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Biochemistry

Un ensayo de motilidad planarian para medir las propiedades biomodulantes de los productos naturales

Published: May 30, 2020 doi: 10.3791/61070
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State University of New York (SUNY) at Morrisville

Summary

La motilidad planaria se utiliza para medir las propiedades estimulantes y de abstinencia de los productos naturales en comparación con el movimiento de los animales solo en el agua de manantial.

Abstract

Se describe un medio sencillo y controlable de utilizar el planario no parásito, Dugesia tigrina, un gusano plano acuático de vida libre, para estudiar las propiedades estimulantes y de abstinencia de los productos naturales. Los ensayos experimentales que se benefician de aspectos únicos de la fisiología planaria se han aplicado a estudios sobre cicatrización de heridas, regeneración y tumorigenesis. Además, debido a que los planarios exhiben sensibilidad a una variedad de estímulos ambientales y son capaces de aprender y desarrollar respuestas condicionadas, se pueden utilizar en estudios conductuales que examinan el aprendizaje y la memoria. Los planarios poseen una simetría bilateral básica y un sistema nervioso central que utiliza sistemas de neurotransmisores susceptibles de estudios que examinan los efectos de los biomoduladores neuromusculares. En consecuencia, se han desarrollado sistemas experimentales de seguimiento del movimiento plano y la motilidad para examinar la adicción y la abstinencia de sustancias. Debido a que la motilidad planaria ofrece la posibilidad de un sistema de ensayo de motilidad sensible y fácilmente estandarizado para monitorear el efecto de los estímulos, la prueba de velocidad locomotora planaria (pLmV) fue adaptada para monitorear los comportamientos de estimulación y abstinencia por parte de planarios a través de la determinación del número de líneas de rejilla cruzadas por los animales con el tiempo. Aquí, la técnica y su aplicación se demuestran y explican.

Introduction

El protocolo descrito utiliza la motilidad planaria para proporcionar un medio de evaluar los efectos biomoduladores de las sustancias naturales. Se adaptó específicamente para determinar si estas sustancias funcionan como estimulantes, y si entonces se asociaron con un comportamiento de abstinencia mensurable1. Este ensayo, conocido como la prueba de velocidad del locomotor planorio (pLmV), se utilizó por primera vez para probar agentes farmacológicos conocidos2,3. La aplicación de este ensayo plano a base de motilidad ha crecido desde entonces en popularidad y ha sido adoptado por diferentes laboratorios interesados en sustancias distintas de los productos naturales4,,5. Para este ensayo, un planorio se coloca en un plato de Petri que contiene agua de manantial o agua de manantial que contiene un biomodulador disuelto. Debido a que el plato en sí se coloca en papel gráfico, el número de líneas de rejilla cruzadas por el animal con el tiempo a medida que se mueve alrededor del recipiente se puede utilizar para determinar la velocidad de movimiento en cada condición. La prueba de luz/oscuridad, también conocida como la prueba de preferencia de lugar condicionada (CPP), es otra variación en el tema de la supervisión de la motilidad planaria, y evalúa la rapidez con la que los animales responden y migran a un entorno oscuro6,,7. El seguimiento de vídeo de los movimientos planos también se puede analizar utilizando programas informáticos y seguimiento del centro de masa (COM)8,9,10,11.

El uso del planoario como modelo animal para tales estudios ofrece varias ventajas sobre otros animales en que el experimentador puede controlar fácilmente el entorno del ensayo. Específicamente, el hambre de los planarios antes de la experimentación puede impedir su exposición a otros agentes nutricionales o farmacológicos que de otro modo podrían confundir los resultados, y el biomodulador específico bajo investigación se puede introducir a los planarios simplemente agregándolo directamente al agua de cultivo, estandarizando así la exposición. Dado que los planarios tienen un sistema nervioso y neurotransmisores que recuerdan a los animales de orden superior, la fisiología y las respuestas experimentales de estos animales a los estímulos neuromusculares se consideran biológicamente relevantes para otros organismos12,,13,,14,,15,,16. Además, debido a que los planarios son relativamente baratos y sencillos de mantener en el laboratorio, ofrecen un modelo biológico accesible para muchos investigadores.

Como animal experimental, los planarios son adecuados para una amplia gama de estudios. Por ejemplo, nuestro grupo, así como otros investigadores utilizan planarios para estudiar la tumorigenesis17,18,19. Los planarios también exhiben una serie de comportamientos de respuesta a estímulos químicos, térmicos, gravitacionales, eléctricos, fotográficos y magnéticos que han formado la base de otros sistemas de ensayo. Algunos de estos efectos se han utilizado para estudiar el aprendizaje y la memoria en estos animales20,,21,22,23,24,25,26,27. El uso principal del modelo planario en la literatura en la actualidad se centra en la actividad de las células madre pluripotentes planarias, llamadas neoblastos, y su papel en la regeneración28,,29,,30. Por lo tanto, la adopción del modelo descrito aquí permite un estudio más profundo utilizando otros ensayos basados en planarios para proporcionar una comprensión más amplia de cómo los productos naturales y otros biomoduladores afectan al organismo.

