Summary
La trasformazione germinale di successo nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda,è stata ottenuta utilizzando l'mRNA della trasposasi iperattiva piggyBac.
Abstract
L'inserimento stabile di carichi genetici nei genomi degli insetti utilizzando elementi trasponibili è un potente strumento per studi genomici funzionali e lo sviluppo di strategie genetiche di gestione dei parassiti. L'elemento trasponibile più utilizzato nella trasformazione degli insetti è piggyBace la trasformazione germinale a base di piggyBacè stata condotta con successo negli insetti modello. Tuttavia, è ancora difficile impiegare questa tecnologia in insetti non modello che includono parassiti agricoli. Questo documento riporta la trasformazione germinale di un parassita agricolo globale, il verme dell'esercito autunnale (FAW), Spodoptera frugiperda, utilizzando la trasposasi iperattiva piggyBac (hyPBase).
In questo lavoro, l'mRNA hyPBase è stato prodotto e utilizzato al posto del plasmide helper nelle microiniezioni embrionali. Questo cambiamento ha portato alla generazione di successo di FAW transgenico. Inoltre, vengono descritti anche i metodi di screening degli animali transgenici, il rilevamento rapido basato sulla PCR dell'inserimento transgenico e la determinazione termica asimmetrica interlacciata della PCR (TAIL-PCR) del sito di integrazione. Pertanto, questo documento presenta un protocollo per produrre FAW transgenico, che faciliterà la transgenesi basata su piggyBacin FAW e altri insetti lepidotteri.
Introduction
Il verme dell'esercito autunnale (FAW), Spodoptera frugiperda, è originario delle regioni tropicali e subtropicali dell'America. Attualmente, questo è un erbivoro insetto devastante in più di 100 paesi in tutto il mondo1. Le larve faw si nutrono di oltre 350 piante ospiti, tra cui alcune importanti colture alimentari di base2. La forte capacità migratoria degli adulti FAW contribuisce alla sua recente rapida diffusione dalle Americhe ad altri luoghi1,2. Di conseguenza, questo insetto sta ora minacciando la sicurezza alimentare a livello internazionale. L'applicazione di nuove tecnologie può facilitare studi avanzati in FAW e fornire nuove strategie per gestire questo parassita.
La trasformazione germinale degli insetti è stata utilizzata per studiare la funzione genica e generare insetti transgenici da utilizzare nel controllogenetico3,4. Tra i vari metodi utilizzati per ottenere la trasformazione genetica negli insetti, il metodo basato sugli elementi piggyBac è il metodo più utilizzato5. Tuttavia, a causa del basso tasso di trasposizione, è ancora difficile condurre la transgenesi in insetti non modello. Recentemente, una versione iperattiva di piggyBac transposase (hyPBase) è stata sviluppata6,7. La trasformazione germinale è stata raggiunta in FAW recentemente8, che è il primo rapporto che ha utilizzato l'hyPBase negli insetti lepidotteri. In questo rapporto vengono descritte informazioni dettagliate sull'utilizzo di mRNA hyPBase nella generazione di FAW transgenica. Il metodo qui descritto potrebbe essere applicato per ottenere la trasformazione di altri insetti lepidotteri.
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Protocol
1. Sintesi in vitro di mRNA hyPBase
NOTA: La sequenza di codifica completa della sequenza hyPBase è stata sintetizzata e inserita in un vettore pTD1-Cas9 (vedi la Tabella dei materiali)per produrre il costrutto pTD1-hyPBase, che contiene una cassetta che esprime hyPBase, promotore T7: poliedrino-5' UTR: hyPBase: poliedrina-3' UTR: poly (A). La sequenza completa del costrutto pTD1-hyPBase è fornita nel Materiale supplementare.
- Preparazione del modello per la sintesi in vitro
- Eseguire una reazione PCR per amplificare la cassetta che esprime hyPBase utilizzando un primer in avanti, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3' e un primer inverso 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerasi ad alta fedeltà e plasmide pTD1-hyPBase come modello.
