Summary
Framgångsrika bakteriell omvandling i hösten armyworm, Spodoptera frugiperda, uppnåddes med mRNA av hyperaktiv piggyBac transposase.
Abstract
Stabil införande av genetisk last i insektsgenom med hjälp av transponerbara element är ett kraftfullt verktyg för funktionella genomiska studier och utveckling av genetiska skadedjurshanteringsstrategier. Det mest använda transponerbara elementet i insektsomvandling är piggyBac, och piggyBac-baseradbakterieomvandling har framgångsrikt utförts i modellinsekter. Det är dock fortfarande utmanande att använda denna teknik i icke-modellinsekter som inkluderar jordbruksskadedjur. Detta dokument rapporterar om bakteriell omvandling av ett globalt jordbruksskadedjur, fallarmémask (FAW), Spodoptera frugiperda, med hjälp av hyperaktiv piggyBac transposase (hyPBase).
I detta arbete producerades hyPBase mRNA och användes i stället för helperplasmid i embryomikroinjektioner. Denna förändring ledde till den framgångsrika generationen av transgena FAW. Dessutom beskrivs metoderna för screening av transgena djur, PCR-baserad snabb detektion av transgene införing och termisk asymmetrisk sammanflätad PCR (TAIL-PCR) baserad bestämning av integrationsplatsen. Således presenterar detta dokument ett protokoll för att producera transgena FAW, vilket kommer att underlätta piggyBac-baseradtransgenes i FAW och andra lepidopteran insekter.
Introduction
Hösten armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, är infödd till tropiska och subtropiska regioner i Amerika. För närvarande är detta en förödande insekts växtätare i mer än 100 länder över hela världen1. FAW larver matar på mer än 350 värdväxter, inklusive några viktiga basfödsgrödor2. Den starka migrationsförmågan hos FAW vuxna bidrar till dess senaste snabba spridning från Amerika till andra platser1,2. Som ett resultat hotar denna insekt nu livsmedelsförsörjningen internationellt. Tillämpning av ny teknik kan underlätta avancerade studier i FAW och ge nya strategier för att hantera detta skadedjur.
Insektsgroddstransformation har använts för att studera genfunktion och generera transgena insekter för användning i genetisk kontroll3,4. Bland de olika metoderna som används för att uppnå genetisk omvandling hos insekter är den piggyBac-elementbaserade metoden den mest använda metoden5. Men på grund av den låga transpositionshastigheten är det fortfarande utmanande att genomföra transgenes i icke-modellinsekter. Nyligen utvecklades en hyperaktiv version av piggyBac transposase (hyPBase)6,7. Bakteriell omvandling uppnåddes i FAW nyligen8, vilket är den första rapporten som använde hyPBase i lepidopteran insekter. I denna rapport beskrivs detaljerad information om att använda hyPBase mRNA för att generera transgena FAW. Metoden som beskrivs här kan tillämpas för att uppnå omvandlingen av andra lepidopteran insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro-syntes av hyPBase mRNA
OBS: Den fullständiga kodningssekvensen i hyPBase-sekvensen syntetiserades och infogades i en pTD1-Cas9-vektor (se materialtabellen) för att producera pTD1-hyPBase-konstruktionen, som innehåller en hyPBase-uttryckande kassett, T7-promotor: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). Den fullständiga sekvensen av pTD1-hyPBase-konstruktionen finns i tilläggsmaterialet.
- Förberedelse av mallen för in vitro-syntes
- Utför en PCR-reaktion för att förstärka den hyPBase-uttryckande kassetten med en framåt primer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', och en omvänd primer 5'- tagaggccccaaggttatgctag-3', högtrohetspolymeras och pTD1-hyPBase plasmid som mall.
OBS: PCR-reaktionen (slutlig volym på 50 μL) innehåller 5,0 μL 10x reaktionsbuffert, 4,0 μL 10 mM deoxynucleosidetrifosfat (dNTP), 1,0 μL plasmid (50 μg/μL), 1,0 μL högtrohetspolymeras, 1,0 μL vardera μL och 3 μL Inställningarna var följande: en första inkubation på 95 °C i 3 minuter, följt av 35 cykler på 98 °C för 10 s, 60 °C för 15 s och 68 °C i 2 min. - Kontrollera PCR-produkten på en 1% agarosegel vid 120 V i färsk Tris-acetat-etylendiamin tetraättiksyra (TAE) buffert i 30 min och rena produkten med gelextraktionssatsen.
OBS: Använd inte PCR-produktreningssatsen. Även en spårmängd av pTD1-hyPBase-plasmiden minskar avsevärt effektiviteten hos in vitro-syntesen.
- Utför en PCR-reaktion för att förstärka den hyPBase-uttryckande kassetten med en framåt primer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', och en omvänd primer 5'- tagaggccccaaggttatgctag-3', högtrohetspolymeras och pTD1-hyPBase plasmid som mall.
