Summary
Succesvolle kiembaantransformatie in de herfstlegerworm, Spodoptera frugiperda, werd bereikt met behulp van mRNA van hyperactief piggyBac transposase.
Abstract
Stabiele insertie van genetische lading in insectengenomen met behulp van transponeerbare elementen is een krachtig hulpmiddel voor functionele genomische studies en het ontwikkelen van genetische plaagbestrijdingsstrategieën. Het meest gebruikte transponeerbare element in insectentransformatie is piggyBacen piggyBac-gebaseerdekiembaantransformatie is met succes uitgevoerd in modelinsecten. Het is echter nog steeds een uitdaging om deze technologie toe te passen in niet-modelinsecten die landbouwongedierte bevatten. Dit artikel rapporteert over kiembaantransformatie van een wereldwijde landbouwplaag, de herfstlegerworm (FAW), Spodoptera frugiperda, met behulp van het hyperactieve varkenBac transposase (hyPBase).
In dit werk werd het hyPBase-mRNA geproduceerd en gebruikt in plaats van helpplasmide in embryonale micro-injecties. Deze verandering leidde tot de succesvolle generatie van transgene FAW. Verder worden ook de methoden voor het screenen van transgene dieren, pcr-gebaseerde snelle detectie van transgene insertie en thermische asymmetrische interlaced PCR (TAIL-PCR) -gebaseerde bepaling van de integratieplaats beschreven. Dit artikel presenteert dus een protocol om transgene FAW te produceren, wat piggyBac-gebaseerdetransgenese in FAW en andere lepidoptera-insecten zal vergemakkelijken.
Introduction
De herfstlegerworm (FAW), Spodoptera frugiperda, is inheems in tropische en subtropische gebieden van Amerika. Momenteel is dit een verwoestende insectenherbivoor in meer dan 100 landen wereldwijd1. FAW-larven voeden zich met meer dan 350 waardplanten, waaronder enkele belangrijke basisvoedselgewassen2. Het sterke migratievermogen van FAW-volwassenen draagt bij aan de recente snelle verspreiding van Amerika naar andere plaatsen1,2. Als gevolg hiervan bedreigt dit insect nu de voedselzekerheid internationaal. Het toepassen van nieuwe technologieën kan geavanceerde studies in FAW vergemakkelijken en nieuwe strategieën bieden om deze plaag te beheersen.
Insectenkiemlijntransformatie is gebruikt om de genfunctie te bestuderen en transgene insecten te genereren voor gebruik bij genetische controle3,4. Van de verschillende methoden die worden gebruikt om genetische transformatie bij insecten te bereiken, is de op piggyBac-elementen gebaseerde methode de meest gebruikte methode5. Vanwege de lage transpositiesnelheid is het echter nog steeds een uitdaging om transgenese uit te voeren bij niet-modelinsecten. Onlangs is een hyperactieve versie van piggyBac transposase (hyPBase) ontwikkeld6,7. Kiembaantransformatie werd onlangs bereikt in FAW8, het eerste rapport dat de hyPBase gebruikte bij lepidoptera-insecten. In dit rapport wordt gedetailleerde informatie beschreven over het gebruik van hyPBase mRNA bij het genereren van transgene FAW. De hier beschreven methode kan worden toegepast om de transformatie van andere lepidoptera-insecten te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro synthese van hyPBase mRNA
OPMERKING: De volledige coderingssequentie van de hyPBase-sequentie werd gesynthetiseerd en ingevoegd in een pTD1-Cas9-vector (zie de tabel met materialen) om de pTD1-hyPBase-constructie te produceren, die een hyPBase-expressingcassette bevat, T7-promotor: polyhedrin-5 'UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). De volledige volgorde van de pTD1-hyPBase-constructie wordt verstrekt in het aanvullende materiaal.
- Voorbereiding van de sjabloon voor in vitro synthese
- Voer een PCR-reactie uit om de hyPBase-expressingcassette te versterken met behulp van een voorwaartse primer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', en een omgekeerde primer 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', high-fidelity polymerase en pTD1-hyPBase plasmide als sjabloon.