NOTA: La reazione PCR (volume finale di 50 μL) contiene 5,0 μL di 10x tampone di reazione, 4,0 μL di 10 mM di desossinucleoside trifosfato (dNTP), 1,0 μL di plasmide (50 μg/μL), 1,0 μL di polimerasi ad alta fedeltà, 1,0 μL ciascuno di primer avanti e indietro da 10 μM e 33 μL di acqua priva di nucleasi. Le impostazioni erano le seguenti: un'incubazione iniziale di 95 °C per 3 minuti, seguita da 35 cicli di 98 °C per 10 s, 60 °C per 15 s e 68 °C per 2 min. - Controllare il prodotto PCR su un gel di agarosio all'1% a 120 V in tampone fresco di acido tetraacetico Tris-acetato-etilendiammina (TAE) per 30 minuti e purificare il prodotto con il kit di estrazione del gel.
NOTA: non utilizzare il kit di purificazione del prodotto PCR. Anche una traccia del plasmide pTD1-hyPBase riduce significativamente l'efficienza della sintesi in vitro.
- Eseguire una reazione PCR per amplificare la cassetta che esprime hyPBase utilizzando un primer in avanti, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3' e un primer inverso 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerasi ad alta fedeltà e plasmide pTD1-hyPBase come modello.
-
Sintesi in vitro di mRNA hyPBase utilizzando un kit commerciale
- Scongelare completamente i reagenti congelati, mantenere l'enzima e 2x soluzione NTP/CAP sul ghiaccio e lasciare il tampone di reazione 10x scongelato a temperatura ambiente.
- Assemblare la reazione a temperatura ambiente aggiungendo i seguenti componenti: 2x soluzione NTP/CAP: 10 μL; 10x Tampone di reazione: 2 μL; Modello DNA: 0,1-0,2 μg; Miscela enzimatica: 2 μL; Acqua priva di nucleasi a 20 μL.
- Mescolare accuratamente i reagenti convogliando delicatamente la miscela su e giù e incubare a 37 °C per 2-4 ore.
- Recupero dell'mRNA sintetizzato mediante precipitazione del cloruro di litio
- Aggiungere 30 μL di soluzione di precipitazione LiCl, mescolare accuratamente facendo scorrere il tubo e quindi mantenere a -20 °C per ≥ 30 minuti.
- Centrifugare a 4 °C per 15 minuti alla massima velocità e rimuovere con cura il surnatante.
- Lavare il pellet una volta con 1 mL di etanolo al 70%, ricentravorare e rimuovere accuratamente il surnatante.
- Asciugare il pellet a temperatura ambiente per 1-2 minuti, quindi risospesciare il pellet con 20-40 μL di acqua priva di nucleasi.
- Diluire 1 μL di soluzione di mRNA con 9 μL di acqua priva di nucleasi. Prendi 2 μL per determinare la concentrazione di mRNA e usa 8 μL per controllare la qualità dell'mRNA su un gel di agarosio all'1% a 100 V in tampone TAE fresco per 40 minuti.
- Aliquotare la soluzione di mRNA e conservare congelata a -70 °C per un massimo di un anno.
NOTA: Non asciugare completamente il pellet di mRNA; potrebbe essere più difficile scioglierlo in acqua.
2. Microiniezione
- Raccolta di uova
- Metti 12 pupe maschili e 12 pupe femmine in una scatola di 15 cm x 15 cm x 10 cm. Coprire la scatola con un tovagliolo di carta. Posizionare una soluzione di saccarosio al 10% nella scatola per l'alimentazione degli adulti.
- Il giorno 2 dopo l'eclosion, esporre gli adulti a una luce intensa durante la notte.
- Il giorno 3 dopo l'eclosion, trasferisci gli adulti dal passaggio 2.1.2 in un luogo buio. Raccogliere gli embrioni entro 2 ore dall'ovodeposizione.
- Aggiungere gocce d'acqua al pezzo di un tovagliolo di carta con uova fresche conservate in una capsula di Petri su ghiaccio. Trasferire delicatamente le uova su un vetrino con un pennello sottile e allinearle una ad una su una diapositiva di vetro. Tenere i vetrini con le uova allineate sul ghiaccio prima della microiniezione.
- Configurazione della microiniezione
- Iniettare una miscela di un plasmide transgenico che esprime proteine fluorescenti verdi (EGFP) (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, mRNA hyPBase (200 ng/μL) e acqua distillata sterile nelle uova, utilizzando la pressione di compensazione del microiniettore automatizzato (vedere la tabella dei materiali).
