Summary
Planaire beweeglijkheid wordt gebruikt om de stimulerende en ontwenningseigenschappen van natuurlijke producten te meten in vergelijking met de beweging van de dieren in bronwater alleen.
Abstract
Een eenvoudige, controleerbare manier van het gebruik van de niet-parasitaire planarian, Dugesia tigrina, een vrij levende aquatische platworm, om de stimulerende en ontwenningseigenschappen van natuurlijke producten te bestuderen wordt beschreven. Experimentele tests profiteren van unieke aspecten van de planaire fysiologie zijn toegepast op studies over wondgenezing, regeneratie, en tumorigenese. Bovendien, omdat planarianen gevoeligheid voor een verscheidenheid van milieustimuli vertonen en in staat zijn om geconditioneerde reacties te leren en te ontwikkelen, kunnen ze worden gebruikt in gedragsstudies die leren en geheugen onderzoeken. Planarianen beschikken over een fundamentele bilaterale symmetrie en een centraal zenuwstelsel dat neurotransmitter systemen vatbaar maakt voor studies onderzoeken van de effecten van neuromusculaire biomodulatoren. Bijgevolg zijn experimentele systemen ontwikkeld die de planaire beweging en beweeglijkheid monitoren om verslaving en terugtrekking van stoffen te onderzoeken. Omdat planaire beweeglijkheid biedt het potentieel voor een gevoelige, gemakkelijk gestandaardiseerde beweeglijkheidstest systeem om het effect van stimuli te controleren, de planaire motorische snelheid (pLmV) test werd aangepast om zowel stimulatie en ontwenningsgedrag te controleren door planarianen door de bepaling van het aantal rasterlijnen gekruist door de dieren met de tijd. Hier worden de techniek en de toepassing ervan gedemonstreerd en uitgelegd.
Introduction
Het beschreven protocol maakt gebruik van de planaire beweeglijkheid om een middel te bieden om de biomodulating effecten van natuurlijke stoffen te beoordelen. Het werd specifiek aangepast om te bepalen of deze stoffen functioneren als stimulerende middelen, en als ze vervolgens werden geassocieerd met een meetbare terugtrekking gedrag1. Deze test, bekend als de planaire motorische snelheid (pLmV) test, werd voor het eerst gebruikt om bekende farmacologische agentia te testen2,3. De toepassing van deze op planaire beweeglijkheid gebaseerde test is sindsdien in populariteit gegroeid en is overgenomen door verschillende laboratoria die geïnteresseerd zijn in andere stoffen dan natuurlijke producten4,5. Voor deze test wordt een planarian geplaatst in een petrischaal met bronwater of bronwater met een opgeloste biomodulator. Omdat de schotel zelf op grafiekpapier wordt geplaatst, kan het aantal rasterlijnen dat door het dier met de tijd wordt gekruist aangezien het zich over de container beweegt worden gebruikt om de snelheid van beweging in elke voorwaarde te bepalen. De licht/donkere test, ook wel de geconditioneerde plaatsvoorkeurstest (CPP) genoemd, is een andere variant op het thema van het monitoren van de planaire beweeglijkheid, en beoordeelt hoe snel de dieren reageren en migreren naar een verduisterde omgeving6,7. Video tracking van planaire bewegingen kan ook worden geanalyseerd met behulp van computerprogramma's en het centrum van de massa (COM) tracking8,,9,,10,11.
Het gebruik van de planarian als een dier model voor dergelijke studies biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere dieren in die tijd dat de onderzoeker gemakkelijk kan de test omgeving controle. In het bijzonder, hongeren de planarianen voor experimenten kan voorkomen dat hun blootstelling aan andere voedings-of farmacologische agentia die anders zou kunnen verwarren de resultaten, en de specifieke biomodulator in onderzoek kan worden ingevoerd om de planarianen gewoon door het direct toe te voegen aan de cultuur water, waardoor standaardiseren van de blootstelling. Aangezien planarianen een zenuwstelsel en neurotransmitters hebben die doen denken aan 'dieren met hogere orde', worden de fysiologie en experimentele reacties van deze dieren op neuromusculaire stimuli als biologisch relevant beschouwd voor andere organismen12,13,14,15,16. Ook, omdat planarianen zijn relatief goedkoop en eenvoudig te onderhouden in het laboratorium, ze bieden een toegankelijk biologisch model voor veel onderzoekers.
Als proefdier zijn planarianen geschikt voor een breed scala aan studies. Bijvoorbeeld, onze groep, evenals andere onderzoekers gebruiken planarianen om tumorigenese17,18,,19te bestuderen . Planarianen vertonen ook een groot aantal reactiegedrag op chemische, thermische, gravitatie-, elektrische, foto- en magnetische stimuli die de basis van andere testsystemen hebben gevormd. Sommige van deze effecten zijn gebruikt om leren en geheugen bij deze dieren te bestuderen20,21,22,23,24,25,26,27. Het primaire gebruik van het planariane model in de literatuur richt zich momenteel op de activiteit van planarian pluripotente stamcellen, neoblacden genoemd, en hun rol in regeneratie28,29,30. De goedkeuring van het hier beschreven model maakt het dus mogelijk om verder te bestuderen met behulp van andere op planaire gebaseerde tests om een breder begrip te bieden van de invloed van natuurlijke producten en andere biomodulatoren op het organisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Planaire veeteelt
- Gebruik planarianen gekocht bij een biologische levering bedrijf of wild gevangen indien nodig. De planarianen gebruikt in dit protocol zijn Dugesia tigrina, zoals vermeld in de levering lijst. Deze soort wordt ook wel Girardia tigrina31genoemd. Andere aquatische planaire soorten zijn ook aanvaardbaar2,3.
