Summary
Успешная трансформация зародышевой линии у травяной совки, Spodoptera frugiperda,была достигнута с помощью мРНК гиперактивной транспоза piggyBac.
Abstract
Стабильная вставка генетического груза в геномы насекомых с использованием транспонируемых элементов является мощным инструментом для функциональных геномных исследований и разработки стратегий борьбы с генетическими вредителями. Наиболее используемым транспонируемым элементом в трансформации насекомых является piggyBac,а трансформация зародышевой линии на основе piggyBacбыла успешно проведена у модельных насекомых. Тем не менее, по-прежнему сложно использовать эту технологию у немодельных насекомых, которые включают сельскохозяйственных вредителей. В этой статье сообщается о трансформации зародышевой линии глобального сельскохозяйственного вредителя, травяной совки (FAW), Spodoptera frugiperda,с использованием гиперактивной транспоза piggyBac (hyPBase).
В этой работе мРНК hyPBase была получена и использована вместо плазмиды-хелпера в микроинъекциях эмбриона. Это изменение привело к успешному поколению трансгенных FAW. Кроме того, описаны методы скрининга трансгенных животных, быстрого обнаружения трансгенной вставки трансгена на основе ПЦР и определения сайта интеграции на основе термической асимметричной чересстрочной ПЦР (TAIL-PCR). Таким образом, в данной работе представлен протокол получения трансгенного FAW, который облегчит трансгенез на основе piggyBacу FAW и других чешуекрылых насекомых.
Introduction
Травяная совка (FAW), Spodoptera frugiperda,является родной для тропических и субтропических регионов Америки. В настоящее время это разрушительное насекомое травоядное животное в более чем 100 странах мира1. Личинки FAW питаются более чем 350 растениями-хозяевами, включая некоторые важные основные продовольственные культуры2. Сильная миграционная способность взрослых особей FAW способствует его недавнему быстрому распространению из Северной и Южной Америки в другие места1,2. В результате это насекомое в настоящее время угрожает продовольственной безопасности на международном уровне. Применение новых технологий может способствовать проведению углубленных исследований в FAW и обеспечить новые стратегии борьбы с этим вредителем.
Трансформация зародышевой линии насекомых была использована для изучения функции генов и генерации трансгенных насекомых для использования в генетическом контроле3,4. Среди различных методов, используемых для достижения генетической трансформации у насекомых, метод на основе элементов piggyBac является наиболее используемым методом5. Однако из-за низкой скорости транспозиции по-прежнему сложно проводить трансгенез у немодельных насекомых. Недавно была разработана гиперактивная версия транспозазы piggyBac (hyPBase)6,7. Трансформация зародышевой линии была достигнута в FAW недавно8,что является первым отчетом, в котором используется hyPBase у чешуекрылых насекомых. В этом отчете описана подробная информация об использовании мРНК hyPBase для генерации трансгенного FAW. Метод, описанный здесь, может быть применен для достижения трансформации других чешуекрылых насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro синтез мРНК hyPBase
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная кодирующая последовательность последовательности hyPBase была синтезирована и вставлена в вектор pTD1-Cas9 (см. Таблицу материалов)для получения конструкции pTD1-hyPBase, которая содержит экспрессирующую hyPBase кассету, промотор T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). Полная последовательность конструкции pTD1-hyPBase приведена в Дополнительном материале.
- Подготовка шаблона для синтеза in vitro
- Выполните реакцию ПЦР для усиления экспрессирующей hyPBase кассеты с использованием прямого праймера, 5'-atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', и обратного праймера 5'-tagaggccccaaggggttatgctag-3', высокоточной полимеразы и плазмиды pTD1-hyPBase в качестве шаблона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция ПЦР (конечный объем 50 мкл) содержит 5,0 мкл 10x реакционного буфера, 4,0 мкл дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP), 1,0 мкл плазмиды (50 мкг/мкл), 1,0 мкл высокоточной полимеразы, 1,0 мкл каждого из 10 мкМ прямых и обратных праймеров и 33 мкл воды без нуклеазы. Настройки были следующими: начальная инкубация 95 °C в течение 3 мин, затем 35 циклов 98 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 15 с и 68 °C в течение 2 мин. - Проверьте продукт ПЦР на 1% агарозном геле при 120 В в свежем буфере трис-ацетат-этилендиаминовой тетрауксусной кислоты (TAE) в течение 30 мин и очистите продукт с помощью набора для экстракции геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте комплект для очистки продукта ПЦР. Даже следовое количество плазмиды pTD1-hyPBase значительно снижает эффективность синтеза in vitro.