- Conservare le uova iniettate a 27 ± 1 °C, 60 ± 10% di umidità relativa fino alla schiusa.
- Nutrire le larve tratteggiate con una dieta artificiale e trasferire ogni larva in una piccola tazza all'inizio del 3° stadio instar (~ 6 mm di lunghezza e il colore del corpo diventa nero).
3. Screening di fluorescenza e incrocio genetico
- Raccogli le pupe e posiziona ~ 150 pupe femmine e ~ 150 pupe maschili in una gabbia di 35 cm x 35 cm x 35 cm. Appendere diversi pezzi di carta assorbente (~ 30 cm x 15 cm) nella gabbia per raccogliere le uova.
- Raccogliere gli asciugamani di carta con le uova ogni giorno e mantenere le uova a 27 ± 1 °C, 60 ± il 10% di umidità relativa fino alla schiusa.
- Tenere le larve neonate a 4 °C per 5 minuti per immobilizzarle, quindi trasferirle su una piastra ghiacciata.
- Schermare le larve neonate immobilizzate sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Selezionare i neonati EGFP-positivi, portarli allo stadio pupale in ~ 2 settimane a 27 ± 1 ° C e separarli per sesso in base alle differenze fenotipiche nei segmenti dell'addome ventrale.
NOTA: La pupa femminile ha un'apertura genitale a fessura sull'ottavo segmento addominale e i margini cefalici del nono e decimo segmento curvano verso l'apertura genitale. L'apertura genitale della pupa maschile ha una leggera elevazione sul nono segmento addominale. - Posiziona le pupe EGFP-positive e le pupe selvatiche del sesso opposto in un rapporto maschio: femmina di 1: 1 in una gabbia. Sib-cross gli adulti che esprimono EGFP per produrre le generazioni successive.
4. Rilevazione PCR dell'inserzione transgenica
- Estrarre il DNA genomico dalle singole larve wild-type e EGFP-positive utilizzando qualsiasi kit commerciale di estrazione del DNA genomico seguendo le istruzioni del produttore.
- Eseguire una reazione PCR utilizzando il DNA genomico come modello; un primer in avanti, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' situato nella regione del promotore ie1; e un primer inverso, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' situato nella regione EGFP del vettore di trasformazione.
- Impostare ogni reazione PCR (volume finale di 40 μL) per contenere 20 μL della miscela di polimerasi, 1,0 μL di DNA genomico (40 μg/μL), 1,0 μL ciascuno di 10 μM di primer avanti e indietro e 17 μL di acqua priva di nucleasi. Utilizzare le seguenti impostazioni: un'incubazione iniziale di 95 °C per 3 minuti, seguita da 35 cicli di 95 °C per 20 s, 56 °C per 20 s e 68 °C per 40 s impostazioni.
- Controllare i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% a 120 V per 30 min.
5. Determinazione del sito di inserimento transgenico
- Eseguire la TAIL-PCR ad alta efficienza utilizzando il DNA genomico come modello per determinare il sito di integrazione dell'inserimento transgenico negli insetti EGFP-positivi.
- Eseguire le reazioni PCR seguendo i passaggi descritti altrove9.
- Utilizzare tre primer, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3' e P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3', che sono specifici per il vettore piggyBac, rispettivamente nei 3 round di reazione PCR.
- Eseguire le reazioni PCR seguendo i passaggi descritti altrove9.
- Sequenziare i prodotti PCR finali per determinare il sito di integrazione.
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Representative Results
Un costrutto per l'espressione del promotore T7 contenente hyPBase: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal è stato generato (Figura 1A) e amplificato come un frammento PCR ~ 2.2 kb per sintetizzare l'mRNA hyPBase in vitro (Figura 1B). Quindi, l'mRNA hyPBase è stato prodotto e sottoposto a elettroforesi su gel di agarosio. L'mRNA della dimensione prevista (banda ~1,1 kb) è stato rilevato su un gel di agarosio all'1% (Figura 1C).