OPMERKING: Het beschreven protocol is afgestemd op dieren die bij een biologisch toeleveringsbedrijf zijn gekocht. Dit testsysteem is niet getest met in het wild gevangen planarianen. Echter, als wild gevangen planarianen worden gebruikt, wordt aanbevolen dat ze worden gewenning aan het water gebruikt in de experimenten, evenals het laboratorium omgeving voor ten minste 1 week voor gebruik. - Bij aankomst, overdracht planarianen naar plastic voedsel opslag containers met schoon bronwater en houd de deksels op een kier.
- Onderhoud planarianen in een verduisterde omgeving.
- Voer nieuw geleverde planarianen na 24-36 uur in hun nieuwe omgeving.
- Laat planariërs ten minste 1 week voor het experimenteren wennen aan het laboratorium.
- Voer planarianen op een regelmatige twee-per-week schema.
- Laat planariërs ad libitum voeden op gehakte biologische gekookte eieren of gemengde biologische rundvleeslever voor 1-2 uur.
- Plaats gevoed planarianen in een schone container na het voeden.
- Verwijder het vervuilde water van de planarianen.
- Gebruik een kleine platte aquarel penseel (nummer 3-6) om voedselresten en slijm vast te maken aan de container van rond de planarianen naar een papieren handdoek.
- Met vers bronwater en zachte werveling of agitatie, verjagen planarianen en giet ze in een schone container.
- Alle planariërs die zich aan de container houden, kunnen worden overgedragen met behulp van een ronde aquarelspint (nummer 3-6) of pipet met een brede boring overbrengen.
- Decanteer het transferwater.
- Bedek de planarianen met schoon bronwater.
- Na 24 uur verwijderen de planarianen uit elk uit het gesprocedeerde voedselafval te verwijderen door ze over te dragen aan een schone container zoals hierboven beschreven (stap 1.6.2.1–1.6.2.6).
- Voor het reinigen van containers en gebruiksvoorwerpen die worden gebruikt voor de planaire veeteelt, geen gebruik maken van zeep of wasmiddel. Reinig deze items door ze goed te spoelen met schoon water (kraanwater is acceptabel) en droog ze met een schone doek of papieren handdoek.
2. Voorbereiding van de planarianen voor experimenten
- Laat nieuw geleverde planariërs ten minste 1 week voor het experimenteren wennen aan hun omgeving.
- Verhongeren planarianen voor 5-10 dagen voorafgaand aan het experimenteren.
- Verander het kweekwater minstens 1x tijdens de hongerperiode.
3. Planarian locomotor velocity (pLmV) test: Stimulerend gedrag
- Voorafgaand aan het experimenteren, zorg ervoor dat uitgehongerde planarianen volledig worden gevormd, met een complete en gepigmenteerde kop en staart.
- Bereid een glazen of plastic petrischaal van 10 cm en een gewenningscontainer voor de pLmV-test voordat u aan het experiment begint.
- Plaats een schone petrischaal met een diameter van 10 cm voor de pLmV-test op voorgelamineerd roosterpapier (met 0,5 cm vierkant).
- Voeg 20 mL onvervalst bronwater voor bedieningselementen of bronwater met de juiste concentratie van het geteste natuurlijke product toe aan de petrischaal met een diameter van 10 cm die voor de pLmV-test moet worden gebruikt.
- Plaats een camera (bijvoorbeeld een mobiele telefoon of camera met hoge resolutie) boven de voorbereide petrischaal met een diameter van 10 cm om tijdens het experiment planaire beweeglijkheid over het rasterpapier vast te leggen. Een ringstandaard is een handige manier om de camera op een afstand te plaatsen die het volledige zicht op de 10 cm petrischaal- en rasterlijnen kan vastleggen.
- Bereid een gewenningscontainer voor met 5-10 mL onvervalst bronwater (controles), of bronwater met de juiste concentratie van het geteste natuurlijke product. Een container vergelijkbaar met een scintillatie flacon of kleine 5 cm Petri schotel is geschikt.
- Gebruik een kleine, schone, platte of ronde aquarel penseel om voorzichtig een planarian overbrengen van de voorraad container met bronwater naar de gewenning container met 5-10 mL onvervalst bronwater of bronwater met het natuurlijke product wordt getest.
OPMERKING: Gebruik bij het manipuleren van planarianen voor de pLmV-test een kleine, schone, platte of ronde aquarelspint (nummer 3–6). Bij het verplaatsen van planarianen moet de borstel onder het dier worden geplaatst om het voorzichtig op te tillen. Om ervoor te zorgen dat planariërs niet beschadigd raken bij het gebruik van de borstel, mogen de borstelharen niet onder het dier worden uitgespeeld. Verspreiding uit de haren kan schadelijk zijn voor de planarian als het wordt gevangen tussen de vezels van de borstel.
LET OP: Een brede boring transfer pipet kan ook worden gebruikt voor de overdracht van de planarian in een schone en droge gewenning container.- Bij gebruik van de pipet, verwijder overtollig water verplaatst met de planarian uit de gewenning container met behulp van de overdracht pipet.
- Voeg de gewenningsoplossing (d.w.z. bronwater voor controles of bronwater dat de concentratie van het geteste natuurlijke product bevat) voorzichtig toe aan de gewenningscontainer die de springerige bevat.