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Protocol

1. La cría plana

  1. Utilice planarios comprados a una empresa de suministro biológico o capturados salvajemente si es necesario. Los planarios utilizados en este protocolo son Dugesia tigrina,como se indica en la lista de suministros. Esta especie también se conoce como Girardia tigrina31. Otras especies planarias acuáticas también son aceptables2,3.
    NOTA: El protocolo descrito está orientado a animales comprados a una empresa de suministro biológico. Este sistema de ensayo no ha sido probado con planarios capturados salvajemente. Sin embargo, si se utilizan planarios capturados silvestres, se recomienda que se habituen al agua utilizada en los experimentos, así como al entorno de laboratorio durante al menos 1 semana antes de su uso.
  2. A su llegada, transfiera planarios a recipientes de almacenamiento de alimentos de plástico que contengan agua limpia de manantial y mantenga las tapas entreabiertas.
  3. Mantener planarios en un entorno oscurecido.
  4. Alimentar a los planarios recién entregados después de 24–36 h en su nuevo entorno.
  5. Permita que los planarios se aclimaten al laboratorio al menos 1 semana antes de la experimentación.
  6. Alimente a los planarios en un horario regular dos veces por semana.
    1. Permita que los planarios alimenten ad libitum en huevos cocidos orgánicos picados o en hígado de carne de res orgánico mezclado durante 1–2 h.
    2. Colocar planarios alimentados en un recipiente limpio después de la alimentación.
      1. Retire el agua sucia de los planarios.
      2. Utilice un pequeño pincel de acuarela plana (número 3–6) para transferir los restos de comida y la baba adheriéndose al recipiente de alrededor de los planarios a una toalla de papel.
      3. Con agua dulce de manantial y suave remolino o agitación, desalojar los planarios y verterlos en un recipiente limpio.
      4. Cualquier planarios que quede adherido al recipiente se puede transferir utilizando un pincel de acuarela redonda (número 3–6) o pipeta de transferencia con un agujero ancho.
      5. Decantar el agua de transferencia.
      6. Cubra a los planarios con agua de manantial limpia.
      7. Después de 24 h, retire los planarios de cualquier desperdicio de alimentos expulsados transfiriéndolos a un recipiente limpio como se describió anteriormente (pasos 1.6.2.1–1.6.2.6).
  7. Para limpiar los recipientes y utensilios utilizados para la cría planaria, no utilice jabón ni detergente. Limpie estos artículos enjuagando bien con agua limpia (el agua del grifo es aceptable) y secándolos con un paño limpio o una toalla de papel.

2. Preparación de planarios para experimentos

  1. Permita que los planarios recién entregados se aclimaten a su entorno al menos 1 semana antes de la experimentación.
  2. Se mueren de hambre durante 5-10 días antes de la experimentación.
  3. Cambiar el agua de cultivo al menos 1x durante el período de inanición.

3. Prueba de velocidad del locomotor plano (pLmV): Comportamientos estimulantes

  1. Antes de la experimentación, asegúrese de que los planarios hambrientos estén completamente formados, con una cabeza y cola completas y pigmentadas.
  2. Preparar un vaso o plástico de 10 cm de petri y un recipiente de habituación para la prueba de pLmV antes de iniciar el experimento.
    1. Coloque un plato Petri limpio de 10 cm de diámetro que se utilizará para la prueba de pLmV en papel de rejilla prelaminado (con cuadrados de 0,5 cm).
    2. Añadir 20 ml de agua de manantial sin adulterar para controles, o agua de manantial que contenga la concentración adecuada del producto natural que se está probando, a la placa Petri de 10 cm de diámetro que se utilizará para la prueba de pLmV.
    3. Coloque una cámara (por ejemplo, teléfono celular o cámara de alta resolución) por encima de la placa Petri preparada de 10 cm de diámetro para registrar la motilidad planaria sobre el papel de rejilla durante el experimento. Un soporte de anillo es una manera conveniente de colocar la cámara a una distancia que puede grabar toda la vista de la placa Petri de 10 cm y las líneas de rejilla.
    4. Preparar un recipiente de habituación con 5-10 ml de agua de manantial no adulterada (controles), o agua de manantial que contenga la concentración adecuada del producto natural que se está probando. Un recipiente similar a un vial de centelleo o una pequeña placa De Petri de 5 cm es adecuado.
  3. Utilice un pincel de acuarela pequeño, limpio, plano o redondo para transferir suavemente un planorio del recipiente con agua de manantial al recipiente de habituación con 5-10 ml de agua de manantial no adulterada o agua de manantial que contenga el producto natural que se está probando.
    NOTA: Al manipular planarios para el ensayo pLmV, utilice un pincel de acuarela pequeño, limpio, plano o redondo (número 3–6). Al mover planarios, el cepillo debe colocarse debajo del animal para levantarlo suavemente. Para garantizar que los planarios no se dañen al usar el cepillo, las cerdas del cepillo no deben ser desechadas debajo del animal. La esparcimiento de las cerdas podría dañar el plano si se atrapa entre las fibras del cepillo.
    NOTA: También se puede utilizar una pipeta de transferencia de diámetro ancho para transferir el planario a un recipiente de habituación limpio y seco.
    1. Si utiliza la pipeta, retire el exceso de agua movida con el planario del contenedor de habituación utilizando la pipeta de transferencia.
    2. Añadir cuidadosamente la solución de habituación (es decir, agua de manantial para controles o agua de manantial que contenga la concentración de producto natural que se está probando) al recipiente de habituación que contiene el planario.
  4. Los períodos de habituación dependerán de la dinámica de estimulación evaluada para el producto natural que se está probando. Un tiempo de habituación de 2 min resultó aceptable para detectar la estimulación en este trabajo1.
  5. Después del período de habituación de 2 minutos, utilice un pincel de acuarela para transferir suavemente el planoario al centro de la placa Petri de 10 cm preparada para el experimento de estimulación pLmV.
  6. Inicie la cámara para grabar el movimiento del plano. Graba entre 10 y 11 minutos de vídeo.
  7. Preparar el recipiente de habituación y el plato Petri de 10 cm para el experimento pLmV con soluciones frescas para cada planario.
  8. Utilice pipetas, platos, recipientes y pinceles específicos para cada concentración experimental del producto natural que se está probando para evitar exponer inadvertidamente a los planarios a la solución incorrecta durante la experimentación.
  9. Debido a que los planarios exhiben comportamientos aprendidos, cada planario (control o prueba) solo debe usarse una vez21,,22.

