Summary
Planer hareketliliği, hayvanların sadece kaynak suyundaki hareketi ile karşılaştırıldığında doğal ürünlerin uyarıcı ve geri çekilme özelliklerini ölçmek için kullanılır.
Abstract
Olmayan parazit planarian kullanarak basit, kontrol edilebilir bir araç, Dugesia tigrina, serbest yaşayan bir su yassı solucan, doğal ürünlerin uyarıcı ve çekilme özelliklerini incelemek için açıklanmıştır. Planer fizyolojinin benzersiz yönlerinden yararlanan deneysel tahliller yara iyileşmesi, rejenerasyon ve tümörigenez üzerine çalışmalara uygulanmıştır. Buna ek olarak, plancılar çeşitli çevresel uyaranlara duyarlılık sergiledikleri ve koşullu tepkileri öğrenme ve geliştirme yeteneğine sahip oldukları için, öğrenme ve hafızayı inceleyen davranış salitalatlarında kullanılabilirler. Planerler temel bir ikili simetri ve nörotransmitter sistemleri nöromüsküler biyomodülatörlerin etkilerini inceleyen çalışmalara uygun kullanan merkezi bir sinir sistemi sahip. Sonuç olarak, madde bağımlılığı ve geri çekilmeyi incelemek için planer hareketi ve hareketliliği izleyen deneysel sistemler geliştirilmiştir. Planer hareketlilik uyaranların etkisini izlemek için hassas, kolayca standartlaştırılmış bir hareketlilik testi potansiyeli sunduğundan, planarian lokomotor hız (pLmV) testi, hayvanların zaman içinde kesiştikleri ızgara çizgilerinin sayısının belirlenmesi yoluyla planerlerin hem uyarlanma hem de geri çekilme davranışlarını izlemek üzere uyarlanmıştır. Burada teknik ve uygulaması gösterilmiştir ve açıklanır.
Introduction
Açıklanan protokol, doğal maddelerin biyomodülatör etkilerini değerlendirmek için planer hareketlilik kullanır. Özellikle bu maddelerin uyarıcı olarak işlev olup olmadığını belirlemek için uyarlanmıştır, ve daha sonra ölçülebilir bir çekilme davranışı ile ilişkili olup olmadığını1. Planer lokomotor hız (pLmV) testi olarak bilinen bu test, ilk olarak bilinen farmakolojik ajanların test inde kullanıldı2,3. Bu planarian hareketlilik tabanlı test uygulaması beri popülaritesi büyüdü ve doğal ürünler 4 dışındaki maddeler ile ilgilenen farklı laboratuvarlar tarafından kabul edilmiştir4,5. Bu tisalim için, bir planarian bir çözünmüş biyomodülatör içeren kaynak suyu veya kaynak suyu içeren bir Petri kabına yerleştirilir. Yemeğin kendisi grafik kağıda yerleştirildiğinden, her durumdaki hareket oranını belirlemek için kabın üzerinde hareket ederken hayvanın zamanla kesiştisi ızgara çizgilerinin sayısı kullanılabilir. Işık / karanlık testi, aksi takdirde koşullu yer tercihi testi (CPP) olarak anılacaktır, planarian hareketlilik izleme teması başka bir varyasyon, ve hayvanların ne kadar hızlı tepki ve karanlık bir ortama göç değerlendirir6,7. Planer hareketlerin video takibi de bilgisayar programları ve kitle merkezi (COM) izleme8,9,10,11kullanılarak analiz edilebilir.
Bu tür çalışmalar için bir hayvan modeli olarak planarian kullanarak deneyci kolayca deneme ortamı kontrol edebilirsiniz diğer hayvanlarüzerinde çeşitli avantajlar sunuyor. Özellikle, deney öncesi planerlerin açlıktan ölmeleri, sonuçları bozabilecek diğer beslenme veya farmakolojik ajanlara maruz kalmalarını engelleyebilir ve araştırma altındaki spesifik biyomodülatör, sadece doğrudan kültür suyuna ekleyerek plancılara tanıtılabilir ve böylelikle maruziyeti standartlaştırabilir. Planarians 'yüksek derecede' hayvanları anımsatan bir sinir sistemi ve nörotransmitterler olduğundan, nöromüsküler uyaranlara bu hayvanların fizyolojisi ve deneysel tepkileri biyolojik olarak diğer organizmalar için ilgili olarak kabul edilir12,13,14,15,16.16 Ayrıca, planarians nispeten ucuz ve laboratuvarda korumak için basit olduğundan, birçok araştırmacı için erişilebilir bir biyolojik model sunuyoruz.
Deneysel bir hayvan olarak, planarians çalışmalar geniş bir yelpazede uygundur. Örneğin, grubumuzun yanı sıra diğer araştırmacılar tümörigenez17,18,,19çalışma planarians kullanın. Planarianlar ayrıca diğer istibak sistemlerinin temelini oluşturan kimyasal, termal, yerçekimsel, elektriksel, fotoğraf ve manyetik uyaranlara tepki davranışları sergilerler. Bu etkilerden bazıları bu hayvanlarda öğrenme ve hafıza yı incelemek için kullanılmıştır20,21,22,23,24,25, 26,,27.27 Şu anda literatürde planer modelin birincil kullanımı planer pluripotent kök hücrelerin aktivitesi üzerinde duruluyor, neoblastlar denilen, ve rejenerasyon rolleri28,29,30. Böylece, burada açıklanan modelin benimsenmesi, doğal ürünlerin ve diğer biyomodülatörlerin organizmayı nasıl etkilediğine daha geniş bir anlayış sağlamak için diğer planer tabanlı tahlilleri kullanarak daha fazla çalışma yapılmasına olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Planarya yetiştiriciliği
- Bir biyolojik tedarik şirketinden satın alınan veya gerekirse vahşi yakalanmış planarians kullanın. Bu protokolde kullanılan planarians Dugesia tigrina, tedarik listesinde listelenen vardır. Bu tür aynı zamanda Girardia tigrina31olarak adlandırılır. Diğer su planer türleri de kabul edilebilir2,3.