- Gewenningsperioden zijn afhankelijk van de stimulatiedynamiek die wordt beoordeeld voor het geteste natuurlijke product. Een gewenningstijd van 2 min bleek aanvaardbaar om stimulatie in dit werk op te sporen1.
- Na de 2 minuten gewenningsperiode gebruik maken van een aquarel penseel om voorzichtig de planarian overbrengen naar het centrum van de voorbereide 10 cm Petri schotel voor de pLmV stimulatie experiment.
- Start de camera om de beweging van de planarian op te nemen. Neem 10-11 min video op.
- Bereid de gewenningscontainer en de 10 cm Petri schotel voor op het pLmV-experiment met verse oplossingen voor elke planarian.
- Gebruik speciale pipetten, borden, containers en kwasten voor elke experimentele concentratie van het natuurlijke product dat wordt getest om te voorkomen dat er tijdens het experimenteren onbedoeld planarianen aan de verkeerde oplossing worden blootgesteld.
- Omdat planarianen aangeleerd gedrag vertonen, mag elke planarian (controle of test) slechts eenmaal21,22worden gebruikt.
4. Planarian locomotor velocity (pLmV) test: Terugtrekking gedrag
- Voorafgaand aan het experimenteren, zorg ervoor dat uitgehongerde planarianen volledig worden gevormd, met een complete en gepigmenteerde kop en staart.
- Bereid een petrischaal van 10 cm (glas of plastic) voor het pLmV-experiment, een petrischaal van 5 cm (glas of plastic) voor het spoelen van de vaatschaal na gewenning en een gewenningscontainer voordat het experiment begint.
- Plaats een schone petrischaal met een diameter van 10 cm voor het pLmV-experiment op voorgelamineerd roosterpapier met 0,5 cm vierkantjes).
- Voeg 20 mL onvervalst bronwater toe aan de petrischaal met een diameter van 10 cm die voor het pLmV-experiment moet worden gebruikt.
- Plaats een camera boven de voorbereide petrischaal met een diameter van 10 cm als in stap 3.2.3 om planaire beweeglijkheid over het rasterpapier vast te leggen tijdens het experiment.
- Bereid de planarian rinse container door het toevoegen van 5 mL bronwater alleen aan de 5 cm Petri schotel.
- Bereid een gewenningscontainer voor met 5-10 mL onvervalst bronwater (controles) of bronwater dat het geteste natuurlijke product bevat. Een container vergelijkbaar met een scintillatie flacon of kleine 5 cm petrischaal (glas of plastic) is geschikt.
- Gebruik een kleine, schone, platte of ronde aquarelspint om een vaandeldrager over te brengen van bronwater naar de voorbereide gewenningscontainer met 5-10 mL onvervalst bronwater (controles) of bronwater dat het geteste natuurlijke product bevat. Verplaats het dier voorzichtig van de voorraadcontainer naar de gewenningscontainer. Zorg ervoor dat de planarian niet wordt beschadigd door de borstel.
OPMERKING: Gebruik bij het manipuleren van planarianen voor de pLmV-test een kleine, schone, platte of ronde aquarelspint (nummer 3–6). Bij het verplaatsen van planarianen moet de borstel onder het dier worden geplaatst om het voorzichtig op te tillen. Om ervoor te zorgen dat planariërs niet beschadigd raken bij het gebruik van de borstel, mogen de borstelharen niet onder het dier worden uitgespeeld. Verspreiding uit de haren kan schadelijk zijn voor de planarian als het wordt gevangen tussen de vezels van de borstel.
LET OP: Een brede boring transfer pipet kan ook worden gebruikt om de planarian over te brengen in een schone en droge gewenning container.- Bij gebruik van de pipet moet overtollig water dat met de planarian wordt verplaatst, met behulp van de transferpipet uit de gewenningscontainer worden verwijderd.
- Voeg de gewenningsoplossing (d.w.z. onvervalst bronwater voor controles of bronwater dat het geteste natuurlijke product bevat) voorzichtig toe aan de gewenningscontainer die de planarian bevat.
- Gewenningsperioden voor terugtrekking zijn afhankelijk van de stimulatiedynamiek die wordt beoordeeld voor het geteste natuurlijke product; 2-5 min voldoende zijn gebleken.
- Na de gewenningsperiode gebruik maken van een aquarel penseel om voorzichtig de planarian over te brengen naar de voorbereide 5 cm petrischaal met bronwater af te spoelen elk natuurlijk product uit de gewenningscontainer. Zorg ervoor dat de planarian niet wordt beschadigd door de borstel.
- Breng de planarian onmiddellijk over naar het midden van de bereide petrischaal van 10 cm met bronwater voor het pLmV-ontwenningsexperiment. Zorg ervoor dat de planarian niet wordt beschadigd door de borstel.
- Start de camera om de beweging van de planarian op te nemen. Neem 10-11 min video op.
- Bereid de gewenningscontainer, de spoelcontainer en de petrischaal van 10 cm voor op de pLmV-experiment met nieuwe oplossingen voor elke planarian.
- Gebruik speciale pipetten, borden, containers en kwasten voor elke experimentele concentratie van het natuurlijke product dat wordt getest om te voorkomen dat er tijdens het experimenteren onbedoeld planarianen aan de verkeerde oplossing worden blootgesteld.
- Omdat planarianen vertonen aangeleerd gedrag, gebruik elke planarian (controle of test) slechts eenmaal26,27.