4. Prueba de velocidad del locomotor plano (pLmV): Comportamientos de abstinencia

  1. Antes de la experimentación, asegúrese de que los planarios hambrientos estén completamente formados, con una cabeza y cola completas y pigmentadas.
  2. Preparar un plato de Petri de 10 cm (vidrio o plástico) para el experimento pLmV, un plato de Petri de 5 cm (vidrio o plástico) para enjuagar el planario después de la habituación, y un recipiente de habituación antes de comenzar el experimento.
    1. Coloque un plato Petri limpio de 10 cm de diámetro que se utilizará para el experimento pLmV en papel de rejilla prelaminado con cuadrados de 0,5 cm).
    2. Añadir 20 ml de agua de manantial sin adulterar a la placa Petri de 10 cm de diámetro que se utilizará para el experimento pLmV.
    3. Coloque una cámara por encima de la placa Petri preparada de 10 cm de diámetro como en el paso 3.2.3 para registrar la motilidad planaria sobre el papel de rejilla durante el experimento.
    4. Preparar el recipiente de enjuague planario añadiendo 5 ml de agua de manantial sola al plato Petri de 5 cm.
    5. Preparar un recipiente de habituación con 5-10 ml de agua de manantial sin adulterar (controles) o agua de manantial que contenga el producto natural que se está probando. Un recipiente similar a un vial de centelleo o un pequeño plato de Petri de 5 cm (vidrio o plástico) es adecuado.
  3. Utilice un pincel de acuarela pequeño, limpio, plano o redondo para transferir un planorio del agua de manantial al recipiente de habituación preparado con 5-10 ml de agua de manantial no adulterada (controles) o agua de manantial que contenga el producto natural que se está probando. Mueva suavemente al animal del contenedor de la población al contenedor de habituación. Asegúrese de que el plano no esté dañado por el cepillo.
    NOTA: Al manipular planarios para el ensayo pLmV, utilice un pincel de acuarela pequeño, limpio, plano o redondo (número 3–6). Al mover planarios, el cepillo debe colocarse debajo del animal para levantarlo suavemente. Para garantizar que los planarios no se dañen al usar el cepillo, las cerdas del cepillo no deben ser desechadas debajo del animal. La esparcimiento de las cerdas podría dañar el plano si se atrapa entre las fibras del cepillo.
    NOTA: También se puede utilizar una pipeta de transferencia de diámetro ancho para transferir el planario a un recipiente de habituación limpio y seco.
    1. Si utiliza la pipeta, el exceso de agua movido con el planario debe eliminarse del contenedor de habituación utilizando la pipeta de transferencia.
    2. Añadir cuidadosamente la solución de habituación (es decir, agua de manantial no adulterada para controles o agua de manantial que contenga el producto natural que se está probando) al recipiente de habituación que contiene el planario.
  4. Los períodos de habituación para la retirada dependerán de la dinámica de estimulación evaluada para el producto natural que se está probando; 2-5 min han demostrado ser suficientes.
  5. Después del período de habituación utilice un pincel de acuarela para transferir suavemente el planario al plato Petri preparado de 5 cm que contiene agua de manantial para enjuagar cualquier producto natural del recipiente de habituación. Asegúrese de que el plano no esté dañado por el cepillo.
  6. Transfiera inmediatamente el planoario al centro de la placa Petri de 10 cm preparada que contiene agua de manantial para el experimento de abstinencia de pLmV. Asegúrese de que el plano no esté dañado por el cepillo.
  7. Inicie la cámara para grabar el movimiento del plano. Graba entre 10 y 11 minutos de vídeo.
  8. Preparar el recipiente de habituación, el recipiente de enjuague y el plato Petri de 10 cm para el experimento pLmV con soluciones frescas para cada planario.
  9. Utilice pipetas, platos, recipientes y pinceles específicos para cada concentración experimental del producto natural que se está probando para evitar exponer inadvertidamente a los planarios a la solución incorrecta durante la experimentación.
  10. Dado que los planarios exhiben comportamientos aprendidos, utilice cada planario (control o prueba) solo una vez26,,27.