OPMERKING: De PCR-reactie (eindvolume van 50 μL) bevat 5,0 μL 10x Reactiebuffer, 4,0 μL 10 mM deoxynucleosidetrifosfaat (dNTP), 1,0 μL plasmide (50 μg/μL), 1,0 μL high-fidelity polymerase, 1,0 μL elk van 10 μM voorwaartse en omgekeerde primers en 33 μL nucleasevrij water. De instellingen waren als volgt: een initiële incubatie van 95 °C gedurende 3 min, gevolgd door 35 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 15 s en 68 °C gedurende 2 min. - Controleer het PCR-product op een 1% agarosegel op 120 V in verse Tris-acetaat-ethyleendiamine tetra-azijnzuur (TAE) buffer gedurende 30 minuten en zuiver het product met de gelextractiekit.
OPMERKING: Gebruik de PCR-productzuiveringskit niet. Zelfs een sporenhoeveelheid van het pTD1-hyPBase plasmide vermindert de efficiëntie van in vitro synthese aanzienlijk.
- Voer een PCR-reactie uit om de hyPBase-expressingcassette te versterken met behulp van een voorwaartse primer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', en een omgekeerde primer 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', high-fidelity polymerase en pTD1-hyPBase plasmide als sjabloon.
-
In vitro synthese van hyPBase mRNA met behulp van een commerciële kit
- Ontdooi de bevroren reagentia volledig, houd het enzym en de 2x NTP/CAP-oplossing op ijs en laat de ontdooide 10x Reactiebuffer bij kamertemperatuur staan.
- Monteer de reactie bij kamertemperatuur door toevoeging van de volgende componenten: 2x NTP/CAP-oplossing: 10 μL; 10x Reactie buffer: 2 μL; Sjabloon DNA: 0,1-0,2 μg; Enzymmix: 2 μL; Nucleasevrij water tot 20 μL.
- Meng de reagentia grondig door het mengsel voorzichtig op en neer te pipetteren en gedurende 2-4 uur bij 37 °C te incuberen.
- Terugwinning van gesynthetiseerd mRNA door lithiumchlorideprecipitatie
- Voeg 30 μL LiCl-precipitatieoplossing toe, meng grondig door op de buis te vegen en houd vervolgens gedurende ≥ 30 minuten op -20 °C.
- Centrifugeer bij 4 °C gedurende 15 minuten met de maximale snelheid en verwijder voorzichtig het supernatant.
- Was de pellet eenmaal met 1 ml 70% ethanol, centrifugeer opnieuw en verwijder het supernatant voorzichtig.
- Droog de pellet gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur en resuspend de pellet vervolgens met 20-40 μL nucleasevrij water.
- Verdun 1 μL mRNA-oplossing met 9 μL nucleasevrij water. Neem 2 μL om de mRNA-concentratie te bepalen en gebruik 8 μL om de mRNA-kwaliteit te controleren op een 1% agarosegel bij 100 V in verse TAE-buffer gedurende 40 minuten.
- Vul de mRNA-oplossing toe en bewaar bevroren bij -70 °C gedurende maximaal één jaar.
OPMERKING: Droog de mRNA-pellet niet volledig; het kan moeilijker zijn om het op te lossen in water.
2. Micro-injectie
- Eier verzamelen
- Plaats 12 mannelijke poppen en 12 vrouwelijke poppen in een doos van 15 cm x 15 cm x 10 cm. Bedek de doos met een papieren handdoek. Plaats een 10% sucrose-oplossing in de doos voor het voeden van volwassenen.
- Stel op dag 2 na eclosie de volwassenen 's nachts bloot aan intens licht.
- Breng op dag 3 na eclosie de volwassenen over van stap 2.1.2 naar een donkere plaats. Verzamel de embryo's binnen 2 uur na ovipositie.
- Voeg druppels water toe aan het stuk van een papieren handdoek met verse eieren in een petrischaaltje op ijs. Breng de eieren voorzichtig over op een glazen schuif met een fijne borstel en lijn ze een voor een uit op een glazen dia. Houd de glazen glijden met de uitgelijnde eieren op ijs voordat u micro-injectie.
- Micro-injectie setup
- Injecteer een mengsel van een transgeen versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP)-tot expressie brengend plasmide (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) en steriel gedestilleerd water in de eieren, met behulp van de compensatiedruk van de geautomatiseerde micro-injector (zie de Tabel met materialen).