NOT: Açıklanan protokol, biyolojik tedarik şirketinden satın alınan hayvanlara yöneliktir. Bu test sistemi vahşi yakalanmış planarians ile test edilmemiştir. Ancak, yabani yakalanmış planarianlar kullanılırsa, bu deneylerde kullanılan su yanı sıra en az 1 hafta kullanımdan önce laboratuvar ortamına alışmış olması tavsiye edilir. - Varışta, temiz kaynak suyu içeren plastik gıda saklama kaplarına planerleri aktarın ve kapakları açık tutun.
- Planerleri karanlık bir ortamda koruyun.
- Yeni ortamlarında 24-36 saat sonra yeni teslim edilen planerleri besleyin.
- Planerlerin deneyden en az 1 hafta önce laboratuvara alışmalarına izin verin.
- Planerleri haftada iki kez düzenli olarak besleyin.
- Planerler doğranmış organik haşlanmış yumurta veya 1-2 saat için harmanlanmış organik sığır karaciğeri üzerinde reklam libitum beslemek için izin verin.
- Beslendikten sonra temiz bir kap içine beslenen planarians yerleştirin.
- Plancılarkapalı kirli su çıkarın.
- Küçük bir düz suluboya boya fırçası kullanın (sayı 3-6) bir kağıt havlu etrafında planarians gelen konteyner gıda enkaz ve balçık yapıştırma aktarmak için.
- Taze kaynak suyu ve nazik dönen veya ajitasyon ile, planarians yerinden ve temiz bir kap içine dökün.
- Konteyner e bağlı kalan herhangi bir planarians yuvarlak suluboya boya fırçası (sayı 3-6) veya geniş delik li transfer pipet kullanılarak transfer edilebilir.
- Transfer suyunu dekant.
- Temiz kaynak suyu ile planarians kapak.
- Saat 24'ten sonra, planerleri yukarıda açıklandığı gibi temiz bir konteynere aktararak herhangi bir gıda atıklarından çıkarın (1.6.2.1-1.6.2.6.
- Planer yetiştiriciliğinde kullanılan kap ları ve mutfak gereçlerini temizlemek için sabun veya deterjan kullanmayın. Temiz su ile iyice durulayarak bu öğeleri temiz leyin (musluk suyu kabul edilebilir) ve temiz bir bez veya kağıt havlu ile kurutarak.
2. Plancıların deneyler için hazırlanması
- Yeni teslim edilen plancıların denemelerden en az 1 hafta önce ortamlarına alışmalarına izin verin.
- Deneyden önce 5-10 gün boyunca planerleri aç.
- Açlık döneminde kültür suyunu en az 1x değiştirin.
3. Planarian lokomotor hız (pLmV) testi: Uyarıcı davranışlar
- Deneyden önce, açlıktan ölen planerlerin tam ve pigmentli bir baş ve kuyrukla tam olarak oluştuğundan emin olun.
- Deneye başlamadan önce pLmV testi için bir cam veya plastik 10 cm Petri kabı ve bir alışma kabı hazırlayın.
- PLmV testi için kullanılacak temiz 10 cm çapında petri kabını prelaminated ızgara kağıdına (0,5 cm kareli) yerleştirin.
- PLmV testi için kullanılacak 10 cm çapındaki Petri kabına, kontroller için 20 mL katkısız kaynak suyu veya test edilen doğal ürünün uygun konsantrasyonuna sahip kaynak suyu ekleyin.
- Deney sırasında ızgara kağıdı üzerinde planer hareketliliği kaydetmek için hazırlanan 10 cm çapındaki Petri kabının üzerine bir kamera (örn. cep telefonu veya yüksek çözünürlüklü kamera) yerleştirin. Halka standı, kamerayı 10 cm Petri kabının ve ızgara hatlarının tüm görünümünü kaydedebilecek bir mesafede konumlandırmanın kullanışlı bir yoludur.
- Test edilen doğal ürünün uygun konsantrasyonunu içeren 5-10 mL katkısız kaynak suyu (kontrol) veya kaynak suyu içeren bir alışma kabı hazırlayın. Bir scintillation vial veya küçük 5 cm Petri çanak benzer bir kap uygundur.
- Küçük, temiz, düz veya yuvarlak suluboya boya fırçası kullanarak bir planarian'ı kaynak suyu içeren stok kabından 5-10 mL katkısız kaynak suyu veya test edilen doğal ürünü içeren kaynak suyu içeren kullanım kabına nazikçe aktarın.
NOT: PLmV tkabenleri için planerleri manipüle ederken, küçük, temiz, düz veya yuvarlak suluboya boya fırçası (sayı 3-6) kullanın. Planarians hareket ederken, fırça yavaşça kaldırmak için hayvan ın altına yerleştirilmelidir. Fırçayı kullanırken planerlerin zarar görmemesini sağlamak için, fırçanın kılları hayvanın altına takılmamalıdır. Kıllardan dışarı yayılan fırça lifleri arasında yakalanırsa planarian zarar verebilir.
NOT: Planacının temiz ve kuru bir alışma kabına aktarılmasında geniş delikli transfer pipetleri de kullanılabilir.- Pipet kullanıyorsanız, transfer pipetini kullanarak planarian ile taşınan fazla suyu yerleşim kabından çıkarın.