5. Análisis de datos

  1. Prepare una tabla de recopilación de datos para documentar el comportamiento y la motilidad de los planarios como el número de líneas de cuadrícula cruzadas para cada minuto durante la ejecución de pLmV. La tabla debe permitir que también se documente el número acumulado de líneas por minuto atravesadas por el planario. Incluya líneas para notas y una tabla de definiciones para contar la observación de comportamientos durante el período experimental, como 'wander' y 'stop' (ver Discusión).
  2. Con el vídeo, cuente el número de líneas de cuadrícula completas cruzadas por el planario por minuto durante 10 minutos y registre ese número en la tabla de datos. El comportamiento planario típico consiste en velocidad continua, movimiento horizontal dirigido hacia delante, con giros periódicos y sin paradas.
    1. Comienza a cronomelar el experimento en el punto en que el planario se ha movido del pincel utilizado para transferirlo a la placa Petri de 10 cm. Registre esta hora de inicio.
    2. Para determinar cuándo el animal cruza un cuadrado de cuadrícula completa, concéntrese en la cabeza y anote una línea cuando la cabeza cruce completamente un cuadrado.
    3. Para anotar una cuadrícula completa cuando el gusano se mueve alrededor del borde del plato, visualice una distancia de 0,5 cm refiriéndose a las líneas a medida que se extienden desde los márgenes del plato. Si el plano cruza la esquina de un cuadro, consulte la segunda línea cruzada para anotar una línea de cuadrícula. Una vez más, concéntrese en la cabeza para tomar estas determinaciones.
    4. Detenga el vídeo después de cada minuto para grabar los datos.
    5. Al reiniciar el vídeo para contar el minuto siguiente, si la cabeza del gusano estaba entre las líneas de cuadrícula cuando se detuvo el vídeo, grabe la primera línea cruzada como un cuadro completo.
    6. Puntuar el número de líneas de rejilla cruzadas durante 10 min.
  3. Si el animal deja de moverse durante una prueba de pLmV y ya no cruza las líneas de rejilla durante el tiempo de grabación de 10 minutos, documente el comportamiento del planario en el gráfico de comportamiento (por ejemplo, 'wander' o 'stop'). En su lugar, los animales que cesen su vía de avance durante el ensayo pLmV deben tener en cuenta y los datos se presentan como una frecuencia del número total de animales expuestos a dicha concentración de reactivos. El comportamiento en espiral o convulsivo (conocido como comportamiento C) que impide cualquier movimiento hacia adelante durante el período de habituación indica que la concentración del producto natural no es adecuada para su uso en un ensayo de pLmV porque el ensayo de pLmV está basado en la motilidad. Los comportamientos de tipo C se pueden analizar utilizando un tipo diferente de análisis (consulte Discusión).
  4. Si es posible, pruebe múltiples concentraciones experimentales del producto natural utilizando al menos 9-12 gusanos en diferentes días y diferentes horas del día si determina el efecto global del reactivo en la fisiología planaria. Sin embargo, si los investigadores se esfuerzan por reducir la variabilidad inducida por el ritmo circadiano, los experimentos se pueden llevar a cabo con iluminación constante a una hora determinada del día utilizando gusanos que se cultivan con ciclos de luz/oscuridad cronomeurnos y establecen los tiempos de alimentación. Tener al menos dos experimentadores involucrados en el proyecto para permitir la opción de tener un registro de datos individual, mientras que el segundo individuo cuenta las líneas de cuadrícula 'ciegas' a las condiciones utilizadas para la recopilación de datos. Tener diferentes individuos involucrados en la recopilación de datos, así como cálculos estadísticos y análisis, también reduce el posible sesgo.
  5. Calcule los recuentos de líneas de cuadrícula para cada concentración de producto natural en cada día en relación con los recuentos de control para cada minuto, de modo que se puedan combinar datos de diferentes días, horas y experimentadores. Estos datos se pueden promediar y luego analizar mediante las pruebas T de Student. Los valores P para cada prueba se pueden evaluar por minuto en comparación con el control y entre las concentraciones de reactivos. Las evaluaciones de ANOVA utilizando conjuntos de datos derivados de diferentes concentraciones experimentales proporcionan un método de análisis adicional.

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Representative Results

La configuración del laboratorio y la preparación del espacio de trabajo para ejecutar el ensayo pLmV deben completarse antes de que comience la experimentación. Esto incluye la preparación del recipiente de habituación, el recipiente de enjuague si es necesario (para experimentos de retirada), el plato Petri sobre papel de rejilla laminado y la cámara correctamente colocada(Figura 1). Una vez que se toman todos los videos, es aconsejable utilizar una hoja de datos común para estandarizar la recopilación de datos y la presentación entre los investigadores(Figura 2 y Figura 2 Suplemento).