- Выполните реакцию ПЦР для усиления экспрессирующей hyPBase кассеты с использованием прямого праймера, 5'-atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', и обратного праймера 5'-tagaggccccaaggggttatgctag-3', высокоточной полимеразы и плазмиды pTD1-hyPBase в качестве шаблона.
-
Синтез in vitro мРНК hyPBase с использованием коммерческого набора
- Полностью разморозьте замороженные реагенты, держите фермент и 2x раствор NTP/CAP на льду и оставьте размороженный 10x реакционный буфер при комнатной температуре.
- Соберите реакцию при комнатной температуре, добавив следующие компоненты: 2x раствор NTP/CAP: 10 мкл; 10x Реакционный буфер: 2 мкл; ДНК шаблона: 0,1-0,2 мкг; Ферментная смесь: 2 мкл; Вода без нуклеаз до 20 мкл.
- Тщательно перемешайте реагенты, осторожно пипетируя смесь вверх и вниз и инкубируйте при 37 °C в течение 2-4 ч.
- Восстановление синтезированной мРНК путем осаждения хлорида лития
- Добавьте 30 мкл раствора для осаждения LiCl, тщательно перемешайте, щелкнув пробиркой, а затем держите при -20 °C в течение ≥ 30 мин.
- Центрифугу при 4 °C в течение 15 мин на максимальной скорости и аккуратно извлеките надосадочную кислоту.
- Вымойте гранулу один раз с 1 мл 70% этанола, повторно центрифугируйте и осторожно удалите супернатант.
- Высушите гранулу при комнатной температуре в течение 1-2 мин, а затем повторно суспендируйте гранулу 20-40 мкл воды без нуклеазы.
- Разбавить 1 мкл раствора мРНК 9 мкл воды без нуклеазы. Возьмите 2 мкл для определения концентрации мРНК и используйте 8 мкл для проверки качества мРНК на 1% агарозном геле при 100 В в свежем буфере TAE в течение 40 мин.
- Аликвот раствор мРНК и хранят замороженным при -70 °C до одного года.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует полностью сушить гранулы мРНК; может быть сложнее растворить его в воде.
2. Микроинъекция
- Коллекция яиц
- Поместите 12 самцов куколок и 12 самок куколок в коробку размером 15 см х 15 см х 10 см. Накройте коробку бумажным полотенцем. Поместите 10% раствор сахарозы в коробку для кормления взрослых.
- На 2 день после эклозии подвергайте взрослых интенсивному свету в течение ночи.
- На 3 день после эклозии переведите взрослых с шага 2.1.2 в темное место. Соберите эмбрионы в течение 2 ч после яйцекладки.
- Добавьте капли воды на лист бумажного полотенца со свежими яйцами, хранящимися в чашке Петри на льду. Аккуратно переложите яйца на стеклянную горку тонкой кистью и выровняйте их по одному на стеклянной горке. Держите стеклянные горки с выровненными яйцами на льду перед микроинъекцией.
- Установка микроинъекции
- Вводят в яйца смесь трансгенной усиленной зеленой флуоресцентной плазмиды (EGFP)-экспрессирующей плазмиды (200 нг/мкл), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, мРНК hyPBase (200 нг/мкл) и стерильной дистиллированной воды, используя компенсационное давление автоматизированного микроинжектора (см. Таблицу материалов).
- Держите введенные яйца при температуре 27 ± 1 °C, 60 ± 10% относительной влажности до вылупления.