-
In vitro-syntes av hyPBase mRNA med hjälp av ett kommersiellt kit
- Tina de frysta reagenserna helt, förvara enzymet och 2x NTP/CAP-lösningen på is och lämna den tinade 10x reaktionsbufferten vid rumstemperatur.
- Montera reaktionen vid rumstemperatur genom att tillsätta följande komponenter: 2x NTP/CAP-lösning: 10 μL; 10x Reaktionsbuffert: 2 μL; Mall-DNA: 0,1-0,2 μg; Enzymblandning: 2 μL; Nukleasfritt vatten till 20 μL.
- Blanda reagenserna noggrant genom att försiktigt pipettera blandningen upp och ner och inkubera vid 37 °C i 2-4 timmar.
- Återvinning av syntetiserat mRNA med litiumkloridutfällning
- Tillsätt 30 μL LiCl-utfällningslösning, blanda noggrant genom att snärta röret och håll sedan vid -20 °C i ≥ 30 min.
- Centrifugera vid 4 °C i 15 min vid maximal hastighet och ta försiktigt bort supernatanten.
- Tvätta pelleten en gång med 1 ml 70% etanol, centrifugera om och ta bort supernatanten försiktigt.
- Torka pelleten i rumstemperatur i 1-2 min och återanvänd sedan pelleten med 20-40 μL nukleasfritt vatten.
- Späd 1 μL mRNA-lösning med 9 μL nukleasfritt vatten. Ta 2 μL för att bestämma mRNA-koncentrationen och använd 8 μL för att kontrollera mRNA-kvaliteten på en 1% agarosegel vid 100 V i färsk TAE-buffert i 40 min.
- Aliquot mRNA-lösningen och förvara fryst vid -70 °C i upp till ett år.
OBS: Torka inte mRNA-pelleten helt; det kan vara svårare att lösa upp det i vatten.
2. Mikroinjektion
- Äggsamling
- Placera 12 hanvalpar och 12 honvalpar i en låda på 15 cm x 15 cm x 10 cm. Täck lådan med en pappershandduk. Placera en 10% sackaroslösning i lådan för utfodring av vuxna.
- På dag 2 efter utlämnande, utsätta de vuxna för intensivt ljus över natten.
- På dag 3 efter utlämnande, överför de vuxna från steg 2.1.2 till en mörk plats. Samla embryona inom 2 h efter oviposition.
- Tillsätt droppar vatten till en pappershandduk med färska ägg som hålls i en Petri-maträtt på is. Överför äggen försiktigt till en glasrutschbana med en fin borste och justera dem en efter en på en glasrutschbana. Förvara glasglasbilderna med de justerade äggen på is före mikroinjektion.
- Installation av mikroinjektion
- Injicera en blandning av ett transgent förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP)-uttryckande plasmid (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) och sterilt destillerat vatten i äggen, med hjälp av kompensationstrycket från den automatiserade mikroinjektorn (se tabellen över material).
- Håll de injicerade äggen vid 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relativ fuktighet tills de kläcks.
- Mata de kläckta larverna på en konstgjord diet och överför varje larva till en liten kopp i början av 3rd instar-scenen (~ 6 mm i längd och kroppsfärg blir svart).
3. Fluorescensscreening och genetisk korsning
- Samla popparna och placera ~ 150 kvinnliga puppar och ~ 150 manliga puppar i en 35 cm x 35 cm x 35 cm bur. Häng flera pappershanddukar (~ 30 cm x 15 cm) i buret för att samla äggen.
- Samla pappershanddukarna med ägg dagligen och håll äggen vid 27 ± 1 °C, 60 ± 10% relativ fuktighet tills de kläcks.
- Håll de nyfödda larverna vid 4 °C i 5 minuter för att immobilisera dem och överför dem sedan till en iskall tallrik.
- Screena de immobiliserade nyfödda larverna under ett fluorescensstereomikroscope. Välj EGFP-positiva nyfödda, höj dem till pupalstadiet på ~ 2 veckor vid 27 ± 1 °C och separera dem efter kön enligt fenotypskillnaderna vid ventrala buksegmenten.
OBS: Honpuppar har en slitsliknande genital öppning på det åttonde buksegmentet och de cefaliska marginalerna i det nionde och tionde segmenten som går mot könsstympningsöppningen. Den manliga poppens genitala öppning har en liten höjd på det nionde buksegmentet. - Placera den EGFP-positiva puppar och den vilda typen puppar av motsatt kön i en hane: kvinnligt förhållande på 1:1 i en bur. Sib-cross egfp-uttrycka vuxna för att producera följande generationer.
4. PCR-detektion av transgen insättning
- Extrahera genomiskt DNA från vilda och EGFP-positiva enskilda larver med hjälp av någon kommersiell genomisk DNA-extraktionssats enligt tillverkarens instruktioner.