- Planör içeren alışma kabına, doğal ürün konsantrasyonunu içeren kontroller için kaynak suyu (yani, kontroller için kaynak suyu veya test edilen doğal ürün konsantrasyonunu içeren kaynak suyu) dikkatlice ekleyin.
- Alışma süreleri, test edilen doğal ürün için değerlendirilen stimülasyon dinamiklerine bağlıdır. 2 dk bir alışma süresi bu çalışmada stimülasyon tespit etmek için kabul edilebilir olduğunu kanıtladı1.
- 2 dk alışma süresini takiben, pLmV stimülasyon deneyi için planarian'ı hazırlanan 10 cm Petri kabının ortasına nazikçe aktarmak için bir suluboya boya fırçası kullanın.
- Planacının hareketini kaydetmek için kamerayı çalıştırın. 10-11 dk video kaydedin.
- Her planarian için taze çözümler ile pLmV deney için alışkanlık konteyner ve 10 cm Petri çanak hazırlayın.
- Deneme sırasında planarianları yanlışlıkla yanlış çözüme maruz bırakmaktan kaçınmak için test edilen doğal ürünün her deneysel konsantrasyonu için özel pipetler, tabaklar, kaplar ve boya fırçaları kullanın.
- Planarians öğrenilen davranışlar sergilemek için, her planarian (kontrol veya test) sadece bir kez kullanılmalıdır21,22.
4. Planarian lokomotor hız (pLmV) testi: Çekilme davranışları
- Deneyden önce, açlıktan ölen planerlerin tam ve pigmentli bir baş ve kuyrukla tam olarak oluştuğundan emin olun.
- PLmV deneyi için 10 cm Petri kabı (cam veya plastik), planarian'ı durulama için 5 cm Petri kabı (cam veya plastik) ve deneye başlamadan önce bir alışkanlık kabı hazırlayın.
- PLmV deneyi için kullanılacak temiz 10 cm çapında petri kabını 0,5 cm kareli prelaminated ızgara kağıdına yerleştirin).
- PLmV deneyi için kullanılacak 10 cm çapındaki Petri kabına 20 mL katkısız kaynak suyu ekleyin.
- Deney sırasında ızgara kağıdı üzerinde planarian hareketliliği kaydetmek için 3.2.3 adımda olduğu gibi hazırlanan 10 cm çapındaki Petri kabının üzerine bir kamera yerleştirin.
- 5 cm Petri kabına tek başına 5 mL kaynak suyu ekleyerek planer durulama kabını hazırlayın.
- Test edilen doğal ürünü içeren 5-10 mL katkısız kaynak suyu (kontrol) veya kaynak suyu içeren bir alışma kabı hazırlayın. Bir scintillation vial veya küçük 5 cm Petri çanak (cam veya plastik) benzer bir konteyner uygundur.
- Küçük, temiz, düz veya yuvarlak suluboya boya fırçası kullanarak bir planarian'ı kaynak suyundan hazırlanan kullanım kabına 5-10 mL katkısız kaynak suyu (kontrol) veya test edilen doğal ürünü içeren kaynak suyu içeren bir kutucuya aktarın. Hayvanı stok kabından yavaşça alışma kabına taşıyın. Planacının fırçadan zarar görmemesini sağlayın.
NOT: PLmV tkabenleri için planerleri manipüle ederken, küçük, temiz, düz veya yuvarlak suluboya boya fırçası (sayı 3-6) kullanın. Planarians hareket ederken, fırça yavaşça kaldırmak için hayvan ın altına yerleştirilmelidir. Fırçayı kullanırken planerlerin zarar görmemesini sağlamak için, fırçanın kılları hayvanın altına takılmamalıdır. Kıllardan dışarı yayılan fırça lifleri arasında yakalanırsa planarian zarar verebilir.
NOT: Planarian'ı temiz ve kuru bir alışma kabına aktarmak için geniş delikli transfer pipetleri de kullanılabilir.- Pipet kullanıyorsanız, planarian ile taşınan fazla su transfer pipeti kullanılarak alışma kabından çıkarılmalıdır.
- Planör içeren alışkanlık kabına, kontroller için katıksız kaynak suyu veya test edilen doğal ürünü içeren kaynak suyu gibi alışılmış çözeltiyi (örn. katkısız kaynak suyu) dikkatlice ekleyin.
- Çekilme için alışma süreleri, test edilen doğal ürün için değerlendirilen stimülasyon dinamiklerine bağlıdır; 2-5 dk yeterli kanıtlanmıştır.
- Alışma süresini takiben, planarian'ı, alışılmış kabından herhangi bir doğal ürünü durulamak için kaynak suyu içeren 5 cm Petri kabına nazikçe aktarmak için bir suluboya boya fırçası kullanın. Planacının fırçadan zarar görmemesini sağlayın.
- PLmV çekme deneyi için hemen planarian'ı hazırlanan 10 cm Petri kabının ortasına geçirin. Planacının fırçadan zarar görmemesini sağlayın.
- Planacının hareketini kaydetmek için kamerayı çalıştırın. 10-11 dk video kaydedin.
- Her planarian için taze çözümler ile pLmV deney için habituation konteyner, durulama kabı ve 10 cm Petri çanak hazırlayın.
- Deneme sırasında planarianları yanlışlıkla yanlış çözüme maruz bırakmaktan kaçınmak için test edilen doğal ürünün her deneysel konsantrasyonu için özel pipetler, tabaklar, kaplar ve boya fırçaları kullanın.
- Plancılar öğrenilen davranışları sergilediklerinden, her planarian (kontrol veya test) sadece bir kez26,27kullanın.
