Summary
Vellykket bakterietransformasjon i fallhærormen, Spodoptera frugiperda, ble oppnådd ved hjelp av mRNA av hyperaktiv piggyBac transposase.
Abstract
Stabil innsetting av genetisk last i insektgenomer ved hjelp av transponerbare elementer er et kraftig verktøy for funksjonelle genomiske studier og utvikling av genetiske skadedyrshåndteringsstrategier. Det mest brukte transponerbare elementet i insekttransformasjon er piggyBac, og piggyBac-basertbakterietransformasjon har blitt vellykket utført i modellinsekter. Det er imidlertid fortsatt utfordrende å bruke denne teknologien i ikke-modellinsekter som inkluderer landbruksskade. Denne artikkelen rapporterer om bakterietransformasjon av et globalt landbruksskade, fallhærormen (FAW), Spodoptera frugiperda, ved hjelp av hyperaktiv piggyBac transposase (hyPBase).
I dette arbeidet ble hyPBase mRNA produsert og brukt i stedet for hjelperplasmid i embryomikroinjeksjoner. Denne endringen førte til den vellykkede generasjonen av transgen FAW. Videre er metodene for screening av transgene dyr, PCR-basert rask deteksjon av transgene innsetting og termisk asymmetrisk sammenflettet PCR (TAIL-PCR)-basert bestemmelse av integrasjonsstedet, også beskrevet. Dermed presenterer dette papiret en protokoll for å produsere transgene FAW, som vil lette piggyBac-baserttransgenese i FAW og andre lepidopteran insekter.
Introduction
Fallhærormen (FAW), Spodoptera frugiperda, er innfødt til tropiske og subtropiske regioner i Amerika. For tiden er dette en ødeleggende insekt plantelevende i mer enn 100 land over hele verden1. FAW larver spiser på mer enn 350 vertsplanter, inkludert noen viktige stiftematavlinger2. Den sterke migrasjonsevnen til FAW voksne bidrar til sin nylige raske spredning fra Amerika til andre steder1,2. Som et resultat truer dette insektet nå matsikkerhet internasjonalt. Bruk av ny teknologi kan legge til rette for avanserte studier i FAW og gi nye strategier for å håndtere dette.
Insekt germline transformasjon har blitt brukt til å studere genfunksjon og generere transgene insekter for bruk i genetisk kontroll3,4. Blant de ulike metodene som brukes for å oppnå genetisk transformasjon i insekter, er piggyBac elementbasert metode den mest brukte metoden5. På grunn av den lave transposisjonen er det imidlertid fortsatt utfordrende å gjennomføre transgenese i ikke-modellinsekter. Nylig ble en hyperaktiv versjon av piggyBac transposase (hyPBase) utviklet6,7. Germline transformasjon ble oppnådd i FAW nylig8, som er den første rapporten som brukte hyPBase i lepidopteran insekter. I denne rapporten beskrives detaljert informasjon om bruk av hyPBase mRNA ved generering av transgen FAW. Metoden beskrevet her kan brukes for å oppnå transformasjon av andre lepidopteran insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro syntese av hyPBase mRNA
MERK: Den komplette kodesekvensen til hyPBase-sekvensen ble syntetisert og satt inn i en pTD1-Cas9-vektor (se materialtabellen) for å produsere pTD1-hyPBase-konstruksjonen, som inneholder en hyPBase-uttrykkende kassett, T7-promotor: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). Den fullstendige sekvensen av pTD1-hyPBase-konstruksjonen finnes i tilleggsmaterialet.
- Klargjøring av malen for in vitro-syntese
- Utfør en PCR-reaksjon for å forsterke den hyPBase-uttrykkende kassetten ved hjelp av en fremoverprimer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', og en omvendt primer 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', high-fidelity polymerase og pTD1-hyPBase plasmid som mal.