5. Gegevensanalyse
- Bereid een tabel voor het verzamelen van gegevens om het gedrag en de beweeglijkheid van planarianen te documenteren terwijl het aantal rasterlijnen voor elke minuut tijdens de pLmV-run wordt overschreden. De tabel moet het mogelijk maken dat het geaccumuleerde aantal lijnen per minuut dat door de planarian wordt doorkruist, ook wordt gedocumenteerd. Voeg regels op voor notities en een tabel met definities om de observatie van gedrag tijdens de experimentele periode te tally, zoals 'wander' en 'stop' (zie Discussie).
- Met behulp van de video, tel het aantal volledige rasterlijnen gekruist door de planarian per minuut gedurende 10 minuten, en neem dat nummer op de tabel. Typisch planarian gedrag bestaat uit continue snelheid, voorwaarts gerichte, horizontale beweging, met periodieke bochten, en zonder stops.
- Begin de tijd van het experiment op het punt dat de planarian heeft verplaatst van de penseel gebruikt om het over te dragen aan de 10 cm Petri schotel. Neem deze begintijd op.
- Om te bepalen wanneer het dier een volledig rastervierkant kruist, focust u zich op het hoofd en scoort u één regel wanneer het hoofd volledig een vierkant kruist.
- Om een volledig raster te scoren wanneer de worm beweegt rond de rand van de schotel, visualiseren een afstand van 0,5 cm door te verwijzen naar de lijnen als ze uit te breiden van de marges van de schotel. Als de planarian de hoek van een vak kruist, verwijzen we naar de tweede regel die is overschreden om één rasterlijn te scoren. Nogmaals, focus op het hoofd om deze bepalingen te maken.
- Stop de video na elke minuut om de gegevens op te nemen.
- Wanneer u de video opnieuw start om de volgende minuut te tellen, als het hoofd van de worm zich tussen rasterlijnen bevond toen de video werd gestopt, registreert u de eerste regel die als een volledige doos is overschreden.
- Score het aantal rasterlijnen overschreden voor 10 min.
- Als het dier stopt met bewegen tijdens een pLmV-test en gedurende de opnametijd van 10 minuten geen rasterlijnen meer overschrijdt, documenteer dan het gedrag van de planarian in de gedragsgrafiek (bijvoorbeeld 'wander' of 'stop'). Dieren die tijdens de pLmV-test hun voorwaartse spoor staken, moeten in plaats daarvan rekening worden opgenomen met de gegevens die worden gepresenteerd als een frequentie van het totale aantal dieren dat aan die reagensconcentratie is blootgesteld. Coiling of krampachtig gedrag (bekend als een C-gedrag) het voorkomen van een voorwaartse beweging tijdens de gewenningsperiode geeft aan dat de concentratie van het natuurlijke product is niet geschikt voor gebruik in een pLmV test, omdat de pLmV test is op basis van beweeglijkheid. Gedrag van het type C kan worden geanalyseerd met behulp van een ander type analyse (zie Discussie).
- Test indien mogelijk meerdere experimentele concentraties van het natuurlijke product met ten minste 9-12 wormen op verschillende dagen en verschillende tijdstippen van de dag bij het bepalen van het totale effect van het reagens op de planaire fysiologie. Echter, als onderzoekers streven naar circadiane ritme-geïnduceerde variabiliteit te verminderen, experimenten kunnen worden uitgevoerd met constante verlichting op een bepaald tijdstip van de dag met behulp van wormen die worden gekweekt met getimede licht / donkere cycli en stel voedertijden. Ten minste twee experimenteerders die betrokken zijn bij het project om de mogelijkheid van het hebben van een individuele record gegevens, terwijl de tweede persoon telt de rasterlijnen 'blind' aan de voorwaarden die worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens. Het hebben van verschillende individuen die betrokken zijn bij het verzamelen van gegevens, evenals statistische berekeningen en analyse, vermindert ook mogelijke bias.
- Bereken rasterregeltellingen voor elke natuurlijke productconcentratie op elke dag ten opzichte van de controletellingen voor elke minuut, zodat gegevens uit verschillende dagen, tijden en experimenteerders kunnen worden gecombineerd. Deze gegevens kunnen worden gemiddeld en vervolgens geanalyseerd met behulp van Student's T-tests. De P-waarden voor elke test kunnen per minuut worden beoordeeld in vergelijking met de controle en tussen de reagensconcentraties. ANOVA-beoordelingen aan de hand van datasets die zijn afgeleid van verschillende experimentele concentraties bieden een verdere analysemethode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het laboratorium opgezet en de voorbereiding van de werkruimte voor het uitvoeren van de pLmV test moet worden voltooid voordat het experiment begint. Dit omvat de bereiding van de gewenningscontainer, spoelcontainer indien nodig (voor ontwenningsexperimenten), Petrischaal over gelamineerd roosterpapier en goed geplaatste camera(figuur 1). Zodra alle video's zijn genomen, is het raadzaam om een gemeenschappelijk datablad te gebruiken om het verzamelen en presenteren van gegevens tussen onderzoekers te standaardiseren(figuur 2 en figuur 2 supplement).