- Bewaar de geïnjecteerde eieren op 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relatieve vochtigheid totdat ze uitkomen.
- Voed de uitgekomen larven op een kunstmatig dieet en breng elke larve over naar een klein kopje in het vroege3e instar-stadium (~ 6 mm lang en de lichaamskleur wordt zwart).
3. Fluorescentiescreening en genetische kruising
- Verzamel de poppen en plaats ~150 vrouwelijke poppen en ~150 mannelijke poppen in een kooi van 35 cm x 35 cm x 35 cm. Hang verschillende stukjes keukenpapier (~30 cm x 15 cm) in de kooi om de eieren te verzamelen.
- Verzamel de papieren handdoekjes met eieren dagelijks en bewaar de eieren op 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relatieve vochtigheid tot het uitkomen.
- Houd de pasgeboren larven gedurende 5 minuten op 4 °C om ze te immobiliseren en breng ze vervolgens over op een ijskoude plaat.
- Screen de geïmmobiliseerde pasgeboren larven onder een fluorescentie stereomicroscoop. Selecteer de EGFP-positieve pasgeborenen, breng ze in ~ 2 weken naar het popstadium bij 27 ± 1 ° C en scheid ze naar geslacht volgens de fenotypeverschillen in de ventrale buiksegmenten.
OPMERKING: De vrouwelijke pop heeft een spleetachtige genitale opening op het achtste abdominale segment en de cefalische randen van het negende en tiende segment buigen naar de genitale opening. De genitale opening van de mannelijke pop heeft een lichte verhoging op het negende buiksegment. - Plaats de EGFP-positieve poppen en de wildtype poppen van het andere geslacht in een mannelijke: vrouwelijke verhouding van 1:1 in een kooi. Sib-cross de EGFP-uitdrukkende volwassenen om de volgende generaties te produceren.
4. PCR-detectie van transgene insertie
- Extraheer genomisch DNA uit de wild-type en EGFP-positieve individuele larven met behulp van een commerciële genomische DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer een PCR-reactie uit met behulp van het genomische DNA als sjabloon; een voorwaartse primer, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' in de ie1 promotor regio; en een omgekeerde primer, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' in het EGFP-gebied van de transformatievector.
- Stel elke PCR-reactie (eindvolume van 40 μL) in op 20 μL van het polymerasemengsel, 1,0 μL genomisch DNA (40 μg/μL), 1,0 μL elk van 10 μM voorwaartse en omgekeerde primers en 17 μL nucleasevrij water. Gebruik de volgende instellingen: een initiële incubatie van 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 35 cycli van 95 °C voor 20 s, 56 °C voor 20 s en 68 °C voor 40 s.
- Controleer de PCR producten op een 1% agarose gel op 120 V gedurende 30 min.
5. Bepaling van de transgene insertieplaats
- Voer zeer efficiënte TAIL-PCR uit met behulp van genomisch DNA als sjabloon om de integratieplaats van transgene insertie in de EGFP-positieve insecten te bepalen.
- Voer de PCR-reacties uit volgens de stappen die elders worden beschreven9.
- Gebruik drie primers, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', en P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgcgct-3', die specifiek zijn voor de piggyBac-vector, in respectievelijk de 3 rondes van pcr-reactie.
- Voer de PCR-reacties uit volgens de stappen die elders worden beschreven9.
- Volg de uiteindelijke PCR-producten om de integratiesite te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een construct voor de expressie van hyPBase-bevattende T7 promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signaal werd gegenereerd (Figuur 1A) en versterkt als een ~2,2 kb PCR fragment om hyPBase mRNA in vitro te synthetiseren (Figuur 1B). Vervolgens werd het hyPBase-mRNA geproduceerd en onderworpen aan agarose-gel-elektroforese. Het mRNA van de verwachte grootte (~1,1 kb band) werd gedetecteerd op een 1% agarose gel(Figuur 1C).