- Кормите вылупившихся личинок на искусственной диете, и переведите каждую личинку в одну маленькую чашку на ранней3-й стадии звезды (~ 6 мм в длину, и цвет тела становится черным).
3. Флуоресцентный скрининг и генетическое скрещивание
- Соберите куколок и поместите ~150 самок куколок и ~150 самцов куколок в клетку размером 35 см х 35 см х 35 см. Повесьте несколько кусочков бумажных полотенец (~30 см х 15 см) в клетку, чтобы собрать яйца.
- Ежедневно собирайте бумажные полотенца с яйцами и держите яйца при температуре 27 ± 1 °C, 60 ± относительной влажности 10% до вылупления.
- Держите новорожденных личинок при 4 °C в течение 5 минут, чтобы обездвижить их, а затем переложите их на ледяную пластину.
- Скрининг обездвиженных личинок новорожденных под флуоресцентным стереомикроскопом. Выберите EGFP-положительных новорожденных, поднимите их до стадии куколки через ~ 2 недели при 27 ± 1 ° C и разделите их по полу в соответствии с различиями фенотипов в вентральных сегментах брюшной полости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Самка куколки имеет щелевидное генитальное отверстие на восьмом брюшном сегменте и головные края девятого и десятого сегментов, изогнутые к генитальному отверстию. Генитальное отверстие самца куколки имеет небольшое возвышение на девятом брюшном сегменте. - Поместите EGFP-положительных куколок и куколок противоположного пола дикого типа в самца: соотношение самок 1:1 в клетку. Сиб-скрещивает EGFP-экспрессирующих взрослых особей, чтобы произвести следующие поколения.
4. ПЦР-обнаружение трансгенной вставки
- Извлеките геномную ДНК из диких и EGFP-положительных отдельных личинок, используя любой коммерческий набор для экстракции геномной ДНК в соответствии с инструкциями производителя.
- Выполнить реакцию ПЦР с использованием геномной ДНК в качестве шаблона; передняя грунтовка, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3', расположенная в области промоутера ie1; и обратный праймер, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3', расположенный в области EGFP вектора преобразования.
- Настройте каждую реакцию ПЦР (конечный объем 40 мкл) на содержание 20 мкл полимеразной смеси, 1,0 мкл геномной ДНК (40 мкг/мкл), 1,0 мкл каждого из 10 мкМ прямых и обратных праймеров и 17 мкл воды без нуклеаз. Используйте следующие настройки: начальная инкубация 95 °C в течение 3 мин, затем 35 циклов 95 °C в течение 20 с, 56 °C в течение 20 с и 68 °C в течение 40 с установок.
- Проверьте продукты ПЦР на 1% агарозном геле при 120 В в течение 30 мин.
5. Определение места трансгенной вставки
- Выполнить высокоэффективную TAIL-PCR с использованием геномной ДНК в качестве шаблона для определения места интеграции трансгенной вставки в EGFP-положительных насекомых.
- Выполняйте реакции ПЦР, следуя шагам, описанным в другом месте9.
- Используйте три праймера, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', и P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3', которые специфичны для вектора piggyBac, в 3 раундах реакции ПЦР соответственно.
- Выполняйте реакции ПЦР, следуя шагам, описанным в другом месте9.
- Последовательность конечных продуктов ПЦР для определения места интеграции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конструкция для экспрессии hyPBase-содержащего промотора T7: многогранника-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: поли(A) сигнал генерировали(рисунок 1A)и усиливали в виде ~2,2 кб ПЦР-фрагмента для синтеза мРНК hyPBase in vitro (рисунок 1B). Затем мРНК hyPBase продуцировали и подвергали электрофорезу агарозного геля. МРНК ожидаемого размера (~1,1 кб диапазона) была обнаружена на 1% агарозном геле(Рисунок 1С).