MERK: PCR-reaksjonen (sluttvolum på 50 μL) inneholder 5,0 μL 10x reaksjonsbuffer, 4,0 μL 10 mM deoksynukleoside tripfosfat (dNTP), 1,0 μL plasmid (50 μg/μL), 1,0 μL høy-μl av high-μase polymer, 1,0 μL hver av 10 μM forover og bakover primere, og 33 μL nukleasefritt vann. Innstillingene var som følger: en innledende inkubasjon på 95 °C i 3 minutter, etterfulgt av 35 sykluser på 98 °C i 10 s, 60 °C i 15 s og 68 °C i 2 minutter. - Kontroller PCR-produktet på en 1% agarose gel ved 120 V i fersk Tris-acetat-etylendiamin tetraacetic acid (TAE) buffer i 30 min og rens produktet med gel ekstraksjon kit.
MERK: Ikke bruk PCR-produktrensesettet. Selv en spormengde av pTD1-hyPBase plasmid reduserer effektiviteten av in vitro syntese betydelig.
- Utfør en PCR-reaksjon for å forsterke den hyPBase-uttrykkende kassetten ved hjelp av en fremoverprimer, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', og en omvendt primer 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', high-fidelity polymerase og pTD1-hyPBase plasmid som mal.
-
In vitro-syntese av hyPBase mRNA ved hjelp av et kommersielt sett
- Tin de frosne reagensene helt, hold enzymet og 2x NTP/CAP-oppløsningen på is, og la den opptinte 10x Reaksjonsbufferen stå ved romtemperatur.
- Monter reaksjonen ved romtemperatur ved å legge til følgende komponenter: 2x NTP/ CAP-løsning: 10 μL; 10x Reaksjonsbuffer: 2 μL; Mal DNA: 0,1-0,2 μg; Enzymblanding: 2 μL; Nukleasefritt vann til 20 μL.
- Bland reagensene grundig ved å forsiktig røre blandingen opp og ned og inkubere ved 37 °C i 2-4 timer.
- Gjenvinning av syntetisert mRNA ved litiumkloridutfelling
- Tilsett 30 μL LiCl utfellingsløsning, bland grundig ved å flikke røret, og hold det deretter ved -20 °C i ≥ 30 minutter.
- Sentrifuge ved 4 °C i 15 minutter ved maksimal hastighet, og fjern forsiktig supernatanten.
- Vask pellet en gang med 1 ml 70% etanol, re-sentrifuge, og fjern supernatanten forsiktig.
- Tørk pelletsen ved romtemperatur i 1-2 min, og resuspend deretter pelletsen med 20-40 μL nukleasefritt vann.
- Fortynn 1 μL mRNA-oppløsning med 9 μL nukleasefritt vann. Ta 2 μL for å bestemme mRNA-konsentrasjonen og bruk 8 μL for å sjekke mRNA-kvaliteten på en 1% agarose gel ved 100 V i fersk TAE-buffer i 40 minutter.
- Aliquot mRNA-løsningen og oppbevar den frosset ved -70 °C i opptil ett år.
MERK: Ikke tørk mRNA-pellet helt; det kan være vanskeligere å oppløse det i vann.
2. Mikroinjeksjon
- Egg samling
- Plasser 12 mannlige pupper og 12 kvinnelige pupper i en boks på 15 cm x 15 cm x 10 cm. Dekk esken med et papirhåndkle. Legg en 10% sukroseoppløsning i esken for fôring av voksne.
- På dag 2 post eclosion, utsette de voksne for intens lys over natten.
- På dag 3 post eclosion, overføre de voksne fra trinn 2.1.2 til et mørkt sted. Samle embryoene innen 2 timer etter oviposisjon.
- Tilsett dråper vann til et papirhåndkle med ferske egg holdt i en Petri-tallerken på is. Overfør eggene forsiktig til en glasssklie med en fin børste og juster dem en etter en på et glasssklie. Hold glasssklier med de justerte eggene på is før mikroinjeksjon.
- Oppsett av mikroinjeksjon
- Injiser en blanding av et transgent forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP)-uttrykkende plasmid (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL) og sterilt destillert vann i eggene, ved hjelp av kompensasjonstrykket til den automatiserte mikroinjektoren (se materialtabellen).