5. Veri analizi
- PLmV çalışması sırasında her dakika için çapraz ızgara çizgi sayısı olarak planerlerin davranışını ve hareketliliğini belgelemek için bir veri toplama tablosu hazırlayın. Tablo, planacı tarafından geçilen dakika başına birikmiş satır sayısının da belgelemesine izin vermelidir. 'Gezinme' ve 'dur' gibi deneysel dönemdeki davranışların gözlemini saymak için notlar için satırlar ve tanımlar tablosu ekleyin (bkz. Tartışma).
- Videoyu kullanarak, planarian tarafından dakikada geçen tam ızgara çizgilerinin sayısını 10 dakika boyunca sayın ve bu sayıyı veri tablosuna kaydedin. Tipik planer davranış sürekli hız oluşur, ileri yönelimli, yatay hareket, periyodik dönüşler ile, ve durur olmadan.
- Deneyi planacının 10 cm Petri kabına aktarmak için kullanılan fırçadan hareket ettiği noktada zamana başlayın. Bu başlangıç saatini kaydedin.
- Hayvanın tam bir ızgara karesini ne zaman geçtiğini belirlemek için, kafaya odaklanın ve kafa tam bir kareyi geçtiğinde bir çizgi çizin.
- Solucan yemeğin kenarında hareket ettiğinde tam bir ızgara elde etmek için, yemeğin kenarlarından dışarı yayılan çizgilere atıfta bulunarak 0,5 cm'lik bir mesafe görselleştirin. Planer bir kutunun köşesinden geçerse, bir ızgara çizgisi elde etmek için geçen ikinci çizgiye bakın. Yine, bu tespitleri yapmak için kafa odaklanmak.
- Verileri kaydetmek için her dakikadan sonra videoyu durdurun.
- Videoyu bir sonraki dakikayı saymak için yeniden başlatırken, video durdurulduğunda solucanın kafası ızgara çizgileri arasındaysa, ilk satırın tam kutu olarak kesişti kaydettiğini kaydedin.
- Puan ızgara hatları sayısı 10 dakika için geçti.
- Hayvan bir pLmV testi sırasında hareket etmeyi durdurur savese ve 10 dk kayıt süresi boyunca artık ızgara çizgilerini geçmiyorsa, davranış şemasındaki planacının davranışını belgeleyin (örn. 'gezinme' veya 'dur'). PLmV teşhiri sırasında ileri takibini durduran hayvanlar dikkate alınmalı ve bu reaktif konsantrasyonuna maruz kalan toplam hayvan sayısının sıklığı olarak sunulan veriler dikkate alınmalıdır. Alışkanlık döneminde herhangi bir ileri hareketi engelleyen sarmal veya konvülsif davranış (C davranışı olarak bilinir) pLmV tsede hareketlilik tabanlı olduğu için doğal ürünün konsantrasyonunun pLmV testinde kullanılmasının uygun olmadığını gösterir. C tipi davranışlar farklı bir analiz türü kullanılarak analiz edilebilir (bkz. Tartışma).
- Mümkünse, reaktifin planer fizyolojisi üzerindeki genel etkisini belirlerken, doğal ürünün farklı gün ve günlerinde en az 9-12 solucan kullanarak birden fazla deneysel konsantrasyonu test edin. Ancak, araştırmacılar sirkadiyen ritim kaynaklı değişkenliği azaltmak için çaba, deneyler zamanlanmış ışık / karanlık döngüleri ve set besleme süreleri ile kültürlü solucanlar kullanarak günün belirli bir saatinde sabit aydınlatma ile yapılabilir. İkinci tek tek, veri toplama için kullanılan koşullara 'kör' ızgara çizgileri sayarken, projede en az iki denemecinin tek bir kayıt verisine sahip olma seçeneğine izin vermeolanağı sağlaması gerekir. Farklı bireylerin veri toplamanın yanı sıra istatistiksel hesaplamalar ve analizlerde yer almaları da olası önyargıyı azaltır.
- Farklı gün, saat ve denemeden gelen verilerin birleştirilebilmeleri için her dakikanın kontrol sayılarına göre her gün deki her doğal ürün konsantrasyonu için ızgara çizgisi sayılarını hesaplayın. Bu veriler öğrencinin T-testleri kullanılarak ortalamaolarak ve analiz edilebilir. Her test için P-değerleri kontrol ve reaktif konsantrasyonları arasında göre dakika başına değerlendirilebilir. Farklı deneysel konsantrasyonlardan elde edilen veri kümeleri kullanılarak yapılan ANOVA değerlendirmeleri daha ileri bir analiz yöntemi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PLmV testini çalıştırmak için çalışma alanının kurulumu ve hazırlanması, deneme başlamadan önce tamamlanmalıdır. Buna alışma kabının hazırlanması, gerekirse durulayın kabı (çekilme deneyleri için), lamine ızgara kağıdı nın üzerine Petri kabı ve düzgün bir şekilde yerleştirilmiş kamera(Şekil 1)dahildir. Tüm videolar çekildikten sonra, araştırmacılar arasında veri toplama ve sunum(Şekil 2 ve Şekil 2 Eki)standartlaştırmak için ortak bir veri sayfası kullanılması tavsiye edilir.