La configuración de la cámara debe permitir una visión clara del papel planoario y de la cuadrícula para permitir una evaluación precisa del progreso del animal durante la duración del experimento(Figura 3A y Suplemento figura 3A). La recopilación de datos debe incluir el número de líneas de cuadrícula cruzadas, así como el número total acumulado de líneas cruzadas por minuto del experimento (Figura 3B). Durante el análisis de pLmV, los planarios tienen una velocidad continua, dirigido hacia delante, movimiento horizontal, con giros periódicos, y no se detienen. Al comenzar, el primer cuadro de cuadrícula completo cruzado debe anotarse como uno, no la primera línea según se determina en el vídeo de ejemplo. Es importante registrar la hora de inicio del movimiento direccional después de que el planorio esté libre del pincel utilizado para transferirlo al plato pLmV, y luego seguir a través de cada minuto a partir de entonces. Si un planario es parte del camino a través de un cuadro en el momento de minutos, la siguiente línea de cuadrícula cruzada después de reiniciar el vídeo debe contarse como un cuadro completo.  Cuando el animal se mueve alrededor del borde del plato, refiérase a las líneas a medida que se extienden desde el plato para determinar una distancia de 0,5 cm. Cuando los gusanos encuentren la esquina de un cuadro, consulte la segunda línea cruzada para anotar una línea de cuadrícula. Concéntrese siempre en la cabeza para tomar estas determinaciones. Si el planario comienza a cubrir un área estrecha, el experimentador debe seguir de nuevo la cabeza del gusano para monitorear la distancia de un cuadro de rejilla completo. Un ejemplo de este comportamiento se incluye en el vídeo complementario(suplemento de la figura 3A).

Para estandarizar los resultados de cada ensayo, las ejecuciones de pLmV deben calcularse y trazarse como el número de cajas cruzadas en relación con el progreso del gusano de control coincidente (Figura 3B). Cada usuario debe estar capacitado para realizar el ensayo y contar las líneas de cuadrícula antes de comenzar las pruebas utilizando reactivos de interés. Como punto de referencia, utilizando la configuración experimental, los planarios en agua de manantial suelen cubrir aproximadamente 24 cajas en 3 minutos (Figura 4A; datos de 4 usuarios, promedio de 24,8 ± 4,8). Se debe examinar una serie de concentraciones de reactivos de ensayo para determinar el tipo de análisis conductual que se utilizará para cada uno. Para el análisis de pLmV, los investigadores deben determinar si los animales muestran motilidad cuando se exponen(Figura 4B). Otros tipos de análisis de comportamiento pueden ser más eficaces para diferentes tipos de comportamientos (ver discusión). En relación con el control del agua de manantial, los datos estimulantes mostrarán un número cada vez mayor de líneas de rejilla cruzadas a medida que el animal se mueve a través del recipiente pLmV con la concentración deseada del reactivo de ensayo en agua de manantial, después de ser habituado en la misma concentración del reactivo de prueba. Por el contrario, los datos de retirada mostrarán un número decreciente de líneas de rejilla cruzadas, en relación con el control del agua de manantial, cuando el plano se mueve a través del contenedor pLmV teniendo agua de manantial sola, después de ser habituado en la concentración deseada del reactivo mezclado en agua de manantial (Figura 4C y 4D). En particular, los datos de retirada de energías excesivas pueden conducir a recuentos de la red menos que los de los controles, como se ha observado en los datos de retirada inducida por fármacos por otros grupos2,,6.

Los planarios de control de agua de manantial se moverán sobre las líneas de rejilla durante el experimento. Sin embargo, es posible que los planarios de prueba dejen de cruzar las líneas de rejilla durante el ensayo. Si esto ocurre, estos datos deben resaltarse por separado de los datos de los gusanos que mantienen su progreso sobre las líneas de cuadrícula. Documentar estos datos como un porcentaje del número total de animales expuestos a esa concentración de reactivos en particular es una manera eficaz de ilustrar la frecuencia relativa de estos hallazgos(Figura 5A-C, Suplemento figura 5A y Suplemento figura 5B). Los comportamientos que no impidan a los planarios cruzar las líneas de rejilla deben incluirse en el análisis de pLmV, incluso si estos movimientos impiden el progreso constante de los animales.

