Summary
La motilità planaria viene utilizzata per misurare le proprietà stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali rispetto al movimento degli animali solo nell'acqua di sorgente.
Abstract
Viene descritto un mezzo semplice e controllabile per utilizzare il planariano non parassita, Dugesia tigrina, un verme piatto acquatico vivente, per studiare le proprietà stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali. I saggi sperimentali che beneficiano di aspetti unici della fisiologia planaria sono stati applicati agli studi sulla guarigione delle ferite, la rigenerazione e la tumorigenesi. Inoltre, poiché i planari mostrano sensibilità a una varietà di stimoli ambientali e sono in grado di apprendere e sviluppare risposte condizionate, possono essere utilizzati in studi comportamentali che esaminano l'apprendimento e la memoria. I planari possiedono una simmetria bilaterale di base e un sistema nervoso centrale che utilizza sistemi di neurotrasmettitori su cui è possibile studi che esaminano gli effetti dei biomodulatori neuromuscolari. Di conseguenza, sono stati sviluppati sistemi sperimentali che monitorano il movimento planaria e la motilità per esaminare la dipendenza da sostanze e il ritiro. Poiché la motilità planaria offre il potenziale per un sistema di analisi della motilità sensibile e facilmente standardizzato per monitorare l'effetto degli stimoli, il test di velocità del locomotore planaria (pLmV) è stato adattato per monitorare sia i comportamenti di stimolazione che di ritiro da parte dei planari attraverso la determinazione del numero di linee di griglia attraversate dagli animali con il tempo. Qui, la tecnica e la sua applicazione sono dimostrati e spiegati.
Introduction
Il protocollo descritto utilizza la motilità planaria per fornire un mezzo per valutare gli effetti biomodulanti delle sostanze naturali. È stato specificamente adattato per determinare se queste sostanze funzionano come stimolanti, e se poi sono stati associati con un comportamento di astinenza misurabile1. Questo saggio, noto come il test di velocità locomotore planaria (pLmV), è stato utilizzato per testare noti agenti farmacologici2,3. L'applicazione di questo saggio planaria basato sulla motilità è da allora cresciuta in popolarità ed è stato adottato da diversi laboratori interessati a sostanze diverse dai prodottinaturali 4,5. Per questo esempio, un planariario viene posto in un piatto Petri contenente acqua di sorgente o acqua di sorgente contenente un biomodulatore disciolto. Poiché il piatto stesso è posto su carta millimetrata, il numero di linee della griglia attraversate dall'animale con il tempo mentre si muove sul contenitore può essere utilizzato per determinare la velocità di movimento in ogni condizione. Il test chiaro/scuro, altrimenti indicato come il test di preferenza posto condizionato (CPP), è un'altra variazione sul tema del monitoraggio della motilità planaria, e valuta quanto velocemente gli animali rispondono e migrano in un ambiente oscurato6,7. Il tracciamento video dei movimenti planari può anche essere analizzato utilizzando programmi informatici e il monitoraggio del centro di massa (COM)8,9,10,11.
L'utilizzo del planariano come modello animale per tali studi offre diversi vantaggi rispetto ad altri animali in quanto lo sperimentatore può facilmente controllare l'ambiente di analisi. In particolare, morire di fame i planariani prima della sperimentazione può impedire la loro esposizione ad altri agenti nutrizionali o farmacologici che potrebbero altrimenti confondere i risultati, e il biomodulatore specifico in esame può essere introdotto ai planari semplicemente aggiungendolo direttamente all'acqua di coltura, standardizzando così l'esposizione. Dal momento che i planari hanno un sistema nervoso e neurotrasmettitori che ricordano gli animali di ordine superiore, la fisiologia e le risposte sperimentali di questi animali agli stimoli neuromuscolari sono considerati biologicamente rilevanti per altri organismi12,13,14,15,16. Inoltre, poiché i planari sono relativamente economici e semplici da mantenere in laboratorio, offrono un modello biologico accessibile per molti ricercatori.
Come animale sperimentale, i planari sono adatti a una vasta gamma di studi. Ad esempio, il nostro gruppo, così come altri ricercatori utilizzano planariani per studiare la tumorigenesi17,18,19. I planariani presentano anche una serie di comportamenti di risposta agli stimoli chimici, termici, gravitazionali, elettrici, fotografici e magnetici che hanno costituito la base di altri sistemi di analisi. Alcuni di questi effetti sono stati utilizzati per studiare l'apprendimento e la memoria in questianimali 20,21,22,23,24,25,26,27. L'uso primario del modello planaria nella letteratura attualmente si concentra sull'attività delle cellule staminali pluripotenti planariari, chiamate neoblasti, e sul loro ruolo nellarigenerazione 28,29,30. Così, l'adozione del modello qui descritto consente un ulteriore studio utilizzando altri saggi a base planaria per fornire una comprensione più ampia di come i prodotti naturali e altri biomodulatori influenzano l'organismo.
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Protocol
1. Allevamento planaria
- Utilizzare planarini acquistati da una società di fornitura biologica o selvatici catturati se necessario. I planari utilizzati in questo protocollo sono Dugesia tigrina, come elencato nella lista di fornitura. Questa specie è anche indicata come Girardia tigrina31. Altre specie planariari acquatiche sono accettabilianche 2,3.