De camera opstelling moet zorgen voor een duidelijk beeld van de planarian en het net papier om een nauwkeurige beoordeling van de voortgang van het dier voor de duur van het experiment (Figuur 3A en Figuur 3A Supplement). Het verzamelen van gegevens moet het aantal doorgestreepte rasterlijnen omvatten, evenals het cumulatieve totale aantal lijnen dat per minuut van het experiment wordt overschreden (figuur 3B). Tijdens de pLmV-analyse hebben planarianen een continue snelheid, voorwaartse, horizontale beweging, met periodieke bochten, en stoppen niet. Bij het begin moet de eerste volledige rasterbox worden overgekruist als één, niet de eerste regel zoals bepaald in de voorbeeldvideo. Het is belangrijk om de begintijd van directionele beweging vast te leggen nadat de vaatmaker vrij is van de penseel die wordt gebruikt om het over te dragen aan de pLmV-schotel en daarna voor elke minuut door te gaan. Als een planarian deel uitmaakt van de weg door een doos op de minuut tijd, de volgende rasterlijn gekruist na het opnieuw opstarten van de video moet worden geteld als een volledige doos. Wanneer het dier beweegt rond de rand van de schotel, verwijzen naar de lijnen als ze uit te breiden van de schotel om een afstand van 0,5 cm te bepalen. Wanneer wormen de hoek van een vak tegenkomen, verwijzen naar de tweede regel gekruist om een rasterlijn te scoren. Richt je altijd op het hoofd om deze beslissingen te nemen. Als de planarian een strak gebied begint te bedekken, moet de onderzoeker opnieuw het hoofd van de worm volgen om de afstand van een volledige rasterdoos te controleren. Een voorbeeld van dit gedrag is opgenomen in de aanvullende video(Figuur 3A supplement).
Om de resultaten van elke proef te standaardiseren, moeten de pLmV-uitvoeringen worden berekend en uitgezet als het aantal vakken dat wordt gekruist ten opzichte van de voortgang van de overeenkomende controleworm(figuur 3B). Elke gebruiker moet worden opgeleid om de astest- en telregels uit te voeren voordat u begint met tests met behulp van reagentia van belang. Als benchmark bestrijken planarianen in bronwater met behulp van de experimentele opzet doorgaans ongeveer 24 dozen in 3 minuten(figuur 4A; gegevens van 4 gebruikers, gemiddeld 24,8 ± 4,8). Een reeks testreagensconcentraties moet worden onderzocht om het type gedragsanalyse te bepalen dat voor elk moet worden gebruikt. Voor pLmV-analyse moeten onderzoekers bepalen of de dieren beweeglijkheid vertonen bij blootstelling(figuur 4B). Andere soorten gedragsanalyses kunnen effectiever zijn voor verschillende soorten gedrag (zie discussie). Ten opzichte van de bronwatercontrole tonen stimulerende gegevens een toenemend aantal rasterlijnen die worden doorkruist als het dier door de pLmV-container beweegt met de gewenste concentratie van het testreagens in bronwater, nadat het in dezelfde concentratie van het testreagens is gewenning. In tegenstelling, ontwenningsgegevens zal een afnemend aantal rasterlijnen gekruist, ten opzichte van de bronwater controle, wanneer de planarian beweegt door de pLmV container met bronwater alleen, na te zijn gewenning in de gewenste concentratie van het reagens gemengd in bronwater (Figuur 4C en 4D). Met name kunnen openlijke opnamegegevens leiden tot minder schapstellingen van het net dan die van de controles , zoals is waargenomen in gegevens over de geïnduceerde intrekking van geneesmiddelen door andere groepen2,6.
Springwater controle planarianen zal bewegen over netlijnen voor de duur van het experiment. Het is echter mogelijk voor testplanarians om te stoppen met het oversteken van netlijnen tijdens de test. Als dit gebeurt, moeten deze gegevens afzonderlijk worden gemarkeerd van gegevens over wormen die hun voortgang over de rasterlijnen behouden. Het documenteren van deze gegevens als percentage van het totale aantal dieren dat aan die specifieke reagensconcentratie wordt blootgesteld, is een doeltreffende manier om de relatieve frequentie van deze bevindingen te illustreren(figuur 5A-C, figuur 5A supplement en figuur 5B-supplement). Gedrag dat de planarianen niet belet om rasterlijnen over te steken, moet worden opgenomen in de pLmV-analyse, zelfs als deze bewegingen de gestage vooruitgang van de dieren belemmeren.
Figuur 1: Representatieve opstelling voor de pLmV-test.
De laboratoriumruimte moet worden voorbereid voordat met de test wordt begonnen. Getoond is een typische opstelling met een 10 cm Petri schotel geplaatst over gelamineerd 0,5 cm grid papier. Een documentcamera is zodanig geplaatst dat een duidelijk zicht op de petrischaal van 10 cm kan worden opgenomen op een gekoppelde computer. Echter, elke camera kan worden gebruikt voor het opnemen van de voortgang van de planarianen tijdens het experiment met inbegrip van een mobiele telefoon camera gepositioneerd boven de petrischaal met behulp van een ring standaard. Op de achtergrond is een 5 cm Petri schotel om wormen te spoelen voor terugtrekking experimenten, evenals kleine witte containers gebruikt voor het wennen van de planarianen. Ook op de achtergrond zijn gelabeld, speciale ronde aquarel kwasten, pipetten, en petrischaaltjes voor elke productconcentratie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: pLmV-gegevensblad.
Een voorbereid gegevensblad om het aantal gekruiste rasterlijnen vast te leggen, de bijbehorende relatieve controlegegevens, evenals een middel om gedragingen samen te stellen, is nuttig voor het verzamelen van gegevens. Zie Figuur 2 Supplement voor een downloadbare PDF-versie van dit cijfer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatief pLmV-experiment en gegevensblad.