Kamera kurmak planarian ve ızgara kağıt deney süresince hayvanın ilerleme doğru bir değerlendirme izin vermek için net bir görünüm için izin vermelidir(Şekil 3A ve Şekil 3A Eki). Veri toplama, kesilen ızgara çizgilerinin sayısını ve denemenin dakika başına kesişmiş toplam satır sayısını içermelidir(Şekil 3B). pLmV analizi sırasında, planerler periyodik dönüşlerle sürekli bir hıza, ileriye dönük, yatay bir mekanizmaya sahiptirler ve durmaz. Başlarken, geçen ilk tam ızgara kutusu örnek videoda belirlenen ilk satır değil, bir olarak puanlanmalıdır. Planlayıcı pLmV çanak aktarmak için kullanılan paintbrush ücretsiz sonra yön hareketinin başlangıç saatini kaydetmek için önemlidir, ve daha sonra her dakika için takip. Bir planarian dakika zamanda bir kutu ile yolun bir parçası ise, video yeniden başlattıktan sonra bir sonraki ızgara hattı tam bir kutu olarak sayılmalıdır geçti. Hayvan yemeğin kenarına doğru hareket ettiğinde, 0,5 cm'lik bir mesafeyi belirlemek için çanaktan dışarı yayılan çizgilere bakın. Solucanlar bir kutunun köşesiyle karşılaştıklarında, bir ızgara çizgisi elde etmek için geçen ikinci çizgiye bakın. Her zaman bu tespitleri yapmak için kafa odaklanmak. Planlayıcı dar bir alanı kaplamaya başlarsa, deneyci tam bir ızgara kutusunun uzaklıklarını izlemek için solucanın başını tekrar takip etmelidir. Bu davranışın bir örneği ek video(Şekil 3A ek)dahildir.
Her denemenin sonuçlarını standartlaştırmak için, pLmV çalıştırmaları hesaplanmalı ve eşleşen kontrol solucanının ilerlemesine göre geçilen kutu sayısı olarak çizilmelidir(Şekil 3B). Her kullanıcı, ilgi reaktifleri kullanarak testlere başlamadan önce tahlil ve sayma ızgara çizgilerini gerçekleştirmek üzere eğitilmelidir. Bir kriter olarak, deneysel kurulum kullanarak, kaynak suyundaki planerler genellikle 3 dakikada yaklaşık 24 kutuyu kaplarlar(Şekil 4A; 4 kullanıcıdan elde edilen veriler, ortalama 24,8 ± 4,8). Her biri için kullanılacak davranışsal analiz türünü belirlemek için bir dizi test reaktif konsantrasyonu incelenmelidir. pLmV analizi için araştırmacılar, hayvanların maruz kaldığında hareketlilik gösterip gösteremediğinde karar vermelidirler (Şekil 4B). Diğer davranışsal analiz türleri farklı davranış türleri için daha etkili olabilir (bkz. tartışma). Kaynak suyu kontrolüne göre, uyarıcı veriler, hayvan, test reaktifinin aynı konsantrasyonda alışkanlık haline gelen, kaynak suyunda test reaktifinin istenilen konsantrasyonu ile pLmV kabından geçerken, artan sayıda ızgara çizgisinin kesiştiklerini gösterecektir. Buna karşılık, yoksunluk verileri, kaynak suyu kontrolüne göre, planer insidansı tek başına kaynak suyu olan pLmV kabından geçerken, kaynak suyunda karıştırılan reaktifin istenilen konsantrasyonunda alışkanlık haline geldikten sonra, geçilen ızgara hatlarının azalan sayısını gösterecektir(Şekil 4C ve 4D). Özellikle, açık çekilme verileri ızgara kontrolleri daha az sayar yol açabilir, diğer gruplar tarafından ilaç kaynaklı yoksunluk verilerinde gözlenmiştir2,6.
Bahar suyu kontrol planerleri deney süresince ızgara hatları üzerinde hareket edeceklerdir. Ancak, test planerlerinin test sırasında Şebeke hatlarını geçmeyi durdurmaları mümkündür. Bu durumda, bu veriler, ızgara çizgileri üzerindeki ilerlemelerini koruyan solucanlar hakkındaki verilerden ayrı olarak vurgulanmalıdır. Bu verilerin, söz konusu reaktif konsantrasyonuna maruz kalan toplam hayvan sayısının yüzdesi olarak belgelemesi, bu bulguların göreceli sıklığını göstermenin etkili bir yoludur(Şekil 5A-C, Şekil 5A Eki ve Şekil 5B Eki). Plancıların ızgara çizgilerini aşmasını engellemeyen davranışlar pLmV analizine dahil edilmelidir, bu hareketler hayvanların sürekli ilerlemesini engellese bile.
Şekil 1: pLmV tsede için temsilci kurulumu.
Laboratuvar alanı, tisanın başlamasından önce hazırlanmalıdır. Gösterilen lamine 0,5 cm ızgara kağıt üzerine yerleştirilen 10 cm Petri çanak ile tipik bir kurulumdur. Bir belge kamera, 10 cm Petri kabının net bir görünümünün bağlantılı bir bilgisayarda kaydedilebildiği şekilde konumlandırılır. Ancak, herhangi bir kamera bir halka standı kullanarak Petri çanak üzerinde konumlandırılmış bir cep telefonu kamera da dahil olmak üzere deneme sırasında planerlerin ilerleme kayıt için kullanılabilir. Arka planda para çekme deneyleri için solucanları durulamak için 5 cm Petri çanak yanı sıra planarians alışmak için kullanılan küçük beyaz kaplar olduğunu. Ayrıca, arka planda, her ürün konsantrasyonu için özel yuvarlak suluboya boya fırçaları, pipetler ve Petri yemekleri etiketlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: pLmV veri sayfası.
Çaprazlanan ızgara çizgilerinin sayısını kaydetmek için hazırlanmış bir veri sayfası, denetim verilerine karşılık gelen göreliyanı sıra herhangi bir davranışı saymak için bir araç veri toplama amaçları için yararlıdır. Bu şeklin indirilebilir PDF sürümü için Şekil 2 Ek'e bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temsili pLmV deneyi ve veri sayfası.