NOTA: Il protocollo descritto è orientato agli animali acquistati da una società di approvvigionamento biologico. Questo sistema di analisi non è stato testato con planari selvatici catturati. Tuttavia, se vengono utilizzati planarini catturati allo stato selvatico, si raccomanda che siano abituati all'acqua utilizzata negli esperimenti, così come all'ambiente di laboratorio per almeno 1 settimana prima dell'uso. - All'arrivo, trasferire i planari in contenitori di stoccaggio di alimenti in plastica contenenti acqua di sorgente pulita e mantenere i coperchi socchiusa.
- Mantenere i planari in un ambiente buio.
- Nutrire i planari appena consegnati dopo 24-36 h nel loro nuovo ambiente.
- Consentire ai planari di acclimatarsi al laboratorio almeno 1 settimana prima della sperimentazione.
- Nutrire i planarini con un programma regolare di due volte a settimana.
- Lasciare che i planari di nutrire il libitum su uova sode biologiche tritate o fegato di manzo biologico miscelato per 1-2 h.
- Mettere i planarini nutriti in un contenitore pulito dopo l'alimentazione.
- Togliere l'acqua sporca dai planari.
- Utilizzare un piccolo pennello ad acquerello piatto (numero 3-6) per trasferire i detriti alimentari e la melma aderente al contenitore da circa planari a un tovagliolo di carta.
- Con acqua di sorgente fresca e vorticoso dolce vorticoso o agitazione, spostare planarini e versarli in un contenitore pulito.
- Tutti i planari che rimangono aderenti al contenitore possono essere trasferiti utilizzando un pennello ad acquerello rotondo (numero 3-6) o pipette di trasferimento con un foro largo.
- Decantare l'acqua di trasferimento.
- Coprire i planari con acqua di sorgente pulita.
- Dopo 24 h, togliere i planari da eventuali rifiuti alimentari espulsi trasferendoli in un contenitore pulito come descritto sopra (punti 1.6.2.1–1.6.2.6).
- Per pulire i contenitori e gli utensili utilizzati per l'allevamento planaria, non utilizzare sapone o detergente. Pulire questi oggetti risciacquandoli bene con acqua pulita (l'acqua del rubinetto è accettabile) e asciugandoli con un panno pulito o un tovagliolo di carta.
2. Preparazione dei planari per esperimenti
- Consentire ai planari appena consegnati di acclimatarsi al loro ambiente almeno 1 settimana prima della sperimentazione.
- Affamezzare i planari per 5-10 giorni prima della sperimentazione.
- Cambiare l'acqua della cultura almeno 1x durante il periodo di fame.
3. Test di velocità del locomotore planaria (pLmV): comportamenti stimolanti
- Prima della sperimentazione, assicurarsi che i planarini affamati siano completamente formati, con una testa e una coda complete e pigmentate.
- Preparare un piatto Petri in vetro o plastica da 10 cm e un contenitore di assuola per il test pLmV prima di iniziare l'esperimento.
- Posizionare un piatto Petri pulito di 10 cm di diametro da utilizzare per il test pLmV su carta griglia prelaminata (con quadrati di 0,5 cm).
- Aggiungere 20 mL di acqua di sorgente non adulterata per i controlli, o acqua di sorgente contenente l'adeguata concentrazione del prodotto naturale in fase di prova, al piatto Petri di 10 cm di diametro da utilizzare per la prova pLmV.
- Posizionare una telecamera (ad esempio, un telefono cellulare o una fotocamera ad alta risoluzione) sopra la piastra Petri di 10 cm di diametro preparata per registrare la motilità planaria sulla carta griglia durante l'esperimento. Un supporto ad anello è un modo conveniente per posizionare la fotocamera a una distanza che può registrare l'intera vista della piastra Petri di 10 cm e delle linee della griglia.
- Preparare un contenitore di assuzione con 5-10 mL di acqua di sorgente non adulterata (controlli) o acqua di sorgente contenente l'adeguata concentrazione del prodotto naturale in fase di test. Un contenitore simile a una fiala scintillazione o piccolo piatto Petri di 5 cm è adatto.
- Utilizzare un pennello ad acquerello piccolo, pulito, piatto o rotondo per trasferire delicatamente un planariano dal contenitore di stock con acqua di sorgente al contenitore di assuvazione con 5-10 mL di acqua di sorgente non adulterata o acqua di sorgente contenente il prodotto naturale in fase di test.
NOTA: Quando si manipolano i planari per il test pLmV, utilizzare un pennello ad acquerello piccolo, pulito, piatto o rotondo (numero 3–6). Quando si spostano i planari, il pennello deve essere posizionato sotto l'animale per sollevarlo delicatamente. Per garantire che i planariani non siano danneggiati quando si utilizza il pennello, le setole del pennello non devono essere splayed sotto l'animale. La diffusione dalle setole potrebbe danneggiare il planaria se viene catturato tra le fibre del pennello.
NOTA: Un'ampia pipetta di trasferimento del foro può essere utilizzata anche per trasferire il planariano in un contenitore di abituazione pulito e asciutto.- Se si utilizza la pipetta, rimuovere l'acqua in eccesso spostata con il planariano dal contenitore di assuntezza utilizzando la pipetta di trasferimento.