Figure 1
Figura 1: Configuración representativa para el ensayo pLmV.
El espacio de laboratorio debe prepararse antes de comenzar el ensayo. Se muestra una configuración típica con un plato Petri de 10 cm colocado sobre papel de rejilla laminado de 0,5 cm. Una cámara de documentos se coloca de tal manera que se puede grabar una vista clara de la placa Petri de 10 cm en un ordenador vinculado. Sin embargo, cualquier cámara se puede utilizar para grabar el progreso de los planarios durante el experimento, incluyendo una cámara de teléfono celular colocada sobre el plato Petri usando un soporte de anillo. En el fondo hay un plato petri de 5 cm para enjuagar gusanos para experimentos de abstinencia, así como pequeños recipientes blancos utilizados para habituar los planarios. Además, en el fondo están etiquetados, pinceles de acuarela redondas dedicadas, pipetas y platos Petri para cada concentración de producto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Hoja de datos pLmV.
Una hoja de datos preparada para registrar el número de líneas de cuadrícula cruzadas, la correspondiente en relación con los datos de control, así como un medio para contar cualquier comportamiento es útil para fines de recopilación de datos. Consulte la figura 2 Suplemento para obtener una versión descargable en PDF de esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Experimento representativo de pLmV y hoja de datos.
(A) Una cámara debe colocarse por encima de la placa Petri de 10 cm utilizada para el ensayo pLmV de modo que el plano y la rejilla completa de 0,5 cm debajo del plato sean claramente visibles. Se debe registrar la ejecución completa de pLmV (Figura 3A Suplemento) y (B) el número de líneas de cuadrícula cruzadas cada minuto colocado en una tabla de datos preparada. Las líneas de rejilla totales acumuladas cruzadas deben ser contadas, y luego éstas deben convertirse en el número de líneas acumuladas cruzadas en relación con el gusano de control de agua de manantial correspondiente. Los datos de la tabla de figuras proporcionada (B) coinciden con los recuentos utilizando el vídeo complementario (Figura 3A Suplemento). No se muestran los recuentos de controles correspondientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Gráficos representativos de datos estimulantes y de abstinencia.
Los investigadores deben ser entrenados para usar y puntuar las líneas de rejilla del ensayo pLmV usando agua de manantial sola antes de la experimentación. Normalmente, los planarios recorren unas 25 líneas de rejilla en 3 min. (A) Se muestran datos de cuatro usuarios, cada uno con 10 gusanos de control de agua de manantial.  Para apreciar el efecto de un reactivo sobre la motilidad planaria, se examinan una serie de concentraciones utilizando el ensayo pLmV y el número total de líneas de rejilla cruzadas se examinan en relación con los recuentos de control correspondientes a 3 minutos. (B) Los datos de control se representan mediante la barra blanca. Los datos de prueba están representados por las barras negras, con las concentraciones utilizadas en mM. En relación con los datos de control se debe trazar para representar mejor los datos recopilados. (C) Los datos estimulantes representados por la línea azul/diamantes, mostrarán un aumento en las líneas de rejilla cruzadas, frente a los datos de retirada (D), también representados por la línea azul / diamantes, mostrarán una pendiente decreciente desde un valor inicial de inicio, en relación con los datos de control, como se muestra por la línea roja / cuadrados en ambos (C y D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Observación y documentación de datos de comportamiento.
Los planarios en el ensayo pLmV que no mantienen el movimiento direccional durante el experimento, pero se deben detener con los comportamientos característicos y ya no se mueven sobre las cuadrículas. Los comportamientos típicos pueden incluir pantallas como 'wander' (SuplementoA y Figura 5A),y 'stop' (SuplementoB y Figura 5B). Estos códes de datos de comportamiento deben presentarse para documentar la frecuencia de estos comportamientos en comparación con todos los animales expuestos a esa concentración de producto (C). Se muestran datos de muestra que documentan los porcentajes de animales de control de agua de manantial (Ci) y animales expuestos a un estimulante (Cii), que tienen un comportamiento errante (azul), parada (rojo) o no (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se describe un ensayo de motilidad planaria sencillo y accesible para determinar los efectos estimulantes y de abstinencia de los productos naturales. Como modelo de comportamiento es necesario tener protocolos estrictos para el movimiento de puntuación y definiciones claras de cualquier comportamiento para estandarizar las observaciones entre diferentes experimentadores. Las ideas presentadas ofrecen una demostración de cómo se puede lograr esto. Cada laboratorio que utilice este protocolo debe adaptar la información presentada para adaptarse a los efectos del producto en particular que se está probando. Se recomienda configurar cuidadosamente el espacio de trabajo para garantizar que cada investigador que participe en el estudio pueda realizar pruebas en condiciones coherentes (Figura 1). Las hojas de registro estandarizadas se pueden compilar para ayudar con el mantenimiento preciso de registros y la recopilación de datos sobre motilidad y comportamientos(Figura 2 y Figura 3B).

Las pruebas de motilidad deben realizarse en varias horas del día, utilizando diferentes lotes de planarios si es posible, para tener en cuenta las actividades circadianas inherentes divergentes. Si bien estos análisis no se han llevado a cabo, se sugiere que los investigadores supervisen cómo el ritmo circadiano plano podría afectar a la motilidad manteniendo planarios utilizando un ciclo de luz/oscuridad estándar (por ejemplo, 12/12), y al realizar el ensayo pLmV, utilizar las condiciones de iluminación estándar y realizar las pruebas a la misma hora del día32,,33,,34. Los investigadores deben practicar la mecánica del ensayo pLmV y aprender a contar las líneas de rejilla para estandarizar tanto el manejo de los planarios como la evaluación de la motilidad planaria (Figura 3). Esto debe hacerse utilizando controles de agua de manantial sin adulterar. Por lo general, después de 10–20 de estas prácticas, los datos se vuelven bastante estándar para todos los miembros del laboratorio. Se deben elegir recuentos después de un tiempo pLmV establecido para comparar el progreso en el aprendizaje del ensayo. Los investigadores suelen observar aproximadamente 24 líneas de rejilla atravesadas por 3 min en el ensayo de pLmV en agua de manantial después de una habituación de 2 minutos en agua de manantial (Figura 4A; datos representativos para cuatro investigadores con 10 controles de agua de manantial aleatorios cada uno; 24,8 ± 4,8 líneas de rejilla). Tener dos o tres investigadores capacitados realizando cada conjunto de pruebas puede mejorar aún más la fiabilidad de los resultados porque cualquier efecto específico del usuario en el método y los recuentos se puede tener en cuenta en el análisis de errores. De esta manera, las pruebas y los recuentos se pueden intercambiar entre los investigadores para que los recuentos se puedan hacer 'ciegos' a las condiciones experimentales. Para disminuir la probabilidad de sesgo, diferentes individuos podrían realizar pruebas estadísticas en los datos del conteo y realizar los análisis posteriores. Fuera de la presencia del producto que se está probando, se deben evitar las variaciones ambientales en la calidad del agua, como la temperatura y el pH. Dado que los planarios son sensibles a la luz, la configuración del experimento debe asegurarse de que la iluminación del espacio de trabajo sea uniforme. Por último, dado que los planarios pueden exhibir comportamientos aprendidos, cada gusano, incluidos los controles, solo debe usarse una vez26,,27.