(A) Boven de petrischaal van 10 cm die voor de pLmV-test wordt gebruikt, moet een camera worden geplaatst, zodat het planaire en het volledige rooster van 0,5 cm onder de schotel duidelijk zichtbaar is. De volledige pLmV-run moet worden geregistreerd (figuur 3A Supplement) en (B) het aantal rasterlijnen dat elke minuut wordt overschreden, in een voorbereide gegevenstabel geplaatst. De geaccumuleerde totale rasterlijnen gekruist moeten worden geteld, en dan moeten deze worden omgezet in het aantal geaccumuleerde lijnen gekruist ten opzichte van de overeenkomstige bronwater controle worm. De gegevens op de(B)verstrekte cijfertabel komen overeen met de tellingen met behulp van de aanvullende video (figuur 3A supplement). De bijbehorende controletellingen worden niet weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Representatieve grafieken van stimulerende en intrekkingsgegevens.
Onderzoekers moeten worden opgeleid om te gebruiken en te scoren van de pLmV test rasterlijnen met behulp van bronwater alleen voorafgaand aan experimenten. Typisch, planarianen reizen ongeveer 25 rasterlijnen in 3 min. (A) Gegevens van vier gebruikers wordt getoond, elk met 10 bronwater controle wormen. Om het effect van een reagens op de planaire beweeglijkheid te waarderen, wordt een reeks concentraties onderzocht met behulp van de pLmV-test en wordt het totale aantal doorgestreepte rasterlijnen onderzocht ten opzichte van de overeenkomstige controletellingen op 3 minuten. (B) Controlegegevens worden weergegeven door de witte balk. Testgegevens worden vertegenwoordigd door de zwarte balken, met de concentraties die worden gebruikt in mM. Met betrekking tot controlegegevens moeten worden uitgezet om de verzamelde gegevens het beste weer te geven. (C) Stimulerende gegevens vertegenwoordigd door de blauwe lijn / diamanten, zal een stijging van de rasterlijnen gekruist, ten opzichte van (D) terugtrekking gegevens, ook vertegenwoordigd door de blauwe lijn / diamanten, zal een dalende helling van een initiële startwaarde, ten opzichte van de controle gegevens, zoals blijkt uit de rode lijn / vierkanten in zowel (C en D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Observatie en documentatie van gedragsgegevens.
Planarianen in de pLmV-test die geen richtingsbewegingen tijdens het experiment handhaven, maar stoppen met karakteristiek gedrag en niet langer over de rasters bewegen, moeten worden geteld. Typisch gedrag kan zijn displays als 'wander' (A en Figuur 5A Supplement),en 'stop' (B en Figuur 5B Supplement). Deze tallies van gedragsgegevens moeten worden gepresenteerd om de frequentie van dit gedrag te documenteren in vergelijking met alle dieren die aan die productconcentratie (C) zijn blootgesteld. Getoond zijn voorbeeldgegevens die de percentages van bronwatercontroledieren (Ci) documenteren, en dieren die aan een stimulerend middel (Cii) worden blootgesteld, die een wandel (blauw), einde (rood) of geen (groen) gedrag hebben. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een eenvoudige en toegankelijke planaire beweeglijkheidstest wordt beschreven om de stimulerende en ontwenningseffecten van natuurlijke producten te bepalen. Als gedragsmodel is het noodzakelijk om strenge protocollen te hebben voor het scoren van beweging en duidelijke definities van elk gedrag om waarnemingen tussen verschillende onderzoekers te standaardiseren. De gepresenteerde ideeën geven een demonstratie van hoe dit kan worden bereikt. Elk laboratorium dat dit protocol gebruikt, moet de gepresenteerde informatie aanpassen aan de effecten van het geteste product. Het wordt aanbevolen om de werkruimte zorgvuldig in te stellen om ervoor te zorgen dat tests onder consistente omstandigheden kunnen worden uitgevoerd door elke onderzoeker die bij het onderzoek betrokken is(figuur 1). Gestandaardiseerde opnamebladen kunnen worden samengesteld om te helpen bij nauwkeurige registratie en het verzamelen van gegevens over beweeglijkheid en gedrag(figuur 2 en figuur 3B).
Beweeglijkheid tests moeten worden gedaan op verschillende tijdstippen van de dag, met behulp van verschillende partijen van planarianen indien mogelijk, om rekening te houden met uiteenlopende inherente circadiane activiteiten. Hoewel deze analyses niet zijn uitgevoerd, wordt gesuggereerd dat onderzoekers controleren hoe het planaire circadiane ritme de beweeglijkheid kan beïnvloeden door planarianen te handhaven met behulp van een standaard licht/donkere cyclus (bijvoorbeeld 12/12), en bij het uitvoeren van de pLmV-test, gebruik maken van standaardlichtomstandigheden en voeren de tests op hetzelfde tijdstip van dag32,33,34. Onderzoekers moeten de praktijk van de mechanica van de pLmV test en leren om rasterlijnen tellen om zowel de behandeling van de planarianen en de beoordeling van de planaire beweeglijkheid (figuur 3) te standaardiseren. Dit moet gebeuren met behulp van onvervalste bronwater controles. Typisch, na 10-20 dergelijke praktijk loopt, gegevens wordt heel standaard voor alle leden van het laboratorium. Telt na een set pLmV tijd moet worden gekozen om de voortgang in het leren van de test te vergelijken. Onderzoekers meestal observeren ongeveer 24 rasterlijnen gekruist door 3 min in de pLmV test in bronwater na een 2 min gewenning in bronwater (Figuur 4A; representatieve gegevens voor vier onderzoekers met 10 willekeurige bronwater controles elk; 24,8 ± 4,8 rasterlijnen). Het hebben van twee of drie getrainde onderzoekers die elke reeks tests uitvoeren, kan de betrouwbaarheid van de resultaten verder verbeteren, omdat bij de foutanalyse rekening kan worden gehouden met gebruikersspecifieke effecten op de methode en tellingen. Op deze manier kunnen tests en tellingen worden verwisseld tussen onderzoekers, zodat tellingen 'blind' kunnen worden gedaan voor de experimentele omstandigheden. Om de kans op bias te verkleinen, kunnen verschillende individuen statistische tests uitvoeren op de telgegevens en de daaropvolgende analyses uitvoeren. Buiten de aanwezigheid van het geteste product moeten milieuschommelingen in de waterkwaliteit, zoals temperatuur en pH, worden vermeden. Omdat planariërs lichtgevoelig zijn, moet de opzet van het experiment ervoor zorgen dat de verlichting van de werkruimte gelijk is. Ten slotte, omdat planarianen aangeleerd gedrag kunnen vertonen, mag elke worm, inclusief controles, slechts eenmaal26,27worden gebruikt.