Quindi, è stato preparato un costrutto di espressione EGFP basato su piggyBac(Figura 2A). Una miscela di questo plasmide e mRNA hyPBase, o soluzione PBS, è stata iniettata negli embrioni entro 2 ore dall'ovodeposizione. A 24 ore dall'iniezione, è stato osservato un segnale transitorio di espressione di EGFP negli embrioni iniettati. Gli embrioni iniettati da PBS non hanno mostrato il segnale EGFP (Figura 2B), mentre gli embrioni iniettati con plasmide e hyPBase che esprimono EGFP hanno mostrato fluorescenza EGFP (Figura 2C), indicando che la costruzione di piggyBac ha avuto successo. Pertanto, il promotore hr5ie1 può funzionare durante lo sviluppo embrionale precoce.
Sono state iniettate circa 2.000 uova e circa 700 di esse si sono sviluppate in pupe. Gli adulti G0 sono stati auto-incrociati e le uova sono state raccolte. Le larve G1 schiuse da queste uova sono state esaminate per il segnale EGFP sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Come mostrato nella Figura 3A,le larve transgeniche hanno mostrato un forte segnale EGFP. Per testare l'inserimento della cassetta di espressione EGFP nei genomi degli insetti EGFP-positivi, un frammento contenente il promotore e il frammento EGFP è stato amplificato utilizzando come modello il DNA genomico isolato dalle larve EGFP-positive (Figura 3B). Questo frammento non è stato rilevato quando il DNA genomico è stato isolato dalle larve selvatiche come modello (Figura 3B). Conducendo TAIL-PCR ad alta efficienza e sequenziando i prodotti PCR, è stato determinato il sito di integrazione dell'inserimento transgenico. Come mostrato nella Figura 4,il sito di integrazione transgenica si trova nell'81° introne del gene simile a Twinchin nel cromosoma 26.
Figura 1: Produzione di mRNA hyPBase. (A) È stata costruita la cassetta che esprime hyPBase contenente il promotore T7: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A). (B) Il modello di DNA ~2.2 kb per sintetizzare l'mRNA hyPBase è stato amplificato dal costrutto hyPBase. La corsia di sinistra mostra la scala da 1 kb eseguita sullo stesso gel. (C) Un mRNA hyPBase di ~ 1,1 kb è stato sintetizzato dal modello di DNA amplificato. La corsia di sinistra mostra la scala da 1 kb eseguita sullo stesso gel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Espressione di EGFP in embrioni iniettati. (A) Diagramma schematico del vettore piggyBac utilizzato in questo studio. (B) Nessun segnale EGFP è stato rilevato negli embrioni iniettati con 1x PBS. (C) Il segnale EGFP è stato rilevato in embrioni iniettati con il vettore piggyBac e l'mRNA hyPBase. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: EGFP = proteina fluorescente verde potenziata e PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caratterizzazione dell'espressione transgenica di FAW. (A) EGFP in larve transgeniche ma non in larve di FAW selvatiche. Barre di scala = 0,5 mm. (B) Analisi PCR dell'inserimento genomico dei transgeni. Una coppia di primer mirati alle regioni del promotore e dell'EGFP sono stati utilizzati per amplificare un frammento di ~ 0,5 kb utilizzando il DNA genomico isolato da larve FAW transgeniche o wild-type come modello. Abbreviazioni: EGFP = proteina fluorescente verde potenziata e FAW = verme dell'esercito autunnale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Inserimento genomico del costrutto piggyBac. L'inserimento genomico del costrutto piggyBac nella FAW transgenica è stato determinato mediante TAIL-PCR e sequenziamento. Vengono mostrate la localizzazione cromosomica e le sequenze parziali di DNA genomico che fiancheggiano i confini del costrutto piggyBac. Abbreviazioni: FAW = Fall armyworm e TAIL-PCR = PCR interlacciata termica asimmetrica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Materiale supplementare. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il basso tasso di trasposizione e la difficoltà di fornire componenti transgenici in embrioni freschi limitano il successo della trasformazione germinale in molti insetti non modello, specialmente quelli di ordine, Lepidotteri. Per aumentare il tasso di trasformazione della linea germinale, è stata sviluppata una versione iperattiva della trasposasi piggyBac più utilizzata (hyPBase)7,10. Ad oggi, la trasformazione germinale di successo negli insetti lepidotteri è principalmente riportata nel modello di baco da seta degli insetti, Bombyx mori11. Tuttavia, condurre lavori di transgenesi in altri insetti lepidotteri, compresi alcuni importanti parassiti dell'agricoltura, è ancora impegnativo.