Es útil tener una lista de comprobación experimental en el laboratorio si varios experimentadores están trabajando con el ensayo, particularmente en un laboratorio de investigación de pregrado, para evitar los escollos comunes que podrían ocurrir al ejecutar la prueba de pLmV, lo que afectaría el valor estadístico de los resultados. Todas las soluciones deben estar a temperatura ambiente porque la motilidad planaria se reduce a temperaturas más bajas. Se debe tener cuidado de asegurar que los especímenes estén hambrientos 5-10 días antes de su uso y que cada espécimen esté completamente formado, con una cabeza y cola completamente pigmentadas. También se sugiere que los pinceles de acuarela planas o redondas (número 3-6), los recipientes de habituación y los platos Petri se utilicen para cada concentración experimental para hacer el flujo de trabajo más suave para el experimentador. La técnica de transferencia de los planosianos utilizando pequeños pinceles de acuarela plana o redonda debe ser practicada ampliamente por los investigadores para asegurar la transferencia eficiente de los gusanos entre contenedores sin causar lesiones o angustia a los animales (véase la discusión anterior; Figura 4A). El uso de estos pinceles minimiza la transferencia de líquidos entre los recipientes y reduce la tensión potencial en los planarios. Sin embargo, los planarios pueden ser dañados por las cerdas si las fibras se propagan o se lanzan cuando se ponen en contacto con el animal.

Dado que el ensayo pLmV se basa en datos de comportamiento, es esencial utilizar un conjunto de datos suficientemente grande para garantizar datos sólidos a pesar de la variabilidad innata de la respuesta de gusano a gusano. Como tal, la mayoría de los laboratorios utilizan un mínimo de nueve a doce planarios para probar cada concentración del producto que se está examinando, especialmente porque los productos naturales pueden no tener un efecto tan marcado como los productos farmacéuticos estándar1,,2,3,4,5,6,7,13,14,15,16,35,36. El número de líneas de rejilla cruzadas cada minuto se calcula en relación con los datos de control de agua de manantial para cada día y hora de prueba. Estos datos se promedian para cada concentración de prueba para cada minuto y se comparan con los datos de control, así como con otras concentraciones coincidentes con el tiempo utilizando las pruebas T de Student y ANOVA.

El ensayo pLmV está orientado a estudios de reactivos que afectan a la motilidad de los planarios durante el tiempo de ensayo. Los estudios detallados de los movimientos planosales se pueden llevar a cabo utilizando una serie de otras evaluaciones descritas en la literatura4,35,36,37,38. Por lo tanto, es prudente llevar a cabo una serie de experimentos de habituación para tomar nota de cómo reaccionan los planarios al reactivo de prueba utilizando una serie de concentraciones y comparando cualquier efecto con el comportamiento de los gusanos en el agua de manantial antes de embarcarse en pruebas de comportamiento. De esta manera, se puede seleccionar la prueba conductual adecuada para estudiar los manierismos individuales inducidos por el reactivo en el planario. Los planarios se pueden colocar en varias concentraciones del reactivo durante 5-10 min para determinar si una concentración les permite mantener su comportamiento típico de natación. Los comportamientos que no permiten la motilidad, como los que dan lugar a un tipo C, o un comportamiento convulsivo o convulsivo, han sido el foco de estudios utilizando tipos separados de análisis conductuales que se pueden aplicar a este método4,39,40. Los análisis de pLmV se pueden realizar utilizando una serie de concentraciones después de tiempos de habituación cortos y el número total de líneas de rejilla cruzadas a 3 min puntuadas en relación con los controles de agua de manantial antes de los análisis de estimulación y retirada del curso de tiempo (Figura 4B)1,2,3,4,5. Se alienta a los investigadores a tomar muestras de otras veces, como 15, 30 y 60 min, para ver si la dinámica de estimulación cambia con el tiempo de exposición1. Como se ha informado, en los gusanos de control de agua de manantial mantienen un movimiento horizontal constante y dirigido hacia adelante durante el tiempo de ensayo de 10 min1,4. Por el contrario, los gusanos tratados con productos pueden detenerse y cesar su motilidad direccional durante el ensayo y ya no cruzar las líneas de rejilla. El investigador puede hacer un juicio si limitar la duración de la carrera experimental de pLmV o derivar un medio para evaluar estos comportamientos como se describe. Sin embargo, es importante evaluar la frecuencia de estos comportamientos, ya que proporcionan datos adicionales que afectan a la motilidad. La motilidad y los datos de movimiento se discuten por separado en el campo porque la combinación de la información confunde la evaluación de dichos datos4,35,36,37,38. A modo de ejemplo, se observaron dos comportamientos cuando los gusanos se detuvieron y ya no cruzaron las líneas de cuadrícula durante el ensayo. Estos movimientos se conocen como «wander» (Figura 5A Y Figura 5A Suplemento), y 'stop' (Figura 5B Y Figura 5B Suplemento). La frecuencia de estos comportamientos se documenta como porcentajes de todos los animales expuestos a la concentración de producto particular junto con los datos de control (Figura 5C). Es importante destacar que los comportamientos aleatorios que no impiden que el planario cruce las líneas de rejilla deben incluirse en el análisis de pLmV, incluso si estos movimientos impiden el progreso constante de los animales (Figura 4B, barras de 3 mM y 10 mM). Como se mencionó, los investigadores han descrito una serie de categorías de comportamiento que están fuera del alcance de esta discusión de la tasa de pLmV del protocolo de motilidad4,35,36,37,38.