- Utför en PCR-reaktion med det genomiska DNA:t som mall; En främre primer, 5'- acgtacgctcctcgtttccgttc-3' belägen i ie1-promotorregionen; och en omvänd primer, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' belägen i EGFP-regionen i omvandlingsvektorn.
- Ställ in varje PCR-reaktion (slutlig volym på 40 μL) så att den innehåller 20 μL polymerasblandningen, 1,0 μL genomiskt DNA (40 μg/μL), 1,0 μL vardera av 10 μM framåt- och omvända primers och 17 μL nukleasfritt vatten. Använd följande inställningar: en första inkubation på 95 °C i 3 min, följt av 35 cykler på 95 °C för 20 s, 56 °C för 20 s och 68 °C för 40 s inställningar.
- Kontrollera PCR-produkterna på en 1% agarose gel vid 120 V i 30 min.
5. Bestämning av det transgena införingsstället
- Utför högeffektiv TAIL-PCR med genomiskt DNA som mall för att bestämma integrationsplatsen för transgene insättning i EGFP-positiva insekter.
- Utför PCR-reaktionerna enligt de steg som beskrivs någon annanstans9.
- Använd tre primers, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', och P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3', som är specifika för piggyBac vektorn, i 3.
- Utför PCR-reaktionerna enligt de steg som beskrivs någon annanstans9.
- Sekvensera de slutliga PCR-produkterna för att bestämma integrationsplatsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En konstruktion för uttryck av hyPBase-innehållande T7-promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal genererades (figur 1A) och förstärktes som ett ~ 2,2 kb PCR-fragment för att syntetisera hyPBase mRNA in vitro (figur 1B). Sedan producerades hyPBase mRNA och utsattes för agarose gel elektrofores. MRNA av förväntad storlek (~ 1,1 kb band) upptäcktes på en 1% agarose gel (figur 1C).
Sedan förbereddes en piggyBac-baseradEGFP-uttryckskonstruktion (figur 2A). En blandning av denna plasmid och hyPBase mRNA, eller PBS lösning, injicerades i embryon inom 2 h efter oviposition. Vid 24 timmar efter injektion observerades en övergående signal av EGFP-uttryck i de injicerade embryona. De PBS-injicerade embryona visade inte EGFP-signal (figur 2B), medan egfp-uttryckande plasmid och hyPBase mRNA-injicerade embryon visade EGFP fluorescens(figur 2C), vilket indikerar att piggyBac-konstruktionen var framgångsrik. Således kan hr5ie1-promotorn fungera under den tidiga embryonala utvecklingen.
Cirka 2 000 ägg injicerades, och ~ 700 av dem utvecklades till puppar. G0 vuxna var självkorsade, och ägg samlades in. G1 larver kläcktes från dessa ägg undersöktes för EGFP signalen under en fluorescens stereomicroscope. Som visas i figur 3Avisade de transgena larverna en stark EGFP-signal. För att testa införandet av EGFP-uttryckskasetten i genomet hos EGFP-positiva insekter förstärktes ett fragment som innehåller promotorn och EGFP-fragmentet med hjälp av det genomiska DNA som isolerats från egfp-positiva larver som mall (figur 3B). Detta fragment upptäcktes inte när genomiskt DNA isolerades från larverna av vild typ som mall (figur 3B). Genom att genomföra högeffektiva TAIL-PCR och sekvensering av PCR produkter, integration webbplats transgene insättning fastställdes. Som visas i figur 4ligger transgene integrationsplatsen i den 81st intronen av twinchin-liknande genen i kromosom 26.
Figur 1: Produktion av hyPBase mRNA. (A) Den hyPBase-uttryckande kassetten som innehåller T7-promotorn: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal konstruerades. (B) DNA-mallen ~2,2 kb för att syntetisera hyPBase mRNA förstärktes från hyPBase-konstruktionen. Vänster körfält visar 1-kb stege springa på samma gel. (C) En ~1,1 kb hyPBase mRNA syntetiserades från den förstärkta DNA-mallen. Vänster körfält visar 1-kb stege springa på samma gel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Uttryck av EGFP i injicerade embryon. (A) Schematiskt diagram över den piggyBac vektor som används i denna studie. (B)Ingen EGFP-signal upptäcktes i embryon som injicerats med 1x PBS. (C) EGFP-signalen upptäcktes i embryon som injicerats med piggyBac-vektorn och hyPBase mRNA. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein och PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Karakterisering av transgena FAW. (A) EGFP uttryck i transgena men inte i vilda FAW larver. Skalstänger = 0,5 mm (B) PCR-analys av genomisk infogning av transgenerna. Ett par primers riktade mot promotorn och EGFP-regionerna användes för att förstärka ett ~0,5 kb fragment med hjälp av det genomiska DNA isolerat från transgena eller vilda FAW larver som mall. Förkortningar: EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein och FAW = Fall armyworm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Genomisk infogning av piggyBac konstruktion. Genomisk införande av piggyBac konstruktion i transgena FAW fastställdes av TAIL-PCR och sekvensering. Kromosomlokalisering och partiella genomiska DNA-sekvenser som flankerar gränserna för piggyBac-konstruktionen visas. Förkortningar: FAW = Fall armyworm och TAIL-PCR = termisk asymmetrisk sammanflätad PCR. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Kompletterande material. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den låga graden av införlivande och svårigheten att leverera transgena komponenter till färska embryon begränsar framgången för bakteriell omvandling i många icke-modellinsekter, särskilt de från ordning, Lepidoptera. För att öka bakterieomvandlingshastigheten utvecklades en hyperaktiv version av den mest använda piggyBac-transponerasen (hyPBase)7,10. Hittills rapporteras framgångsrik bakterieomvandling i lepidopteran insekter främst i modellen insektssilkemask, Bombyx mori11. Att utföra transgenesarbete i andra lepidopteran insekter, inklusive några stora jordbruks skadedjur, är dock fortfarande utmanande.