- Hold de injiserte eggene på 27 ± 1 °C, 60 ± 10 % relativ fuktighet til klekking.
- Fôr de klekkede larver på et kunstig kosthold, og overfør hver larve til en liten kopp på tidlig 3rd instar stadium (~ 6 mm i lengde, og kroppsfarge blir svart).
3. Fluorescensscreening og genetisk kryssing
- Samle puppene og legg ~ 150 kvinnelige pupper og ~ 150 mannlige pupper i et 35 cm x 35 cm x 35 cm bur. Heng flere stykker papirhåndklær (~ 30 cm x 15 cm) i buret for å samle eggene.
- Samle papirhåndklærne med egg daglig, og hold eggene på 27 ± 1 °C, 60 ± 10 % relativ fuktighet til klekking.
- Hold neonate larver på 4 °C i 5 minutter for å immobilisere dem, og overfør dem deretter til en iskald tallerken.
- Screen de immobiliserte neonate larver under en fluorescens stereomikroskop. Velg EGFP-positive nyfødte, løft dem til puppetrinnet om ~ 2 uker ved 27 ± 1 °C, og skill dem etter kjønn i henhold til fenotypeforskjellene ved de ventrale magesegmentene.
MERK: Den kvinnelige puppen har en spaltelignende kjønnsåpning på det åttende buksegmentet og de cephaliske marginene i niende og tiende segmenter som bøyer seg mot kjønnsåpningen. Kjønnsåpningen av den mannlige puppen har en liten høyde på det niende buksegmentet. - Plasser EGFP-positive pupper og villtype pupper av motsatt kjønn hos en mann: kvinnelig forhold på 1:1 i et bur. Sib-cross EGFP-uttrykkende voksne for å produsere følgende generasjoner.
4. PCR-påvisning av transgen innsetting
- Trekk ut genomisk DNA fra de ville og EGFP-positive individuelle larver ved hjelp av ethvert kommersielt genomisk DNA-ekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Utfør en PCR-reaksjon ved hjelp av det genomiske DNA-et som mal; en forward primer, 5'- acgtacgctcctcgtgtccgttc-3 ' ligger i ie1 promotør regionen; og en omvendt primer, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' som ligger i EGFP-regionen i transformasjonsvektoren.
- Sett opp hver PCR-reaksjon (siste volum på 40 μL) for å inneholde 20 μL polymeraseblandingen, 1,0 μL genomisk DNA (40 μg/μL), 1,0 μL hver av 10 μM fremover og omvendt primere, og 17 μL nukleasefritt vann. Bruk følgende innstillinger: en innledende inkubasjon på 95 °C i 3 minutter, etterfulgt av 35 sykluser på 95 °C i 20 s, 56 °C i 20 s og 68 °C for innstillinger på 40 s.
- Sjekk PCR-produktene på en 1% agarose gel ved 120 V i 30 min.
5. Bestemmelse av det transgene innsettingsstedet
- Utfør høyeffektiv TAIL-PCR ved hjelp av genomisk DNA som mal for å bestemme integrasjonsstedet for transgene innsetting i EGFP-positive insekter.
- Utfør PCR-reaksjonene ved å følge trinnene som er beskrevet andre steder9.
- Bruk tre primere, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', og P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3', som er spesifikke for piggyBac-vektoren, i de 3 rundene med PCR-reaksjon, henholdsvis.
- Utfør PCR-reaksjonene ved å følge trinnene som er beskrevet andre steder9.
- Sekvenser de endelige PCR-produktene for å bestemme integrasjonsstedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En konstruksjon for uttrykket av hyPBase-inneholdende T7-promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal ble generert (Figur 1A) og forsterket som et ~2.2 kb PCR-fragment for å syntetisere hyPBase mRNA in vitro (Figur 1B). Deretter ble hyPBase mRNA produsert og utsatt for agarose gel elektroforese. mRNA av forventet størrelse (~1,1 kb band) ble oppdaget på en 1% agarose gel (Figur 1C).