Vervolgens werd een piggyBac-gebaseerde EGFP-expressieconstructievoorbereid(figuur 2A). Een mengsel van dit plasmide en hyPBase mRNA, of PBS-oplossing, werd binnen 2 uur na ovipositie in embryo's geïnjecteerd. 24 uur na injectie werd een voorbijgaand signaal van EGFP-expressie waargenomen in de geïnjecteerde embryo's. De PBS-geïnjecteerde embryo's vertoonden geen EGFP-signaal (figuur 2B), terwijl de EGFP-tot expressie brengende plasmide en hyPBase mRNA-geïnjecteerde embryo's EGFP-fluorescentie vertoonden (figuur 2C), wat aangeeft dat de piggyBac-constructie succesvol was. Zo kan de hr5ie1-promotor functioneren tijdens de vroege embryonale ontwikkeling.
Ongeveer 2.000 eieren werden geïnjecteerd en ~ 700 van hen ontwikkelden zich tot poppen. De G0-volwassenen werden zelf gekruist en eieren werden verzameld. De G1-larven die uit deze eieren kwamen, werden onderzocht op het EGFP-signaal onder een fluorescentieseeromicroscoop. Zoals te zien is in figuur 3A,vertoonden de transgene larven een sterk EGFP-signaal. Om de inbrenging van de EGFP-expressiecassette in het genoom van EGFP-positieve insecten te testen, werd een fragment met de promotor en het EGFP-fragment versterkt met behulp van het genomische DNA geïsoleerd uit de EGFP-positieve larven als sjabloon (Figuur 3B). Dit fragment werd niet gedetecteerd toen genomisch DNA werd geïsoleerd uit de larven van het wilde type als sjabloon (Figuur 3B). Door het uitvoeren van zeer efficiënte TAIL-PCR en sequencing van de PCR-producten, werd de integratieplaats van transgene insertie bepaald. Zoals te zien is in figuur 4,ligt de transgene integratieplaats in het 81e intron van het Twinchin-achtige gen in chromosoom 26.
Figuur 1: Productie van hyPBase mRNA. (A) De hyPBase-expressing cassette met daarin de T7 promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signaal werd geconstrueerd. (B) De ~2,2 kb DNA-sjabloon voor het synthetiseren van hyPBase-mRNA werd versterkt vanuit het hyPBase-construct. De linkerbaan toont de 1-kb ladderloop op dezelfde gel. (C) Een ~1,1 kb hyPBase mRNA werd gesynthetiseerd uit de versterkte DNA template. De linkerbaan toont de 1-kb ladderloop op dezelfde gel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Expressie van EGFP in geïnjecteerde embryo's. (A) Schematisch diagram van de piggyBac-vector die in dit onderzoek is gebruikt. (B) Er werd geen EGFP-signaal gedetecteerd in embryo's geïnjecteerd met 1x PBS. (C)EGFP-signaal werd gedetecteerd in embryo's geïnjecteerd met de piggyBac vector en hyPBase mRNA. Schaalbalken = 50 μm. Afkortingen: EGFP = enhanced green fluorescent protein en PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van transgene FAW. (A) EGFP-expressie in transgene maar niet in wildtype FAW-larven. Schaalstaven = 0,5 mm. (B) PCR-analyse van genomische insertie van de transgenen. Een paar primers gericht op de promotor- en EGFP-regio's werden gebruikt om een fragment van ~ 0,5 kb te versterken met behulp van het genomische DNA geïsoleerd uit transgene of wild-type FAW-larven als sjabloon. Afkortingen: EGFP = enhanced green fluorescent protein en FAW = Fall armyworm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Genomische inbrenging van piggyBac construct. Genomische insertie van het piggyBac-construct in transgene FAW werd bepaald door TAIL-PCR en sequencing. Chromosoomlokalisatie en gedeeltelijke genomische DNA-sequenties die de grenzen van het piggyBac-construct flankeren, worden getoond. Afkortingen: FAW = Fall armyworm en TAIL-PCR = thermisch asymmetrisch geïnterlinieerde PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend materiaal. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lage omzettingssnelheid en de moeilijkheid om transgene componenten in verse embryo's af te leveren, beperken het succes van kiembaantransformatie bij veel niet-modelinsecten, vooral die van orde, Lepidoptera. Om de kiembaantransformatiesnelheid te verhogen, werd een hyperactieve versie van het meest gebruikte piggyBac transposase (hyPBase) ontwikkeld7,10. Tot op heden wordt succesvolle kiembaantransformatie in lepidopteran insecten voornamelijk gemeld in het model insectenzijderups, Bombyx mori11. Het uitvoeren van transgenesewerk bij andere lepidopteran-insecten, waaronder enkele grote landbouwplagen, is echter nog steeds een uitdaging.