I principali limiti e i passaggi chiave per stabilire una linea FAW transgenica utilizzando questo protocollo sono la sintesi di mRNA hyPBase di alta qualità e la fornitura di componenti di trasposizione piggyBac negli embrioni precoci. I due componenti principali del sistema tradizionale piggyBac sono un plasmide donatore contenente il carico da inserire nel genoma e un plasmide helper che fornisce la transposasi12. Per aumentare l'efficienza di trasformazione, promotori altamente attivi vengono utilizzati nel plasmide helper per guidare l'espressione della transposasi13,14. Poiché questi promotori sono solitamente ottenuti da insetti modello, la loro attività in altri insetti potrebbe non essere elevata come nella specie da cui è stato identificato il promotore. Pertanto, l'mRNA di trasposasi è più efficace del plasmide helper, che può migliorare la trasformazione della linea germinale nella maggior parte degli insetti non modello.
In questo protocollo, l'mRNA hyPBase è stato preparato in vitro costruendo un plasmide contenente la cassetta che esprime hyPBase (promotore T7: poliedrina-5'UTR: hyPBase: poliedrina-3'UTR: segnale poly (A).). Il promotore T7 consente la sintesi in vitro di mRNA utilizzando kit di sintesi di mRNA disponibili in commercio. Sia il poliedrina-5'UTR che il poliedrina-3'UTR potrebbero aiutare a migliorare la trascrizione dell'mRNA hyPBase in vitro e la traduzione della proteina hyPBase in vivo. La presenza del segnale poly (A) aiuta a migliorare la stabilità dell'mRNA hyPBase in vivo15. Inoltre, l'iniezione dei componenti piggyBac negli embrioni molto precoci con un numero limitato di cellule in divisione è anche fondamentale per migliorare le possibilità di fornire progenitori dei componenti del sistema piggyBac delle cellule germinali. Gli eventi di trasposizione che si verificano nelle cellule germinali potrebbero essere ereditati. In questo protocollo, gli embrioni FAW di età inferiore a 2 ore sono stati raccolti e tenuti sul ghiaccio per rallentare il loro sviluppo prima dell'iniezione. Per la maggior parte degli insetti, raccogliere embrioni il prima possibile e trovare un modo per rallentare il loro sviluppo potrebbe anche aiutare a una trasformazione germinale di successo.
L'uso di proteine fluorescenti nella transgenesi degli insetti aiuta nell'identificazione di animali transgenici. In questo protocollo, il promotore IE1, che è stato segnalato per essere un promotore efficiente e onnipresente negli insetti lepidotteri11, derivato dal virus della poliedrosi nucleare multicapside Autographa california (AcNPV) gene precoce immediato, è stato fuso con il potenziatore hr5 per guidare l'espressione di EGFP. Negli individui transgenici in cui EGFP è stato inserito nel genoma FAW, il segnale EGFP potrebbe essere osservato in tutte le fasi (dati non mostrati). La conferma molecolare dell'inserzione mediata da piggyBacè stata solitamente eseguita mediante southern blot o PCR inversa e sequenziamento. In questo protocollo, l'amplificazione PCR di un frammento nel carico transgenico è stata utilizzata per confermare rapidamente l'inserimento transgenico. Inoltre, è stato utilizzato un metodo TAIL-PCR ad alta efficienza basato sulla PCR per identificare il sito di integrazione dell'inserzione transgenica9, che è facile da manipolare rispetto al metodo di PCR inversa ampiamente utilizzato. Il metodo TAIL-PCR ad alta efficienza è stato sviluppato per identificare i siti di integrazione transgenica nelle piante. In questo studio, questo metodo viene utilizzato per la prima volta negli insetti. Il protocollo presentato fornisce un modo efficace per generare FAW transgenico e potrebbe anche essere ulteriormente applicato a molti altri insetti modello e non modello.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
La ricerca riportata è supportata dalla National Science Foundation I / UCRC, dal Center for Arthropod Management Technologies, sotto Grant No IIP-1821936 e da partner industriali, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 e National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 e 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
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