Затем была подготовлена конструкция выражения EGFP на основе piggyBac(рисунок 2A). Смесь этой плазмиды и мРНК hyPBase, или раствора PBS, вводили эмбрионам в течение 2 ч после яйцекладки. Через 24 ч после инъекции у введенных эмбрионов наблюдался преходящий сигнал экспрессии EGFP. Эмбрионы, введенные PBS, не показали сигнала EGFP(рисунок 2B),тогда как EGFP-экспрессирующие плазмиды и эмбрионы, введенные мРНК hyPBase, показали флуоресценцию EGFP(рисунок 2C),что указывает на то, что конструкция piggyBac была успешной. Таким образом, промотор hr5ie1 может функционировать во время раннего эмбрионального развития.
Было введено около 2000 яиц, и ~ 700 из них превратились в куколок. Взрослые особи G0 скрещивались самостоятельно, и яйца собирались. Личинки G1, вылупившиеся из этих яиц, были исследованы на предмет сигнала EGFP под флуоресцентным стереомикроскопом. Как показано на рисунке 3А,трансгенные личинки показали сильный сигнал EGFP. Для проверки вставки кассеты экспрессии EGFP в геномы EGFP-положительных насекомых фрагмент, содержащий промотор и фрагмент EGFP, амплифицировали с использованием геномной ДНК, выделенной из EGFP-положительных личинок в качестве шаблона(рисунок 3B). Этот фрагмент не был обнаружен, когда геномная ДНК была выделена из личинок дикого типа в качестве шаблона(рисунок 3B). Путем проведения высокоэффективной TAIL-PCR и секвенирования продуктов ПЦР был определен сайт интеграции трансгенной вставки. Как показано на рисунке 4,сайт интеграции трансгенов находится в 81-м интроне близнецоподобного гена в хромосоме 26.
Рисунок 1:Производство мРНК hyPBase. (A) Построена hyPBase-экспрессирующая кассета, содержащая промотор T7: многогранник-5'UTR: hyPBase: многогранник-3'UTR: поли (A) сигнал. (B) Шаблон ДНК ~2,2 кб для синтеза мРНК hyPBase был амплифицирован из конструкции hyPBase. Левая полоса показывает 1-килобайтный лестничный пробег на том же геле. (C) МРНК hyPBase размером ~1,1 кб была синтезирована из амплифицированного шаблона ДНК. Левая полоса показывает 1-килобайтный лестничный пробег на том же геле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Экспрессия EGFP у введенных эмбрионов. (A) Принципиальная диаграмма вектора piggyBac, используемого в этом исследовании. (B)У эмбрионов, которым вводили 1x PBS, не было обнаружено сигнала EGFP. (C)Сигнал EGFP был обнаружен у эмбрионов, которым вводили вектор piggyBac и мРНК hyPBase. Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: EGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок и PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Характеристика трансгенной экспрессии FAW. (A)EGFP у трансгенных, но не у личинок FAW дикого типа. Шкала стержней = 0,5 мм.(B)ПЦР-анализ геномной вставки трансгенов. Пара праймеров, нацеленных на области промотора и EGFP, была использована для амплификации фрагмента ~ 0,5 кб с использованием геномной ДНК, выделенной из трансгенных или диких личинок FAW в качестве шаблона. Сокращения: EGFP = улучшенный зеленый флуоресцентный белок и FAW = травяная совка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Геномная вставка конструкции piggyBac. Геномную вставку конструкции piggyBac в трансгенный FAW определяли методом TAIL-PCR и секвенирования. Показана локализация хромосом и частичные геномные последовательности ДНК, фланкирующие границы конструкции piggyBac. Сокращения: FAW = травяная совка и TAIL-PCR = термо асимметричная чересстрочная ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительные материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Низкая скорость транспозиции и сложность доставки трансгенных компонентов в свежие эмбрионы ограничивают успех трансформации зародышевой линии у многих немодельных насекомых, особенно у чешуекрылых. Для увеличения скорости трансформации зародышевой линии была разработана гиперактивная версия наиболее широко используемой транспозазы piggyBac (hyPBase)7,10. На сегодняшний день об успешной трансформации зародышевой линии у чешуекрылых насекомых в основном сообщается в модели насекомого шелкопряда Bombyx mori11. Тем не менее, проведение работ по трансгенезу у других чешуекрылых насекомых, включая некоторых крупных вредителей сельского хозяйства, по-прежнему является сложной задачей.