(A) PLmV titreşmeiçin kullanılan 10 cm Petri kabının üzerine bir kamera yerleştirilmelidir ki, kabın altındaki planarian ve tam 0,5 cm'lik ızgara açıkça görülebilir. Tam pLmV çalışması kaydedilmelidir(Şekil 3A Eki), ve (B) hazırlanan bir veri tablosuna yerleştirilen her dakika geçen ızgara çizgilerinin sayısı. Biriken toplam ızgara çizgileri hesaplanmalıdır ve bunlar ilgili kaynak suyu kontrol solucanına göre aşılan birikmiş hat sayısına dönüştürülmelidir. Sağlanan şekil tablosundaki veriler (B) ek video(Şekil 3A Eki)kullanarak sayımları eşleşir. Karşılık gelen denetim sayıları gösterilmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Uyarıcı ve yoksunluk verilerinin temsili grafikleri.
Araştırmacılar, deneyden önce tek başına kaynak suyu kullanarak pLmV tsay ızgara hatlarını kullanmak ve puanlamak üzere eğitilmelidir. Tipik olarak, planerler 3 dakika içinde yaklaşık 25 ızgara hatları seyahat . (A) Dört kullanıcıdan veri gösterilir, her biri 10 kaynak suyu kontrol solucanları ile. Bir reaktifin planer hareketliliği üzerindeki etkisini takdir etmek için, pLmV tetkik kullanılarak bir dizi konsantrasyon incelenir ve kesişen toplam ızgara hattı sayısı 3 dakikadaki ilgili kontrol sayılarına göre incelenir. (B) Kontrol verileri beyaz çubuk tarafından temsil edilir. Test verileri, mM'de kullanılan konsantrasyonlarla birlikte siyah çubuklarla temsil edilir. Denetim verilerine göre toplanan verileri en iyi şekilde temsil edecek şekilde çizilmelidir. (C) Mavi çizgi/elmas tarafından temsil edilen uyarıcı veriler, çapraz ızgara çizgilerinde bir artış gösterecektir, karşı (D)para çekme verileri, aynı zamanda mavi çizgi/elmas ile temsil edilen, her ikisinde de kırmızı çizgi/kareler tarafından gösterildiği gibi, kontrol verilerine göre ilk başlangıç değerinden azalan bir eğim gösterecektir(C ve D). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Davranışsal verilerin gözlemlenmesi ve belgelenmesi.
PLmV titresinde yer alan plancılar deney sırasında yön hareketini sürdürmez, ancak karakteristik davranışlarla durur ve artık ızgaralar üzerinde hareket etmezler. Tipik davranışlar 'wander'(A ve Şekil 5A Eki)ve 'dur'(B ve Şekil 5B Eki)olarak ekranlar içerebilir. Bu davranışsal veri tallies bu ürün konsantrasyonu (C) maruz kalan tüm hayvanlarla karşılaştırıldığında bu davranışların sıklığını belgelemek için sunulmalıdır. Gösterilen örnek veri kaynak suyu kontrol hayvanları (Ci) ve bir uyarıcı (Cii) maruz kalan hayvanların yüzdelerini belgeleyen, bir gezinme (mavi), stop (kırmızı) veya hiç (yeşil) davranış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Basit ve erişilebilir planarian hareketlilik tetki, doğal ürünlerin uyarıcı ve yoksunluk etkilerini belirlemek için açıklanmıştır. Davranışmodeli olarak, farklı deneyciler arasındaki gözlemleri standartlaştırmak için puanlama hareketi ve herhangi bir davranışın net tanımları için sıkı protokollere sahip olmak gerekir. Sunulan fikirler, bunun nasıl sağlanabileceğinin bir göstergesidir. Bu protokolü kullanan her laboratuvar, sunulan bilgileri test edilen ürünün etkilerine uyacak şekilde uyarlamalıdır. Testlerin çalışmaya katılan her araştırmacı tarafından tutarlı koşullarda yapılabileceklerinden emin olmak için çalışma alanının dikkatle ayarlanabilmesi önerilir(Şekil 1). Standartlaştırılmış kayıt sayfaları, hareketlilik ve davranışlar(Şekil 2 ve Şekil 3B)hakkında hassas kayıt tutma ve veri toplama ile yardımcı olmak için derlenebilir.
Motilite testleri, doğal sirkadiyen faaliyetlerin farklılaşmasını hesaba katmak için, mümkünse farklı planarianlar kullanılarak günün çeşitli saatlerinde yapılmalıdır. Bu analizler yapılmamış olsa da, araştırmacıların planer sirkadiyen ritmin standart bir ışık/karanlık döngüsü (örneğin, 12/12) kullanarak planarianları koruyarak hareketliliği nasıl etkileyebileceğini izlemeleri ve pLmV testini yaparken standart aydınlatma koşullarını kullanmaları ve testleri32,33,34. Araştırmacılar pLmV test mekaniği uygulamalı ve planarians işleme ve planarian hareketlilik değerlendirilmesi hem de standartlaştırmak için ızgara hatları saymak öğrenmek(Şekil 3). Bu katkısız kaynak suyu kontrolleri kullanılarak yapılmalıdır. Tipik olarak, 10-20 bu tür uygulama çalışır sonra, veri tüm laboratuvar üyeleri için oldukça standart hale gelir. Bir set pLmV zaman sonra sayar tsay öğrenme ilerleme karşılaştırmak için seçilmelidir. Araştırmacılar genellikle kaynak suyunda 2 dk alışkanlığı nı takiben kaynak suyunda pLmV testinde 3 dk ile geçen yaklaşık 24 ızgara çizgisini gözlemlerler(Şekil 4A; her biri 10 rasgele kaynak suyu kontrolüne sahip dört araştırmacı için temsili veriler; 24,8 ± 4,8 ızgara hattı). Her bir test kümesini gerçekleştiren iki veya üç eğitimli araştırmacının olması sonuçların güvenilirliğini daha da artırabilir, çünkü yöntem ve sayımlar üzerindeki kullanıcıya özgü etkiler hata analizinde dikkate alınabilir. Bu şekilde, testler ve sayımlar araştırmacılar arasında değiştirilebilir, böylece sayımlar deneysel koşullara 'kör' yapılabilir. Önyargı olasılığını azaltmak için, farklı bireyler sayım verileri üzerinde istatistiksel testler yapabilir ve sonraki analizleri gerçekleştirebilir. Test edilen ürünün varlığı dışında, sıcaklık ve pH gibi su kalitesindeçevresel farklılıklardan kaçınılmalıdır. Plancılar ışığa duyarlı olduğundan, denemenin kurulumu çalışma alanının aydınlatmasının eşit olmasını sağlamalıdır. Son olarak, planerler öğrenilen davranışları sergileyebilir çünkü, her solucan, denetimler de dahil olmak üzere, sadece bir kez kullanılmalıdır26,27.