Deretter ble det utarbeidet en piggyBac-basertEGFP-uttrykkskonstruksjon (figur 2A). En blanding av denne plasmid- og hyPBase mRNA- eller PBS-løsningen ble injisert i embryoer innen 2 timer etter oviposisjon. Ved 24 timer etter injeksjon ble det observert et forbigående signal om EGFP-uttrykk i de injiserte embryoene. De PBS-injiserte embryoene viste ikke EGFP-signal (figur 2B), mens EGFP-uttrykkende plasmid- og hyPBase mRNA-injiserte embryoer viste EGFP-fluorescens (figur 2C), noe som indikerer at piggyBac-konstruksjonen var vellykket. Dermed kan hr5ie1-promotoren fungere under den tidlige embryonale utviklingen.
Omtrent 2000 egg ble injisert, og ~ 700 av dem utviklet seg til pupper. G0-voksne var selvkrysset, og egg ble samlet inn. G1 larver klekket ut fra disse eggene ble undersøkt for EGFP-signalet under et fluorescens stereomikroskop. Som vist i figur 3Aviste de transgene larver et sterkt EGFP-signal. For å teste innsettingen av EGFP-uttrykkskassett i genomene til EGFP-positive insekter, ble et fragment som inneholder promotoren og EGFP-fragmentet forsterket ved hjelp av det genomiske DNA isolert fra EGFP-positive larver som mal (Figur 3B). Dette fragmentet ble ikke oppdaget da genomisk DNA ble isolert fra villtype larver som mal (figur 3B). Ved å utføre høyeffektiv TAIL-PCR og sekvensering av PCR-produktene, ble integrasjonsstedet for transgene innsetting bestemt. Som vist i figur 4ligger transgeneintegrasjonsstedet i 81st intron av det Twinchin-lignende genet i kromosom 26.
Figur 1: Produksjon av hyPBase mRNA. (A) Den hyPBase-uttrykkende kassetten som inneholder T7-promotoren: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal ble konstruert. (B) DNA-malen ~2,2 kb for syntetisering av hyPBase mRNA ble forsterket fra hyPBase-konstruksjonen. Venstre kjørefelt viser 1-kb stigen kjører på samme gel. (C) A ~1,1 kb hyPBase mRNA ble syntetisert fra den forsterkede DNA-malen. Venstre kjørefelt viser 1-kb stigen kjører på samme gel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Uttrykk for EGFP injiserte embryoer. (A) Skjematisk diagram over piggyBac-vektoren som brukes i denne studien. (B) Det ble ikke påvist noe EGFP-signal i embryoer injisert med 1x PBS. (C) EGFP-signal ble påvist i embryoer injisert med piggyBac-vektoren og hyPBase mRNA. Skalastenger = 50 μm. Forkortelser: EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein og PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av transgen FAW. (A) EGFP-uttrykk i transgene, men ikke i ville FAW-larver. Skalastenger = 0,5 mm. (B) PCR-analyse av genomisk innsetting av transgenes. Et par primere rettet mot promotoren og EGFP-regionene ble brukt til å forsterke et fragment på ~ 0,5 kb ved hjelp av det genomiske DNA-et isolert fra transgene eller ville FAW-larver som mal. Forkortelser: EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein og FAW = Fall armyworm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Genomisk innsetting av piggyBac-konstruksjon. Genomisk innsetting av piggyBac-konstruksjonen i transgen FAW ble bestemt av TAIL-PCR og sekvensering. Kromosomlokalisering og delvis genomiske DNA-sekvenser som flankerer grensene til piggyBac-konstruksjonen vises. Forkortelser: FAW = Fall armyworm og TAIL-PCR = termisk asymmetrisk sammenflettet PCR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsmateriale. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den lave graden av transposisjon og vanskeligheter med å levere transgene komponenter til friske embryoer begrenser suksessen til bakterietransformasjon i mange ikke-modellinsekter, spesielt de fra rekkefølge, Lepidoptera. For å øke bakterietransformasjonshastigheten ble en hyperaktiv versjon av den mest brukte piggyBac transposase (hyPBase) utviklet7,10. Til dags dato er vellykket bakterietransformasjon i lepidopteran insekter hovedsakelig rapportert i modellen insekt silkeorm, Bombyx mori11. Imidlertid er det fortsatt utfordrende å utføre transgenesearbeid i andre lepidopteran insekter, inkludert noen store landbruksskade.