Основными ограничениями и ключевыми шагами создания трансгенной линии FAW с использованием этого протокола являются синтез высококачественной мРНК hyPBase и доставка компонентов транспозиции piggyBac в ранние эмбрионы. Двумя основными компонентами традиционной системы piggyBac являются донорская плазмида, содержащая груз, который должен быть вставлен в геном, и вспомогательная плазмида, обеспечивающая транспозазу12. Для повышения эффективности трансформации в хелперной плазмиде используют высокоактивные промоторы для управления экспрессией транспозазы13,14. Поскольку эти промоторы обычно получают из модельных насекомых, их активность у других насекомых может быть не высокой, как у видов, от которых был идентифицирован промотор. Таким образом, транспозазна мРНК более эффективна, чем плазмида-хелпер, которая может улучшить трансформацию зародышевой линии у большинства немодельных насекомых.
В этом протоколе мРНК hyPBase была получена in vitro путем построения плазмиды, содержащей экспрессирующую hyPBase кассету (промотор T7: полиэдрин-5'UTR: hyPBase: многогранник-3'UTR: поли(A) сигнал). Промотор Т7 позволяет синтезировать мРНК in vitro с использованием коммерчески доступных наборов синтеза мРНК. Как полигедрин-5'UTR, так и многогранник-3'UTR могут помочь в улучшении транскрипции мРНК hyPBase in vitro и трансляции белка hyPBase in vivo. Наличие поли (А) сигнала способствует повышению стабильности мРНК hyPBase in vivo15. Кроме того, инъекция компонентов piggyBac в самые ранние эмбрионы с ограниченным количеством делящихся клеток также имеет решающее значение для повышения шансов доставки компонентов системы piggyBac предшественников клеток зародышевой линии. События транспозиции, происходящие в клетках зародышевой линии, могут быть унаследованы. В этом протоколе эмбрионы FAW в возрасте до 2 часов собирались и хранились на льду, чтобы замедлить их развитие перед инъекцией. Для большинства насекомых сбор эмбрионов как можно раньше и поиск способа замедлить их развитие также могут помочь в успешной трансформации зародышевой линии.
Использование флуоресцентных белков в трансгенезе насекомых помогает в идентификации трансгенных животных. В этом протоколе промотор IE1, который, как сообщалось, является эффективным и вездесущим промотором у чешуекрылых насекомых11,полученный из раннего раннего гена вируса ядерного полигедроза Autographa california multicapsid (AcNPV), был объединен с энхансером hr5 для стимулирования экспрессии EGFP. У трансгенных людей, у которых EGFP был вставлен в геном FAW, сигнал EGFP мог наблюдаться на всех этапах (данные не показаны). Молекулярное подтверждение пиггиБак-опосредованнойвставки обычно выполняли с помощью южного пятна или обратной ПЦР и секвенирования. В этом протоколе ПЦР-амплификация фрагмента в трансгенном грузе использовалась для быстрого подтверждения трансгенной вставки. Кроме того, для идентификации сайта интеграции трансгенной вставки 9 наоснове ПЦРбыл использован высокоэффективный метод TAIL-PCR на основе ПЦР, которым легко манипулировать по сравнению с широко используемым методом обратной ПЦР. Разработан высокоэффективный метод TAIL-PCR для идентификации участков трансгенной интеграции в растениях. В данном исследовании этот метод впервые используется у насекомых. Представленный протокол обеспечивает эффективный способ генерации трансгенного FAW, а также может быть в дальнейшем применен ко многим другим модельным и немодельным насекомым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Исследование, о котором сообщается, поддерживается Национальным научным фондом I / UCRC, Центром технологий управления членистоногими в рамках гранта No IIP-1821936 и отраслевыми партнерами, конкурентным грантом Инициативы по исследованиям в области сельского хозяйства и продовольствия No 2019-67013-29351 и Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США (2019-67013-29351 и 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