Birden fazla deneyci, özellikle bir lisans araştırma laboratuvarında, sonuçların istatistiksel değerini etkileyecek pLmV testi çalıştırırken oluşabilecek yaygın tuzakları önlemek için tahlil ile çalışıyorsa, laboratuvarda deneysel bir kontrol listesi olması yararlıdır. Tüm çözeltiler oda sıcaklığında olmalıdır, çünkü planer hareketliliği daha düşük sıcaklıklarda azalır. Örneklerin kullanımdan 5-10 gün önce açlıktan ölmelerine ve her bir numunenin tamamen pigmentli bir baş ve kuyrukla tam olarak oluşmasına özen gösterilmelidir. Ayrıca özel düz veya yuvarlak suluboya boya fırçaları (sayı 3-6), alışkanlık kapları ve Petri yemekleri deneyci için iş akışı daha düzgün hale getirmek için her deneysel konsantrasyon için kullanılması önerilmektedir. Küçük düz veya yuvarlak suluboya boya fırçaları kullanarak planarians transfer tekniği hayvanlariçin yaralanma veya sıkıntı ya da yaralanmaya neden olmadan konteynerler arasında solucanların verimli transferi sağlamak için araştırmacılar tarafından kapsamlı uygulanmalıdır (yukarıdaki tartışmaya bakın; Şekil 4A). Bu fırçaların kullanımı, kaplar arasındaki sıvı transferini en aza indirir ve plancılar üzerindeki potansiyel stresi azaltır. Ancak, lifyayılırsa veya hayvana temas ettiklerinde söndürülürlerse, planerler kıllardan zarar görebilirler.
pLmV tsözünde davranışsal verilere dayandığından, doğuştan gelen solucandan solucana yanıt değişkenliğine rağmen sağlam veriler sağlamak için yeterince büyük bir veri kümesi kullanılması esastır. Bu,nedenle, çoğu laboratuvar, özellikle doğal ürünler standart ilaç1,2,,3, 4,,,,5,6,7,13,14,15,16,35,36olarak işaretlenmiş bir etkiye sahip olmayabilir, incelenen ürünün her konsantrasyontest etmek için dokuz ila on iki planarians en az kullanın.5 Her dakika kesişen ızgara çizgilerinin sayısı, her test günü ve saati için kaynak suyu kontrol verilerine göre hesaplanır. Bu veriler her dakika için her test konsantrasyonu için ortalamadır ve kontrol verilerinin yanı sıra öğrencinin T-testleri ve ANOVA'yı kullanarak zamana uygun diğer konsantrasyonlarla karşılaştırılır.
PLmV testi, planerlerin hareketliliklerini etkileyen reaktiflerin çalışmalarına yöneliktir. Planarya hareketlerinin ayrıntılı çalışmaları literatürde açıklanan diğer değerlendirmeler kullanılarak yapılabilir4,35,36,37,38. Bu nedenle, planarians konsantrasyonları bir dizi kullanarak test reaktif tepki ve davranışsal testler başlamadan önce kaynak suyunda solucanların davranışı ile herhangi bir etkiyi karşılaştırarak nasıl bir dizi alışkanlık deneyleri yapmak için ihtiyatlı olduğunu. Bu şekilde, planarian üzerinde reaktif tarafından indüklenen bireysel mannerisms çalışmak için uygun davranış testi seçilebilir. Planerler bir konsantrasyon onları tipik yüzme davranışı korumak için izin olup olmadığını belirlemek için 5-10 dakika boyunca reaktif çeşitli konsantrasyonlarda yerleştirilebilir. C tipi veya konvülsif veya nöbet benzeri davranışlar gibi hareketliliğe izin vermeyen davranışlar, bu yönteme uygulanabilecek ayrı davranışsal analiz türleri kullanılarak yapılan çalışmaların odak noktası olmuştur.4,39,40. pLmV analizleri, kısa alışma sürelerinden sonra çeşitli konsantrasyonlar ve zaman kurs uyarımı ve çekilme analizlerinden önce kaynak suyu kontrollerine göre 3 dk'da geçen toplam ızgara çizgilerinin sayısı kullanılarak yapılabilir (Şekil 4B)1,2,3,4,5. Araştırmacılar, stimülasyon dinamiklerinin maruz kalma süresiyle birlikte değişip değişmeyeceğini görmek için 15, 30 ve 60 dk gibi diğer zamanları örneklemeye teşvik edilirler.1. Bildirildiği gibi, kaynak suyu kontrol solucanları 10 dk.1,4. Buna karşılık, ürün le tedavi solucanlar durdurmak ve tetkik sırasında yön hareketliliği durdurmak ve artık ızgara hatları çapraz. Araştırmacı deneysel pLmV çalıştırmak süresini sınırlamak için ya da açıklandığı gibi bu davranışları değerlendirmek için bir araç türetmek için bir karar verebilir. Ancak, bu davranışların sıklığını değerlendirmek önemlidir, çünkü bunlar hareketliliği etkileyen ek veriler sağlarlar. Hareketlilik ve hareket verileri alanında ayrı ayrı tartışılır, çünkü bilgilerin birleştirilmesi bu verilerin değerlendirilmesini4,35,36,37,38. Bir örnek olarak, solucanlar durduğunda ve taramayı sırasında artık ızgara çizgilerini geçemediğinde iki davranış gözlenmiştir. Bu hareketler 'wander' (Şekil 5A Ve Şekil 5A Eki), ve 'dur' (Şekil 5B Ve Şekil 5B Eki). Bu davranışların sıklığı, kontrol verileri ile birlikte belirli ürün konsantrasyonuna maruz kalan tüm hayvanların yüzdeleri olarak belgelenmiştir (Şekil 5C). Daha da önemlisi, planacının ızgara çizgilerini aşmasını engellemeyen rastgele davranışlar pLmV analizine dahil edilmelidir, bu hareketler hayvanların sürekli ilerlemesini engellese bile (Şekil 4B, 3 mM ve 10 mM çubuklar). Belirtildiği gibi, araştırmacılar hareketlilik protokolü pLmV oranı bu tartışmanın kapsamı dışında davranış salatıcı bir dizi tarif var4,35,36,37,38.