De stora begränsningarna och de viktigaste stegen för att upprätta en transgen FAW-linje med hjälp av detta protokoll är att syntetisera högkvalitativ hyPBase mRNA och leverera piggyBac införlivande komponenter till de tidiga embryona. De två kärnkomponenterna i det traditionella piggyBac-systemet är en donatorplasmid som innehåller lasten som ska föras in i genomet och en hjälparplasmid som tillhandahåller transposas12. För att öka omvandlingseffektiviteten används mycket aktiva promotorer i hjälparplasmiden för att driva uttrycket av transposas13,14. Eftersom dessa promotors vanligtvis erhålls från modellinsekter, kan deras aktivitet i andra insekter inte vara hög som i de arter från vilka promotorn identifierades. Således är transposas mRNA effektivare än hjälparens plasmid, vilket kan förbättra bakterieomvandlingen i de flesta icke-modellinsekter.
I detta protokoll utarbetades hyPBase mRNA in vitro genom att konstruera en plasmid som innehåller hyPBase-uttryckande kassett (T7-promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal). T7-promotorn tillåter in vitro-syntes av mRNA med hjälp av kommersiellt tillgängliga mRNA-syntessatser. Både polyhedrin-5'UTR och polyhedrin-3'UTR kan bidra till att förbättra transkriptionen av hyPBase mRNA in vitro och översättning av hyPBase protein in vivo. Närvaron av poly (A) signalen hjälper till att förbättra stabiliteten hos hyPBase mRNA in vivo15. Dessutom är injektion av piggyBac-komponenterna i de mycket tidiga embryona med ett begränsat antal delningsceller också avgörande för att förbättra chanserna att leverera piggyBac-systemkomponentprogenitorer av könsceller. De införlivande händelser som inträffar i könscellerna kan ärvas. I detta protokoll samlades FAW-embryon som var yngre än 2 timmar in och hölls på is för att bromsa deras utveckling före injektionen. För de flesta insekter kan insamling av embryon så tidigt som möjligt och hitta ett sätt att bromsa deras utveckling också bidra till framgångsrik bakteriell omvandling.
Användning av fluorescerande proteiner i insektstransgenes hjälper till att identifiera transgena djur. I detta protokoll, IE1 promotorn, som har rapporterats vara en effektiv och allestädes närvarande promotor i lepidopteran insekter11, härrörde från Autographa kalifornien multicapsid nukleär polyhedrosis virus (AcNPV) omedelbar tidig gen, smältes samman med hr5 förstärkare för att driva uttrycket av EGFP. Hos transgena individer där EGFP infördes i FAW-genomet kunde EGFP-signalen observeras i alla skeden (data som inte visades). Molekylär bekräftelse av piggyBac-medieradinsättning utfördes vanligtvis av södra blot eller inverterad PCR och sekvensering. I detta protokoll användes PCR förstärkning av ett fragment i den transgena lasten för att bekräfta transgena införing snabbt. Dessutom användes en PCR-baserad högeffektiv TAIL-PCR-metod för att identifiera integrationsplatsen för transgen insättning9, vilket är lätt att manipulera jämfört med den allmänt använda omvända PCR-metoden. Den högeffektiva TAIL-PCR-metoden utvecklades för att identifiera de transgena integrationsplatserna i anläggningar. I denna studie används denna metod för första gången i insekter. Det presenterade protokollet ger ett effektivt sätt att generera transgen FAW och kan också tillämpas ytterligare på många andra modeller och icke-modell insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Den rapporterade forskningen stöds av National Science Foundation I/UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, under Grant No IIP-1821936 och av branschpartners, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 och National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 och 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