De viktigste begrensningene og de viktigste trinnene for å etablere en transgen FAW-linje ved hjelp av denne protokollen er å syntetisere hyPBase mRNA av høy kvalitet og levere piggyBac-transposisjonskomponenter til de tidlige embryoene. De to kjernekomponentene i det tradisjonelle piggyBac-systemet er en donorplasmid som inneholder lasten som skal settes inn i genomet og en hjelperplasmid som gir transposase12. For å øke transformasjonseffektiviteten brukes svært aktive promotorer i hjelperplasmid for å drive uttrykket transposase13,14. Siden disse promotorene vanligvis er hentet fra modellinsekter, kan deres aktivitet i andre insekter ikke være høy som i arten som promotoren ble identifisert fra. Dermed er transposase mRNA mer effektiv enn hjelperplasmid, noe som kan forbedre bakterietransformasjon i de fleste ikke-modellinsekter.
I denne protokollen ble hyPBase mRNA utarbeidet in vitro ved å konstruere en plasmid som inneholder hyPBase-uttrykkende kassett (T7-promotor: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) signal). T7-promotoren tillater in vitro-syntese av mRNA ved hjelp av kommersielt tilgjengelige mRNA-syntesesett. Både polyhedrin-5'UTR og polyhedrin-3'UTR kan bidra til å forbedre transkripsjonen av hyPBase mRNA in vitro og oversettelse av hyPBase protein in vivo. Tilstedeværelsen av poly (A) signalet bidrar til å forbedre stabiliteten til hyPBase mRNA in vivo15. I tillegg er injeksjon av piggyBac-komponentene i de svært tidlige embryoene med et begrenset antall delingsceller også avgjørende for å forbedre sjansene for å levere piggyBac-systemkomponentgenitorer av bakterieceller. Transposisjonshendelsene som forekommer i bakteriecellene, kan arves. I denne protokollen ble FAW-embryoer mindre enn 2 timer gamle samlet og holdt på is for å bremse utviklingen før injeksjon. For de fleste insekter kan innsamling av embryoer så tidlig som mulig og finne en måte å bremse utviklingen på også bidra til vellykket bakterietransformasjon.
Ved hjelp av fluorescerende proteiner i insekttransgenese hjelper til med identifisering av transgene dyr. I denne protokollen ble IE1-promotoren, som har blitt rapportert å være en effektiv og allestedsnærværende promotor i lepidopteran insekter11, avledet fra Autographa california multicapsid kjernefysisk polyhedrosevirus (AcNPV) umiddelbart tidlig gen, smeltet sammen med hr5-forsterkeren for å drive uttrykket av EGFP. Hos transgene individer der EGFP ble satt inn i FAW-genomet, kunne EGFP-signalet observeres i alle stadier (data ikke vist). Molekylær bekreftelse av piggyBac-mediert innsetting ble vanligvis utført av sørlige flekker eller omvendt PCR og sekvensering. I denne protokollen ble PCR-forsterkning av et fragment i den transgene lasten brukt til å bekrefte den transgene innsettingen raskt. I tillegg ble en PCR-basert høyeffektiv TAIL-PCR-metode brukt til å identifisere integrasjonsstedet for transgen innsetting9, som er lett å manipulere sammenlignet med den mye brukte omvendte PCR-metoden. Den høyeffektive TAIL-PCR-metoden ble utviklet for å identifisere de transgene integrasjonsstedene i planter. I denne studien brukes denne metoden for første gang i insekter. Den presenterte protokollen gir en effektiv måte å generere transgen FAW og kan også brukes videre på mange andre modell- og ikke-modellinsekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forskningen som rapporteres støttes av National Science Foundation I/UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, under Grant No IIP-1821936 og av industripartnere, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 og National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 og 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