PLmV tne, araştırma altındaki ürünün su çözünürlüğüne dayanır. Bu maddelerin çoğu, ancak, suda tam olarak çözünür değildir ve, bu nedenle, sadece suda çözünen porsiyonlar bu test edilebilir geri kalanı önceki çalışmada olduğu gibi çözeltiden filtre edilmelidir1. PLmV tahlilleri su dışındaki çözücüler kullanılarak çözünürre reaktifler kullanılarak çalıştırılırsa, bunlar kaynak suyu kontrolüne ek olarak hacim eşdeğeri kontrol gerektirir. Bu yöntem bu tür maddelerile kullanılmamış olsa da, bu tür vektör kontrolleri büyük olasılıkla bir test olarak ele alınmalıdır ve hareketlilik diğer test maddeleri gibi kontrollere göre puanlandırılır. Çözünmeyen maddeleri test etmek için başka bir olası yolu gıda jelleri içine karıştırarak planarians onları beslemek olacaktır. Bu teknik, gen knock-down/RNAi deneylerinde planarianlara siRNA tanıtmak için kullanılır41. Ancak, planerlerin biyolojik ürünleri ve siRNA'sını beslemek, plancıların açlıktan ölmemesi ve test öncesinde deneysel hayvanlar tarafından incelenen ürünün eşit pozlama veya alımını sağlayan standart bir süre içinde hareketlilik test kabına aktarılamayacakları yönündeki bu titreşmeye komplikasyonlar sunar.
Bir kez uyarıcı ve yoksunluk dinamikleri pLmV tahlil kullanılarak kurulan, daha fazla deney comodulators içerebilir, siRNA giriş, yanı sıra biyolojik yol değiştiriciler veya ilaçların büyütme veya gözlenen motilite etkileriin inhibisyonu için test etmek için bu biyomodülatörler kullanılmazken toplanan ilk sonuçlara göre1,3. Örneğin, bir genin ekspresyonunu azaltmak veya yol inhibitörleri eklemek hareket hızını azaltabilirken, diğerleri çekilme dinamiklerini değiştirebilir. Değiştirilen pLmV sonuçlarının gözlem yoluyla, bu ek deneyler doğal bir ürün veya diğer test reaktifilerlemişaltta yatan fizyoloji içine fikir sağlayabilir5 ,42,43,44.
Açıklanan prosedür, birçok doğal ürün de dahil olmak üzere çeşitli biyomodülatörlerin uyarıcı ve yoksunluk etkilerini belirlemek isteyen herhangi bir laboratuvar için uygundur. Planer pLmV tahlil uygulamasının avantajları ne kadar ucuz ve kolay bu hayvanların bakımı dahil, ve onlar da araştırma altında ürünün fizyolojik etkileri geniş bir anlayış sağlamak için diğer planarian tabanlı tahliller için konu olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Kurumsal İlerleme ofis kabul etmek istiyorum, ve Morrisville College Vakfı bu çalışmayı desteklemek için bir yayın hibe yanı sıra SUNY Morrisville Collegiate Bilim ve Teknoloji Giriş Programı (CSTEP) onların devam eden yardım ve SUNY Morrisville lisans araştırma desteği için. Ayrıca Sophia Hutchens'a açıklanan teknik hakkında yararlı yorumları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
- Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
- Raffa, R. B., Valdez, J. M.
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
- Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
- Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. 0, 8-13 (2013).
- Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
- Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
- Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
- Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
- Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
- Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
- Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
- Raffa, R. B., Rawls, S. M. A model for drug action and abuse. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2008).
- Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
- Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
- Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
- Mason, P. R.
- Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
- Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
- Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
- de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
- Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, Pt 20 3799-3810 (2013).
- Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
- Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
- Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
- Animal Diversity. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Dugesia_tigrina/ (2019).
- Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
- Itoh, M. T., Igarashi, J.
- Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
- Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
- Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
- Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
- Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
- Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
- Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
- Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
- Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
- Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
- Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).