Het is nuttig om een experimentele checklist in het lab te hebben als meerdere onderzoekers met de test werken, met name in een undergraduate onderzoekslaboratorium, om veelvoorkomende valkuilen te vermijden die kunnen optreden bij het uitvoeren van de pLmV-test, wat de statistische waarde van de resultaten zou beïnvloeden. Alle oplossingen moeten bij kamertemperatuur zijn omdat de planaire beweeglijkheid bij lagere temperaturen wordt verminderd. Er moet voor worden gezorgd dat de specimens 5-10 dagen voor het gebruik ervan worden uitgehongerd en dat elk monster volledig is gevormd, met een volledig gepigmenteerde kop en staart. Er wordt ook gesuggereerd dat speciale platte of ronde aquarel kwasten (nummer 3-6), gewenningscontainers en petrischaaltjes worden gebruikt voor elke experimentele concentratie om de workflow soepeler te maken voor de experimentator. De techniek van de overdracht van de planarianen met behulp van kleine platte of ronde aquarel kwasten moet uitgebreid worden beoefend door de onderzoekers om een efficiënte overdracht van de wormen tussen containers te waarborgen zonder letsel of angst voor de dieren (zie discussie hierboven; Figuur 4A). Het gebruik van deze kwasten minimaliseert de overdracht van vloeistoffen tussen de containers en vermindert mogelijke stress op de planarianen. Echter, planarianen kunnen worden beschadigd door de haren als de vezels worden verspreid of uitgespeeld wanneer ze contact opnemen met het dier.
Omdat de pLmV-test afhankelijk is van gedragsgegevens, is het essentieel om een voldoende grote gegevensset te gebruiken om robuuste gegevens te garanderen, ondanks aangeboren worm-naar-wormresponsvariabiliteit. Als zodanig gebruiken de meeste laboratoria ten minste negen tot twaalf planarianen om elke concentratie van het onderzochte product te testen, met name omdat natuurlijke producten mogelijk niet zo'n duidelijk effect hebben als standaardgeneesmiddelen1,2,3,4,5,6,7,13,14,15,16,35,36. Het aantal rasterlijnen dat elke minuut wordt overschreden, wordt berekend ten opzichte van de gegevens over de controle van het bronwater voor elke testdag en -tijd. Deze gegevens worden gemiddeld voor elke testconcentratie per minuut en vergeleken met de controlegegevens, evenals met andere tijdsgematchte concentraties met behulp van zowel Student's T-tests als ANOVA.
De pLmV-test is gericht op studies van reagentia die de beweeglijkheid van de planarianen beïnvloeden voor de duur van de testtijd. Gedetailleerde studies van planaire bewegingen kunnen worden uitgevoerd aan de hand van een aantal andere beoordelingen beschreven in de literatuur4,35,36,37,38. Daarom is het verstandig om een reeks gewenningsexperimenten uit te voeren om kennis te nemen van hoe de planarianen reageren op het testreagens met behulp van een reeks concentraties en eventuele effecten te vergelijken met het gedrag van de wormen in bronwater voordat ze beginnen aan gedragstests. Op deze manier kan de juiste gedragstest worden geselecteerd om de individuele maniërisme te bestuderen die door het reagens op de planarian wordt veroorzaakt. De planarianen kunnen worden geplaatst in verschillende concentraties van het reagens voor 5-10 min om te bepalen of een concentratie hen in staat stelt om hun typische zwemgedrag te behouden. Gedragingen die geen beweeglijkheid toestaan, zoals gedragingen die resulteren in een C-type, of krampachtig of epileptische gedrag, zijn de focus geweest van studies met afzonderlijke soorten gedragsanalyses die op deze methode kunnen worden toegepast4,39,40. pLmV-analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van een reeks concentraties na korte gewenningstijden en het aantal totale rasterlijnen dat op 3 min is overschreden ten opzichte van de controles van het bronwater voorafgaand aan de tijdscursusstimulatie en onttrekkingsanalyses (Figuur 4B)1,2,3,4,5. Onderzoekers worden aangemoedigd om andere tijden te bemonsteren, zoals 15, 30 en 60 min, om te zien of de stimulatiedynamiek verandert met de tijd van blootstelling1. Zoals is gemeld, in het voorjaar water controle wormen handhaven van een gestage, naar voren gerichte horizontale beweging voor de 10 min testtijd1,4. In tegenstelling, product-behandelde wormen kunnen stoppen en hun directionele beweeglijkheid te staken tijdens de test en niet langer dwars rasterlijnen. De onderzoeker kan een oordeel vellen of de lengte van de experimentele pLmV-run moet worden beperkt of dat hij een middel moet gebruiken om dit gedrag te beoordelen zoals beschreven. Het is echter belangrijk om de frequentie van dit gedrag te beoordelen, omdat ze aanvullende gegevens bieden die de beweeglijkheid beïnvloeden. Beweeglijkheid en bewegingsgegevens worden afzonderlijk besproken in het veld, omdat het combineren van de informatie de beoordeling van dergelijke gegevens verstoort4,35,36,37,38. Bij wijze van voorbeeld, twee gedragingen werden waargenomen wanneer de wormen gestopt en niet langer over de rasterlijnen tijdens de test. Deze bewegingen worden aangeduid als 'wander' (Figuur 5A En Figuur 5A Supplement), en 'stop' (Figuur 5B En Figuur 5B Supplement). De frequentie van dit gedrag wordt gedocumenteerd als percentages van alle dieren die aan de specifieke productconcentratie zijn blootgesteld, samen met de controlegegevens (Figuur 5C). Belangrijk is dat willekeurig gedrag dat de planarian niet belet om rasterlijnen over te steken, moet worden opgenomen in de pLmV-analyse, zelfs als deze bewegingen de gestage vooruitgang van de dieren belemmeren (Figuur 4B, 3 mM en 10 mM bars). Zoals vermeld, onderzoekers hebben beschreven een aantal gedragscategorieën die buiten het bereik van deze discussie van de pLmV tarief van beweeglijkheid protocol4,35,36,37,38.