- Aggiungere con attenzione la soluzione di assunazione (ad esempio, acqua di sorgente per i controlli o acqua di sorgente contenente la concentrazione di prodotto naturale in fase di prova) al contenitore di assunazione contenente il planariano.
- I periodi di assuzia dipenderanno dalla dinamica di stimolazione valutata per il prodotto naturale in fase di test. Un tempo di assuefazione di 2 min si è rivelato accettabile per rilevare la stimolazione in questolavoro 1.
- Dopo il periodo di assufizione di 2 minuti utilizzare un pennello ad acquerello per trasferire delicatamente il planariano al centro del piatto Petri preparato 10 cm per l'esperimento di stimolazione pLmV.
- Avviare la fotocamera per registrare il movimento del planariano. Registra 10-11 min di video.
- Preparare il contenitore di assuola e il piatto Petri da 10 cm per l'esperimento pLmV con soluzioni fresche per ogni planariano.
- Utilizzare pipette, piatti, contenitori e pennelli dedicati per ogni concentrazione sperimentale del prodotto naturale testato per evitare di esporre inavvertitamente i planari alla soluzione sbagliata durante la sperimentazione.
- Poiché i planari presentano comportamenti appresi, ogni planaria (controllo o test) deve essere utilizzato solouna volta 21,22.
4. Test di velocità del locomotore planaria (pLmV): comportamenti di ritiro
- Prima della sperimentazione, assicurarsi che i planarini affamati siano completamente formati, con una testa e una coda complete e pigmentate.
- Preparare un piatto Petri di 10 cm (vetro o plastica) per l'esperimento pLmV, un piatto Petri di 5 cm (vetro o plastica) per il risciacquo del planario dopo l'assuozione e un contenitore di assuola prima di iniziare l'esperimento.
- Posizionare un piatto Petri pulito di 10 cm di diametro da utilizzare per l'esperimento pLmV su carta griglia preminata con quadrati di 0,5 cm).
- Aggiungere 20 mL di acqua di sorgente non adulterata al piatto Petri di 10 cm di diametro da utilizzare per l'esperimento pLmV.
- Posizionare una telecamera sopra la piastra Petri di 10 cm di diametro preparata come nel punto 3.2.3 per registrare la motilità planaria sulla carta griglia durante l'esperimento.
- Preparare il contenitore di risciacquo planaria aggiungendo 5 mL di acqua di sorgente da solo al piatto Petri da 5 cm.
- Preparare un contenitore di assuzione con 5-10 mL di acqua di sorgente (controlli) non adulterati o acqua di sorgente contenente il prodotto naturale in fase di test. Un contenitore simile a una fiala scintillazione o piccolo piatto Petri 5 cm (vetro o plastica) è adatto.
- Utilizzare un pennello ad acquerello piccolo, pulito, piatto o rotondo per trasferire un planariario dall'acqua di sorgente al contenitore di assuntezza preparato con 5-10 mL di acqua di sorgente non adulterata (controlli) o acqua di sorgente contenente il prodotto naturale in fase di test. Spostare delicatamente l'animale dal contenitore di stoccaggio al contenitore di assuvazione. Assicurarsi che il planariano non sia danneggiato dal pennello.
NOTA: Quando si manipolano i planari per il test pLmV, utilizzare un pennello ad acquerello piccolo, pulito, piatto o rotondo (numero 3–6). Quando si spostano i planari, il pennello deve essere posizionato sotto l'animale per sollevarlo delicatamente. Per garantire che i planariani non siano danneggiati quando si utilizza il pennello, le setole del pennello non devono essere splayed sotto l'animale. La diffusione dalle setole potrebbe danneggiare il planaria se viene catturato tra le fibre del pennello.
NOTA: Una pipetta di trasferimento di fori ampia può essere utilizzata anche per trasferire il planariano in un contenitore di assunamento pulito e asciutto.- Se si utilizza la pipetta, l'acqua in eccesso spostata con il planariano deve essere rimossa dal contenitore di assuntezza utilizzando la pipetta di trasferimento.
- Aggiungere con attenzione la soluzione di assunazione (ad esempio, acqua di sorgente non adulterata per i controlli o acqua di sorgente contenente il prodotto naturale in fase di prova) al contenitore di assunamento contenente il planariano.
- I periodi di assulazione per il ritiro dipenderanno dalla dinamica di stimolazione valutata per il prodotto naturale in fase di sperimentazione; 2-5 min si sono dimostrati sufficienti.
- Dopo il periodo di assufizione utilizzare un pennello ad acquerello per trasferire delicatamente il planariano al piatto Petri preparato da 5 cm contenente acqua di sorgente per risciacquare qualsiasi prodotto naturale dal contenitore di assuola. Assicurarsi che il planariano non sia danneggiato dal pennello.
- Trasferire immediatamente il planariario al centro del piatto Petri preparato da 10 cm contenente acqua di sorgente per l'esperimento di ritiro del pLmV. Assicurarsi che il planariano non sia danneggiato dal pennello.
- Avviare la fotocamera per registrare il movimento del planariano. Registra 10-11 min di video.