De belangrijkste beperkingen en de belangrijkste stappen voor het opzetten van een transgene FAW-lijn met behulp van dit protocol zijn het synthetiseren van hoogwaardig hyPBase-mRNA en het leveren van piggyBac-transpositiecomponenten in de vroege embryo's. De twee kerncomponenten van het traditionele piggyBac-systeem zijn een donorplasmide met de lading die in het genoom moet worden ingebracht en een helperplasmide dat het transposaselevert 12. Om de transformatie-efficiëntie te verhogen, worden zeer actieve promotors gebruikt in het helperplasmide om de expressie van transposase13,14aan te sturen. Omdat deze promotors meestal worden verkregen uit modelinsecten, is hun activiteit in andere insecten mogelijk niet hoog zoals bij de soort waaruit de promotor werd geïdentificeerd. Transposase-mRNA is dus effectiever dan het helperplasmide, wat de kiembaantransformatie in de meeste niet-modelinsecten kan verbeteren.
In dit protocol werd hyPBase-mRNA in vitro bereid door een plasmide te construeren met daarin de hyPBase-expressing cassette (T7 promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signaal). De T7-promotor maakt in vitro synthese van mRNA mogelijk met behulp van in de handel verkrijgbare mRNA-synthesekits. Zowel polyhedrin-5'UTR als polyhedrin-3'UTR kunnen helpen bij het verbeteren van de transcriptie van hyPBase mRNA in vitro en translatie van hyPBase-eiwit in vivo. De aanwezigheid van het poly (A) signaal helpt de stabiliteit van hyPBase mRNA in vivo teverbeteren15. Bovendien is injectie van de piggyBac-componenten in de zeer vroege embryo's met een beperkt aantal delende cellen ook van cruciaal belang om de kansen op het leveren van piggyBac-systeemcomponentvoorlopers van kiembaancellen te verbeteren. De transpositiegebeurtenissen die zich voordoen in de kiembaancellen kunnen worden overgeërfd. In dit protocol werden FAW-embryo's van minder dan 2 uur oud verzameld en op ijs gehouden om hun ontwikkeling vóór injectie te vertragen. Voor de meeste insecten kan het zo vroeg mogelijk verzamelen van embryo's en het vinden van een manier om hun ontwikkeling te vertragen ook helpen bij een succesvolle kiembaantransformatie.
Het gebruik van fluorescerende eiwitten in insectentransgenese helpt bij de identificatie van transgene dieren. In dit protocol werd de IE1-promotor, waarvan is gemeld dat het een efficiënte en alomtegenwoordige promotor is in lepidoptera-insecten11, afgeleid van het autographa california multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) onmiddellijk vroege gen, gefuseerd met de hr5-versterker om de expressie van EGFP te stimuleren. Bij transgene individuen waarbij EGFP in het FAW-genoom werd ingebracht, kon het EGFP-signaal in alle stadia worden waargenomen (gegevens niet getoond). Moleculaire bevestiging van piggyBac-gemedieerdeinsertie werd meestal uitgevoerd door southern blot of inverse PCR en sequencing. In dit protocol werd PCR-versterking van een fragment in de transgene lading gebruikt om de transgene insertie snel te bevestigen. Bovendien werd een pcr-gebaseerde high-efficiency TAIL-PCR-methode gebruikt om de integratieplaats van transgene insertie9te identificeren , die gemakkelijk te manipuleren is in vergelijking met de veelgebruikte inverse PCR-methode. De zeer efficiënte TAIL-PCR-methode is ontwikkeld om de transgene integratielocaties in planten te identificeren. In deze studie wordt deze methode voor het eerst gebruikt bij insecten. Het gepresenteerde protocol biedt een effectieve manier om transgene FAW te genereren en kan ook verder worden toegepast op veel andere model- en niet-modelinsecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Het gerapporteerde onderzoek wordt ondersteund door de National Science Foundation I / UCRC, het Center for Arthropod Management Technologies, onder Grant No IIP-1821936 en door industriële partners, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 en het National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 en 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