De pLmV-test is gebaseerd op de oplosbaarheid van het onderzochte product. Veel van deze stoffen zijn echter niet volledig oplosbaar in water en als zodanig kunnen alleen de in water oplosbare delen door deze test worden getest, terwijl de rest uit de oplossing moet worden gefilterd, zoals in het vorige werk is gedaan1. Als pLmV-tests worden uitgevoerd met behulp van reagentia die zijn opgevangen met andere oplosmiddelen dan water, vereisen deze een volume-equivalente regeling naast de controle van het bronwater. Hoewel deze methode niet met dergelijke stoffen is gebruikt, moeten dergelijke vectorcontroles waarschijnlijk als een test worden behandeld en moet de beweeglijkheid ten opzichte van de controles worden beoordeeld, net als elke andere teststof. Een ander mogelijk middel om niet-oplosbare stoffen te testen zou zijn om ze te voeden aan de planarianen door ze te mengen in voedselgels. Deze techniek wordt gebruikt om siRNA te introduceren aan planarianen in gen knock-down / RNAi experimenten41. Het voeden van planarianen biologische producten en siRNA, echter, vormt complicaties voor deze test in dat de planarianen niet zouden worden uitgehongerd en niet kunnen worden overgebracht naar de beweeglijkheidstestcontainer binnen een gestandaardiseerde tijd die gelijke blootstelling of inname van het onderzochte product door de proefdieren vóór het testen garandeert.
Zodra stimulerende en ontwenningsdynamiek is vastgesteld met behulp van de pLmV-test, kan verdere experimenten comodulatoren, de introductie van siRNA, evenals biologische routemodifiers of geneesmiddelen omvatten om te testen op de vergroting of remming van de waargenomen beweeglijkheidseffecten in vergelijking met de eerste resultaten die worden verzameld wanneer deze biomodtoren niet worden gebruikt1,3. Bijvoorbeeld, downregulatie van de expressie van een gen of het toevoegen van route remmers kan de snelheid van beweging te verminderen, terwijl anderen kunnen de dynamiek van terugtrekking te veranderen. Door de observatie van gewijzigde pLmV-resultaten kunnen deze aanvullende experimenten inzicht geven in de onderliggende fysiologie die wordt beïnvloed door een natuurlijk product of ander testreagens5,42,43,44.
De beschreven procedure is vatbaar voor elk laboratorium dat geïnteresseerd is in het bepalen van de stimulerende en ontwenningseffecten van een verscheidenheid aan biomodulatoren, waaronder veel natuurlijke producten. Voordelen van de toepassing van de planaire pLmV-test zijn onder meer hoe goedkoop en gemakkelijk te onderhouden deze dieren zijn, en dat ze ook onderwerpen kunnen zijn voor andere op planaire gebaseerde tests om een breed begrip te verschaffen van de fysiologische effecten van het onderzochte product.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen het kantoor van Institutional Advancement erkennen, en de Morrisville College Foundation voor een publicatie subsidie ter ondersteuning van dit werk, evenals de SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) voor hun voortdurende hulp en ondersteuning van undergraduate onderzoek aan SUNY Morrisville. We willen ook Sophia Hutchens bedanken voor nuttige opmerkingen over de beschreven techniek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
- Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
- Raffa, R. B., Valdez, J. M.
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
- Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
- Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. 0, 8-13 (2013).
- Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
- Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
- Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
- Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
- Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
- Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
- Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
- Raffa, R. B., Rawls, S. M. A model for drug action and abuse. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2008).
- Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
- Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
- Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
- Mason, P. R.
- Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
- Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
- Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
- de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
- Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, Pt 20 3799-3810 (2013).
- Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
- Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
- Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
- Animal Diversity. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Dugesia_tigrina/ (2019).
- Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
- Itoh, M. T., Igarashi, J.
- Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
- Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
- Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
- Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
- Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
- Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
- Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
- Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
- Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
- Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
- Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).