- Preparare il contenitore di assuzia, il contenitore di risciacquo e il piatto Petri da 10 cm per l'esperimento pLmV con soluzioni fresche per ogni planariano.
- Utilizzare pipette, piatti, contenitori e pennelli dedicati per ogni concentrazione sperimentale del prodotto naturale testato per evitare di esporre inavvertitamente i planari alla soluzione sbagliata durante la sperimentazione.
- Poiché i planari presentano comportamenti appresi, utilizzare ogni planaria (controllo o test) solo unavolta 26,27.
5. Analisi dei dati
- Preparare una tabella di raccolta dati per documentare il comportamento e la motilità dei planari come il numero di linee della griglia attraversate per ogni minuto durante l'esecuzione di pLmV. La tabella dovrebbe consentire di documentare anche il numero accumulato di righe al minuto attraversate dal planariano. Includere righe per le note e una tabella di definizioni per contarla l'osservazione dei comportamenti durante il periodo sperimentale, ad esempio "wander" e "stop" (vedi Discussione).
- Utilizzando il video, contare il numero di linee della griglia completa attraversate dal planariano al minuto per 10 min e registrare tale numero nella tabella dati. Il tipico comportamento planaria è costituito da velocità continua, movimento orizzontale diretto in avanti, con curve periodiche e senza fermate.
- Iniziare a tempo l'esperimento nel punto che il planariano si è spostato dal pennello utilizzato per trasferirlo al piatto Petri 10 cm. Registrare l'ora di inizio.
- Per determinare quando l'animale attraversa un quadrato della griglia completa, concentrarsi sulla testa e segnare una linea quando la testa attraversa completamente un quadrato.
- Per segnare una griglia completa quando il verme si muove intorno al bordo del piatto, visualizzare una distanza di 0,5 cm facendo riferimento alle linee che si estendono dai margini del piatto. Se il planariano attraversa l'angolo di una casella, fare riferimento alla seconda linea attraversata per segnare una linea della griglia. Ancora una volta, concentrarsi sulla testa per fare queste determinazioni.
- Interrompere il video dopo ogni minuto per registrare i dati.
- Quando si riavvia il video per contare il minuto successivo, se la testa del worm era tra le linee della griglia quando il video è stato interrotto, registrare la prima linea attraversata come una scatola completa.
- Segna il numero di linee della griglia attraversate per 10 min.
- Se l'animale smette di muoversi durante un test pLmV e non attraversa più le linee della griglia durante il tempo di registrazione di 10 minuti, documenta il comportamento del planaria nella tabella comportamentale (ad esempio, 'wander' o 'stop'). Gli animali che cessano la loro pista in avanti durante il test del pLmV dovrebbero invece essere presi in considerazione e i dati presentati come frequenza del numero totale di animali esposti a tale concentrazione di reagente. Comportamento coiling o convulso (noto come un comportamento C) impedendo qualsiasi movimento in avanti durante il periodo di assuvazione indica che la concentrazione del prodotto naturale non è appropriato per l'uso in un saggio pLmV perché il saggio pLmV è motilità-based. I comportamenti di tipo C possono essere analizzati utilizzando un diverso tipo di analisi (vedere Discussione).
- Se possibile, testare più concentrazioni sperimentali del prodotto naturale utilizzando almeno 9-12 vermi in giorni diversi e in diversi momenti della giornata se si determina l'effetto complessivo del reagente sulla fisiologia planaria. Tuttavia, se i ricercatori si sforzino di ridurre la variabilità indotta dal ritmo circadiano, gli esperimenti possono essere condotti con un'illuminazione costante in un'ora impostata del giorno utilizzando vermi che vengono colturati con cicli di luce/scuro a tempo e orari di alimentazione impostati. Disporre di almeno due sperimentatori coinvolti nel progetto per consentire la possibilità di avere un singolo record di dati, mentre il secondo individuo conta le linee della griglia "cieche" alle condizioni utilizzate per la raccolta dei dati. Avere diverse persone coinvolte nella raccolta dei dati, così come i calcoli statistici e l'analisi, riduce anche possibili pregiudizi.
- Calcolare i conteggi delle linee della griglia per ogni concentrazione naturale del prodotto ogni giorno in relazione ai conteggi di controllo per ogni minuto in modo che i dati di giorni, orari e sperimentatori diversi possano essere combinati. Questi dati possono essere analizzati in base alla media e quindi analizzati utilizzando i test T di Student. I valori P per ogni prova possono essere valutati al minuto rispetto al controllo e tra le concentrazioni di reagenti. Le valutazioni ANOVA che utilizzano set di dati derivati da diverse concentrazioni sperimentali forniscono un ulteriore metodo di analisi.
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Representative Results
Il laboratorio istituito e la preparazione dello spazio di lavoro per l'esecuzione del test pLmV devono essere completati prima dell'inizio della sperimentazione. Ciò include la preparazione del contenitore di assunta, del contenitore di risciacquo se necessario (per gli esperimenti di ritiro), della piastra Petri sulla carta griglia laminata e della telecamera posizionata correttamente (Figura 1). Una volta che tutti i video sono presi, si consiglia di utilizzare un foglio dati comune per standardizzare la raccolta e la presentazione dei dati tra gli investigatori (Figura 2 e Figura 2 Supplemento).
La telecamera allestita dovrebbe consentire una visione chiara del planariano e della griglia per consentire una valutazione accurata dello stato di avanzamento dell'animale per tutta la durata dell'esperimento (Figura 3A e Figura 3A Supplemento). La raccolta dei dati deve includere il numero di linee della griglia attraversate, nonché il numero totale cumulativo di linee attraversate al minuto dell'esperimento (Figura 3B). Durante l'analisi pLmV, i planari hanno una velocità continua, diretta in avanti, movimento orizzontale, con curve periodiche, e non si fermano. All'inizio, la prima casella di griglia completa attraversata deve essere segnata come una, non la prima riga come determinato nel video di esempio. È importante registrare l'ora di inizio del movimento direzionale dopo che il planariano è privo del pennello utilizzato per trasferirlo sul piatto pLmV, e quindi seguire per ogni minuto successivo. Se un planariano fa parte della strada attraverso una casella all'ora del minuto, la linea della griglia successiva attraversata dopo il riavvio del video deve essere conteggiata come una casella completa. Quando l'animale si muove intorno al bordo del piatto, fare riferimento alle linee mentre si estendono fuori dal piatto per determinare una distanza di 0,5 cm. Quando i vermi incontrano l'angolo di una casella, fare riferimento alla seconda linea attraversata per segnare una linea della griglia. Concentrati sempre sulla testa per fare queste determinazioni. Se il planaria inizia a coprire un'area stretta, lo sperimentatore dovrebbe seguire nuovamente la testa del verme per monitorare la distanza di una scatola a griglia completa. Un esempio di questo comportamento è incluso nel video supplementare ( Figura 3A ).
Per standardizzare i risultati di ogni prova, le esecuzioni di pLmV devono essere calcolate e tracciate come il numero di caselle incrociate rispetto allo stato di avanzamento del worm di controllo corrispondente (Figura 3B). Ogni utente deve essere addestrato per eseguire il test e il conteggio delle linee della griglia prima di iniziare i test utilizzando reagenti di interesse. Come punto di riferimento, utilizzando l'allevamento sperimentale, i planari in acqua di sorgente coprono in genere circa 24 scatole in 3 minuti (Figura 4A; dati di 4 utenti, media di 24,8 ± 4,8). Per determinare il tipo di analisi comportamentale da utilizzare per ciascuna di essi, è necessario esaminare una gamma di concentrazioni di reagenti di prova. Per l'analisi pLmV, i ricercatori devono determinare se gli animali mostrano motilità quando esposti (Figura 4B). Altri tipi di analisi comportamentali possono essere più efficaci per diversi tipi di comportamenti (vedere la discussione). Relativamente al controllo dell'acqua di sorgente, i dati stimolanti mostreranno un numero crescente di linee di griglia attraversate mentre l'animale si muove attraverso il contenitore pLmV con la concentrazione desiderata del reagente di prova nell'acqua di sorgente, dopo essere stato abituale nella stessa concentrazione del reagente di prova. Al contrario, i dati di ritiro mostreranno un numero decrescente di linee di griglia attraversate, rispetto al controllo dell'acqua di sorgente, quando il planaria si muove attraverso il contenitore pLmV con acqua di sorgente da solo, dopo essere stato abituale nella concentrazione desiderata del reagente mescolato in acqua di sorgente (Figura 4C e 4D). In particolare, i dati di prelievo overt possono portare a conteggi della griglia inferiori a quelli dei controlli, come è stato osservato nei dati di ritiro indotti da farmaci daaltri gruppi 2,6.
I planari di controllo dell'acqua di sorgente si sposteranno sulle linee della rete per tutta la durata dell'esperimento. È possibile, tuttavia, che i planari dei test cessino di attraversare le linee della griglia durante il test. In questo caso, questi dati devono essere evidenziati separatamente dai dati sui worm mantenendone lo stato di avanzamento sulle linee della griglia. Documentare questi dati come percentuale del numero totale di animali esposti a quella particolare concentrazione di reagenti è un modo efficace per illustrare la frequenza relativa di questi risultati(Figura 5A-C, Figura 5A Supplemento e Figura 5B Supplemento). I comportamenti che non impediscono ai planari di attraversare le linee della griglia dovrebbero essere inclusi nell'analisi pLmV, anche se questi movimenti ostacolano il costante progresso degli animali.
Figura 1: impostazione rappresentativa per l'analisi pLmV.
Lo spazio di laboratorio deve essere preparato prima di iniziare il saggio. Mostrato è un setup tipico con un piatto Petri di 10 cm posto su carta griglia laminata da 0,5 cm. Una telecamera documento è posizionata in modo tale che una chiara vista della piastra Petri 10 cm può essere registrata su un computer collegato. Tuttavia, qualsiasi telecamera può essere utilizzata per registrare l'avanzamento dei planari durante l'esperimento, inclusa una telecamera del telefono cellulare posizionata sopra la piastra Petri utilizzando un supporto per anello. Sullo sfondo è un piatto Petri di 5 cm per risciacquare i vermi per esperimenti di ritiro, così come piccoli contenitori bianchi utilizzati per abituare i planari. Inoltre, sullo sfondo sono etichettati, pennelli ad acquerello rotondi dedicati, pipette e piatti Petri per ogni concentrazione di prodotto. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: scheda dati pLmV.
Un foglio dati preparato per registrare il numero di linee della griglia attraversate, il relativo corrispondente ai dati di controllo, nonché un mezzo per conciare qualsiasi comportamento è utile ai fini della raccolta dei dati. Vedere Figura 2 Supplemento per una versione PDF scaricabile di questa figura. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esperimento e scheda dati pLmV rappresentativa.
(A) Una telecamera deve essere posizionata sopra la piastra Petri da 10 cm utilizzata per il pLmV in modo tale che la griglia planaria e la griglia completa di 0,5 cm sotto il piatto sia chiaramente visibile. L'esecuzione pLmV completa deve essere registrata (Figura 3A Supplement) e (B) il numero di linee della griglia attraversate ogni minuto inserite in una tabella dati preparata. Le linee di griglia totali accumulate attraversate devono essere conteggiate, e quindi queste devono essere convertite nel numero di linee accumulate attraversate rispetto al corrispondente verme di controllo dell'acqua di sorgente. I dati nella tabella di figure fornita (B) corrispondono ai conteggi utilizzando il video supplementare (Figura 3A Supplement ). I conteggi dei controlli corrispondenti non vengono visualizzati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Grafici rappresentativi dei dati di stimolante e di ritiro.
I ricercatori dovrebbero essere addestrati a utilizzare e segnare le linee della griglia di analisi pLmV utilizzando solo l'acqua di sorgente prima della sperimentazione. Tipicamente, planarini viaggiano circa 25 linee della griglia in 3 min. ( A ) Vengonovisualizzatii dati di quattro utenti, ciascuno con 10 vermi di controllo dell'acqua di sorgente. Per apprezzare l'effetto di un reagente sulla motilità planaria, viene esaminata una serie di concentrazioni utilizzando il test pLmV e il numero totale di linee di griglia attraversate viene esaminato rispetto ai conteggi di controllo corrispondenti a 3 minuti. (B) I dati di controllo sono rappresentati dalla barra bianca. I dati di prova sono rappresentati dalle barre nere, con le concentrazioni utilizzate in mM. Relativo ai dati di controllo devono essere tracciati per rappresentare al meglio i dati raccolti. (C) I dati stimolanti rappresentati dalla linea blu/diamanti, mostreranno un aumento delle linee della griglia attraversate, rispetto (D) dati di ritiro, rappresentati anche dalla linea blu / diamanti, mostrerà una pendenza decrescente da un valore iniziale iniziale, rispetto ai dati di controllo, come mostrato dalla linea rossa / quadrati in entrambi (C e D). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Osservazione e documentazione dei dati comportamentali.
I planari nel saggio pLmV che non mantengono il movimento direzionale durante l'esperimento, ma si fermano con comportamenti caratteristici e non si muovono più sulle griglie devono essere conteggiati. I comportamenti tipici possono includere le visualizzazioni come 'wander' (A e Figura 5A Supplemento) e 'stop' (B e Figura 5B Supplemento). Questi conteggi di dati comportamentali dovrebbero essere presentati per documentare la frequenza di questi comportamenti rispetto a tutti gli animali esposti a tale concentrazione di prodotto (C). Sono mostrati dati campione che documenta le percentuali di animali di controllo dell'acqua di sorgente (Ci) e animali esposti a uno stimolante (Cii), con un comportamento vagabondo (blu), stop (rosso) o no (verde). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un semplice e accessibile analisi della motilità planaria è descritto per determinare gli effetti stimolanti e di ritiro dei prodotti naturali. Come modello comportamentale è necessario disporre di protocolli rigorosi per il movimento del punteggio e definizioni chiare di eventuali comportamenti per standardizzare le osservazioni tra diversi sperimentatori. Le idee presentate offrono una dimostrazione di come questo può essere raggiunto. Ogni laboratorio che utilizza questo protocollo deve adattare le informazioni presentate in base agli effetti del particolare prodotto in fase di test. Si consiglia di impostare con attenzione l'area di lavoro per garantire che i test possano essere eseguiti in condizioni coerenti da ogni ricercatore coinvolto nello studio (Figura 1). I fogli di registrazione standardizzati possono essere compilati per facilitare la conservazione precisa dei record e la raccolta dei dati sulla motilità e sui comportamenti (Figura 2 e Figura 3B).
I test di motilità devono essere effettuati in vari momenti della giornata, utilizzando diversi lotti di planari, se possibile, per tenere conto delle attività circadiane intrinseche divergenti. Anche se queste analisi non sono state condotte, si suggerisce agli investigatori di monitorare come il ritmo circadiano planariario potrebbe influenzare la motilità mantenendo i planari utilizzando un ciclo chiaro/scuro standard (ad esempio, 12/12), e quando conducono il saggio pLmV, utilizzare le condizioni di illuminazione standard ed eseguire i test alla stessa ora delgiorno 32,33,34. I ricercatori dovrebbero praticare la meccanica del saggio pLmV e imparare a contare le linee della griglia per standardizzare sia la gestione dei planari e la valutazione della motilità planaria (Figura 3). Questo dovrebbe essere fatto utilizzando controlli dell'acqua di sorgente non genuiuli. In genere, dopo 10-20 esecuzioni di tale pratica, i dati diventano abbastanza standard per tutti i membri del laboratorio. I conteggi dopo un tempo pLmV impostato devono essere scelti per confrontare i progressi nell'apprendimento del saggio. Gli investigatori in genere osservano circa 24 linee di griglia attraversate di 3 min nel test pLmV nell'acqua di sorgente a seguito di un'assutezione di 2 minuti nell'acqua di sorgente (Figura 4A; dati rappresentativi per quattro ricercatori con 10 controlli casuali dell'acqua di sorgente ciascuno; 24,8 ± 4,8 linee di rete). Avere due o tre investigatori addestrati che conducono ogni serie di test può migliorare ulteriormente l'affidabilità dei risultati perché qualsiasi effetto specifico dell'utente sul metodo e sui conteggi può essere preso in considerazione nell'analisi degli errori. In questo modo, i test e i conteggi possono essere scambiati tra i ricercatori in modo che i conteggi possano essere fatti "ciechi" alle condizioni sperimentali. Per ridurre la possibilità di bias, diversi individui potrebbero condurre test statistici sui dati di conteggio ed eseguire le analisi successive. Al di fuori della presenza del prodotto in fase di test, si dovrebbero evitare variazioni ambientali nella qualità dell'acqua, come la temperatura e il pH. Poiché i planari sono sensibili alla luce, la configurazione dell'esperimento dovrebbe garantire che l'illuminazione dello spazio di lavoro sia uniforme. Infine, poiché i planari possono presentare comportamenti appresi, ogni worm, inclusi i controlli, deve essere utilizzato solouna volta 26,27.
È utile avere una lista di controllo sperimentale in laboratorio se più sperimentatori stanno lavorando con il saggio, in particolare in un laboratorio di ricerca universitaria, per evitare insidie comuni che potrebbero verificarsi durante l'esecuzione del test pLmV, che influenzerebbe il valore statistico dei risultati. Tutte le soluzioni dovrebbero essere a temperatura ambiente perché la motilità planaria è ridotta a temperature più basse. Si deve fare attenzione a garantire che i campioni siano affamati 5-10 giorni prima del loro utilizzo e che ogni esemplare sia completamente formato, con una testa e una coda completamente pigmentate. Si suggerisce inoltre che i pennelli ad acquerello piatto o rotondo dedicati (numero 3-6), i contenitori di assuntezza e i piatti Petri siano utilizzati per ogni concentrazione sperimentale per rendere il flusso di lavoro più agevole per lo sperimentatore. La tecnica di trasferimento dei planari utilizzando piccoli pennelli ad acquerello piatto o rotondo deve essere ampiamente praticata dagli inquirenti per garantire un trasferimento efficiente dei vermi tra i contenitori senza causare lesioni o angoscia agli animali (vedi discussione sopra; Figura 4A). L'uso di questi pennelli riduce al minimo il trasferimento di liquidi tra i contenitori e riduce la potenziale sollecitazione sui planari. Tuttavia, i planariani possono essere danneggiati dalle setole se le fibre vengono diffuse o splayed fuori quando contattano l'animale.
Poiché l'analisi pLmV si basa su dati comportamentali, è essenziale utilizzare un set di dati sufficientemente grande per garantire dati affidabili nonostante la variabilità innata della risposta da worm a worm. Di conseguenza, la maggior parte dei laboratori utilizza un minimo di nove-dodici planari per testare ogni concentrazione del prodotto esaminato, in particolare perché i prodotti naturali potrebbero non avere un effetto marcato come i prodotti farmaceutici standard1,2,3,4,5,6,7,13,14,15,16,35,36. Il numero di linee della griglia attraversate ogni minuto viene calcolato in relazione ai dati di controllo dell'acqua di sorgente per ogni giorno e ora di prova. Questi dati vengono mediati per ogni concentrazione di test per ogni minuto e confrontati con i dati di controllo, nonché per altre concentrazioni di tempo corrispondenti utilizzando sia i test T di Student che ANOVA.
Il test pLmV è orientato agli studi di reagenti che influenzano la motilità dei planari per la durata del tempo di saggio. Studi dettagliati sui movimenti planariari possono essere condotti utilizzando una serie di altre valutazioni descritte nella letteratura4,35,36,37,38. Pertanto, è prudente condurre una serie di esperimenti di assunamento per prendere atto di come i planariani reagiscono al reagente di prova utilizzando una serie di concentrazioni e confrontando eventuali effetti con il comportamento dei vermi nell'acqua di sorgente prima di intraprendere test comportamentali. In questo modo, il test comportamentale appropriato può essere selezionato per studiare i singoli manierismi indotti dal reagente sul planaria. I planari possono essere collocati in varie concentrazioni del reagente per 5-10 min per determinare se una concentrazione permette loro di mantenere il loro tipico comportamento di nuoto. Comportamenti che non consentono la motilità, come quelli risultanti in un C-type, o un comportamento convulso o convulso-like, sono stati al centro di studi utilizzando tipi separati di analisi comportamentali che possono essere applicati a questo metodo4,39,40. Le analisi pLmV possono essere condotte utilizzando una serie di concentrazioni dopo brevi tempi di assuvazione e il numero totale di linee di griglia incrociate a 3 min ha segnato rispetto ai controlli dell'acqua di sorgente prima della stimolazione del corso di tempo e delle analisi di ritiro (Figura 4B)1,2,3,4,5. Gli investigatori sono incoraggiati a campionare altre volte, come 15, 30 e 60 min, per vedere se la dinamica di stimolazione cambia con il tempo di esposizione1. Come è stato riferito, nei vermi di controllo dell'acqua di sorgente mantengono un movimento orizzontale costante e diretto in avanti per il tempo di analisi di 10 minuti1,4. Al contrario, i vermi trattati con prodotto possono fermare e cessare la loro motilità direzionale durante il saggio e non attraversare più le linee della griglia. Lo sperimentatore può giudicare se limitare la durata della corsa pLmV sperimentale o derivare un mezzo per valutare questi comportamenti come descritto. È importante, tuttavia, valutare la frequenza di questi comportamenti, in quanto forniscono dati aggiuntivi che influenzano la motilità. I dati sulla motilità e sul movimento sono discussi separatamente sul campo perché la combinazione delle informazioni confonde la valutazione di tali dati4,35,36,37,38. A titolo di esempio, sono stati osservati due comportamenti quando i vermi si sono fermati e non hanno più attraversato le linee della griglia durante il saggio. Questi movimenti sono indicati come "vagabondaggio" (Figura 5A E Figura 5A Supplemento) e 'stop' (Figura 5B E Figura 5B Supplemento). La frequenza di questi comportamenti è documentata come percentuali di tutti gli animali esposti alla concentrazione del prodotto particolare insieme ai dati di controllo (Figura 5C). È importante sottolineare che i comportamenti casuali che non impediscono al planariano di attraversare le linee della griglia dovrebbero essere inclusi nell'analisi pLmV, anche se questi movimenti ostacolano il costante progresso degli animali (Figura 4B, barre da 3 mM e 10 mM). Come accennato, gli investigatori hanno descritto una serie di categorie comportamentali che esulano dall'ambito di questa discussione del tasso pLmV del protocollo di motilità4,35,36,37,38.
Il saggio pLmV si basa sulla solubilità dell'acqua del prodotto in esame. Molte di queste sostanze, tuttavia, non sono completamente solubili in acqua e, come tale, solo le porzioni solubili in acqua possono essere testate da questo saggio, mentre il resto deve essere filtrato dalla soluzione come è stato fatto nel lavoroprecedente 1. Se i test pLmV vengono eseguiti utilizzando reagenti solubilizzati utilizzando solventi diversi dall'acqua, questi richiedono un controllo equivalente di volume oltre al controllo dell'acqua di sorgente. Anche se questo metodo non è stato utilizzato con tali sostanze, tali controlli vettoriali dovrebbero probabilmente essere trattati come un test, e la motilità ha segnato rispetto ai controlli come qualsiasi altra sostanza di prova. Un altro possibile mezzo per testare sostanze non solubili sarebbe quello di dar loro da mangiare ai planarini mescolandoli in gel alimentari. Questa tecnica viene utilizzata per introdurre il siRNA ai planarine negli esperimenti gene knock-down/RNAi41. L'alimentazione di prodotti biologici e siRNA, tuttavia, presenta complicazioni a questo saggio in quanto i planariani non sarebbero affamati e non possono essere trasferiti al contenitore di analisi della motilità entro un tempo standardizzato che garantisce la stessa esposizione o l'assunzione del prodotto in esame da parte degli animali sperimentali prima del test.
Una volta che le dinamiche stimolanti e di ritiro sono stabilite utilizzando il saggio pLmV, ulteriori sperimentazioni possono coinvolgere comodulatori, l'introduzione di siRNA, così come modificatori di percorso biologico o farmaci per testare l'aumento o l'inibizione degli effetti di motilità osservati rispetto ai risultati iniziali raccolti quando non si utilizzano questi biomodulatori1,3. Ad esempio, la downregula dell'espressione di un gene o l'aggiunta di inibitori delle vie potrebbe diminuire il tasso di movimento, mentre altri potrebbero cambiare la dinamica del ritiro. Attraverso l'osservazione dei risultati pLmV modificati, questi ulteriori esperimenti possono fornire informazioni sulla fisiologia sottostante interessata da un prodotto naturale o da un altro reagente di prova5,42,43,44.
La procedura descritta è su misura per qualsiasi laboratorio interessato a determinare gli effetti stimolanti e di ritiro di una varietà di biomodulatori, compresi molti prodotti naturali. I vantaggi dell'applicazione del saggio planaria pLmV includono quanto siano economici e facili da mantenere questi animali, e che possano anche essere soggetti ad altri saggi a base planaria per fornire un'ampia comprensione degli effetti fisiologici del prodotto in esame.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere l'ufficio di promozione istituzionale, e la Morrisville College Foundation per una sovvenzione di pubblicazione a sostegno di questo lavoro, così come il SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) per la loro assistenza continua e il sostegno della ricerca universitaria a SUNY Morrisville. Desideriamo anche ringraziare Sophia Hutchens per i commenti utili sulla tecnica descritta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottled Water - 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish - 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish - 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container - 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
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