El ensayo pLmV se basa en la solubilidad en agua del producto objeto de investigación. Sin embargo, muchas de estas sustancias no son totalmente solubles en agua y, como tales, sólo las porciones solubles en agua pueden ser probadas mediante este ensayo, mientras que el resto debe filtrarse de la solución como se ha hecho en trabajos anteriores1. Si los ensayos de pLmV se ejecutan utilizando reactivos solubilizados utilizando disolventes distintos del agua, estos requieren un control equivalente al volumen además del control del agua de manantial. Si bien este método no se ha utilizado con tales sustancias, es probable que dichos controles vectoriales se traten como una prueba, y la motilidad se puntúe en relación con los controles como lo haría cualquier otra sustancia de ensayo. Otro posible medio para probar sustancias no solubles sería alimentarlas a los planarios mezclándolas en geles alimentarios. Esta técnica se utiliza para introducir siRNA a los planarios en los experimentos de derribo genético/RNAi41. La alimentación de productos biológicos y siRNA, sin embargo, presenta complicaciones a este ensayo en el sentido de que los planarios no estarían hambrientos y no se pueden transferir al recipiente del ensayo de motilidad dentro de un tiempo estandarizado que garantice la misma exposición o ingesta del producto objeto de investigación por los animales experimentales antes de las pruebas.

Una vez que se establecen dinámicas de estimulantes y abstinencia utilizando el ensayo pLmV, la experimentación posterior puede implicar comodadores, la introducción de siRNA, así como modificadores de vías biológicas o fármacos para probar el aumento o inhibición de los efectos de la motilidad observados en comparación con los resultados iniciales recogidos cuando no se utilizan estos biomoduladores1,3. Por ejemplo, la regulación de la expresión de un gen o la adición de inhibidores de la vía podría disminuir la tasa de movimiento, mientras que otros pueden cambiar la dinámica de la abstinencia. A través de la observación de los resultados modificados de pLmV, estos experimentos adicionales pueden proporcionar información sobre la fisiología subyacente afectada por un producto natural u otro reactivo de prueba5,42,43,44.

El procedimiento descrito es susceptible de cualquier laboratorio interesado en determinar los efectos estimulantes y de abstinencia de una variedad de biomoduladores, incluyendo muchos productos naturales. Las ventajas de la aplicación del ensayo de pLmV planario incluyen cuán baratos y fáciles de mantener estos animales son, y que también pueden ser sujetos para otros ensayos de base planaria para proporcionar una amplia comprensión de los efectos fisiológicos del producto bajo investigación.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer a la oficina de Avance Institucional, y a la Morrisville College Foundation por una subvención de publicación para apoyar este trabajo, así como al SunY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) por su asistencia continua y apoyo a la investigación de pregrado en SUNY Morrisville. También queremos agradecer a Sophia Hutchens por sus útiles comentarios sobre la técnica descrita.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottled Water - 1 Gal. Poland Spring N/A Spring water for planarian culture and to prepare solutions
Brown Planaria (Dugesia tigrina) Carolina Biological Supply Company 132954 Brown planaria living (other species are acceptable)
Flat Paintbrush Royal Crafter's Choice 9159 Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers
Glass Petri Dish - 10 cm Kimax N/A 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay
Glass Petri Dish - 5 cm Kimax N/A 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation
Grid Paper Any N/A Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay
iPEVO Visualizer (software) iPEVO https://www.ipevo.com/software/visualizer Document camera software for video capture and recording
Metalware Set with Support Stand and Retort Ring Any N/A Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used
Organic Egg Any N/A Organic egg or beef liver for feeding planarains
Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap - 10 mL Beckman N/A Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation
Round Storage Container - 10 cm Ziploc N/A 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer
Round Water Paint Brush LOEW-Cornell N/A Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) - soft
Transfer Pipette Any N/A Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians
USB Document Camera iPEVO CDVU-06IP Document camera (or other camera or cell phone camera)

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References

  1. Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
  2. Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
  3. Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
  4. Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
  5. Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
  6. Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. 0, 8-13 (2013).
  7. Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
  8. Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
  9. Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
  10. Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
  11. Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
  12. Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
  13. Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
  14. Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
  15. Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
  16. Raffa, R. B., Rawls, S. M. A model for drug action and abuse. , Landes Bioscience. Austin, TX. (2008).
  17. Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
  18. Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
  19. Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
  20. Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
  21. Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
  22. Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
  23. Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
  24. Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
  25. de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
  26. Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
  27. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, Pt 20 3799-3810 (2013).
  28. Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
  29. Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
  30. Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
  31. Animal Diversity. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Dugesia_tigrina/ (2019).
  32. Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
  33. Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
  34. Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
  35. Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
  36. Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
  37. Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
  38. Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
  39. Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
  40. Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
  41. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
  42. Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
  43. Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a 'bath salt' cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
  44. Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).

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Un ensayo de motilidad planarian para medir las propiedades biomodulantes de los productos naturales
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