlige produkter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voura, E. B., Pulquerio, C. H.,… More

Voura, E. B., Pulquerio, C. H., Fong, R. A. M. V., Imani, Z., Rojas, P. J., Pratt, A. M., Shantel, N. M., Livengood, E. J. A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products. J. Vis. Exp. (159), e61070, doi:10.3791/61070 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter