Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

Published: September 23, 2021 doi: 10.3791/62714
Automatic Translation
1, 1
1Department of Entomology, College of Agriculture, Food and Environment, University of Kentucky

Summary

טרנספורמציה נבט מוצלחת תולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda, הושג באמצעות mRNA של piggyBac היפראקטיבי transposase.

Abstract

החדרה יציבה של מטען גנטי לגנומי חרקים באמצעות אלמנטים הניתנים להחלפה היא כלי רב עוצמה למחקרים גנומיים פונקציונליים ולפיתוח אסטרטגיות לניהול מזיקים גנטיים. האלמנט הנפוץ ביותר לשינוי חרקים הוא piggyBac, ושינוי נבטים מבוסס piggyBacנערך בהצלחה בחרקים לדוגמה. עם זאת, עדיין קשה להשתמש בטכנולוגיה זו בחרקים שאינם מודל הכוללים מזיקים חקלאיים. מאמר זה מדווח על טרנספורמציה נבט של מזיק חקלאי גלובלי, תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, באמצעות piggyBac transposase היפראקטיבי (hyPBase).

בעבודה זו, ה- hyPBase mRNA יוצר ושימש במקום פלסמיד עוזר במיקרו-בייג'ציות עובריות. שינוי זה הוביל לדור המוצלח של FAW מהונדס. יתר על כן, מתוארים גם שיטות הסינון של בעלי חיים מהונדסים, זיהוי מהיר מבוסס PCR של החדרת טרנסג'נים וקביעה אסימטרית תרמית של PCR (TAIL-PCR) של אתר האינטגרציה. לפיכך, מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור FAW מהונדס, אשר יקל על transgenesis מבוסס piggyBacב- FAW וחרקים לפידופטרנים אחרים.

Introduction

תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, היא ילידת אזורים טרופיים וסובטרופיים של אמריקה. נכון לעכשיו, זהו אוכל עשב חרקים הרסני ביותר מ -100 מדינות ברחבי העולם1. זחלי FAW ניזונים מיותר מ־350 צמחים מארחים, כולל כמה גידולי מזון חשובים2. יכולת ההגירה החזקה של בוגרי FAW תורמת להתפשטות המהירה האחרונה שלה מיבשת אמריקה למקומות אחרים1,2. כתוצאה מכך, חרק זה מאיים כעת על ביטחון המזון ברחבי העולם. יישום טכנולוגיות חדשות עשוי להקל על מחקרים מתקדמים ב- FAW ולספק אסטרטגיות חדשניות לניהול מזיק זה.

שינוי חיידקי חרקים שימש לחקר תפקוד הגנים ולייצור חרקים מהונדסים לשימוש בשליטה גנטית3,4. בין השיטות השונות המשמשות להשגת טרנספורמציה גנטית בחרקים, השיטה המבוססת על אלמנט piggyBac היא השיטה הנפוצה ביותר5. עם זאת, בשל השיעור הנמוך של טרנספוזיציה, זה עדיין מאתגר לנהל טרנסגנזה בחרקים שאינם מודל. לאחרונה, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase (hyPBase) פותחה6,7. טרנספורמציה Germline הושגה לאחרונה FAW8, שהוא הדו"ח הראשון שהשתמש hyPBase חרקים lepidopteran. בדו"ח זה, מידע מפורט על שימוש hyPBase mRNA ביצירת FAW מהונדס מתואר. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשיג את השינוי של חרקים lepidopteran אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה במבחנה של hyPBase mRNA

הערה: רצף הקידוד המלא של רצף hyPBase היה מסונתז והוכנס לווקטור pTD1-Cas9 (ראה טבלת החומרים) כדי לייצר את מבנה בסיס ה- pTD1-hyPBase, המכיל קלטת הבעת hyPBase, מקדם T7: פוליהדרין-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). הרצף המלא של מבנה pTD1-hyPBase מסופק בחומר המשלים.

  1. הכנת התבנית לסינתזה במבחנה
    1. בצע תגובת PCR כדי להגביר את הקלטת המביעה hyPBase באמצעות פריימר קדמי, 5'- atgctgtgaaataccgcacagatgcg-3', ו- פריימר הפוך 5'- tagaggccccaaggttatgtctag-3', פולימראז בעל נאמנות גבוהה ו- pTD1-hyPBase plasmid כתבנית.
      הערה: תגובת PCR (נפח סופי של 50 μL) מכיל 5.0 μL של 10x חיץ תגובה, 4.0 μL של 10 mM deoxynucleoside טריפוספט (dNTP), 1.0 μL של plasmid (50 מיקרוגרם / μL), 1.0 μL של פולימראז אמינות גבוהה, 1.0 μL כל אחד של 10 מיקרומטר קדימה והפוך פריימרים, ו 33 μL של מים ללא נוקלאז. ההגדרות היו כדלקמן: דגירה ראשונית של 95 °C (70 °F) במשך 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 98 °C (50 °F) במשך 10 מעלות צלזיוס, 60 °C (70 °F) במשך 15 °C (68 °F) למשך 2 דקות.
    2. בדוק את מוצר PCR על ג'ל אגרוז 1% ב 120 V טריס אצטט-אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (TAE) חוצץ במשך 30 דקות לטהר את המוצר עם ערכת החילוץ ג'ל.
      הערה: אין להשתמש בערכת טיהור המוצר PCR. אפילו כמות זעירה של pTD1-hyPBase plasmid מקטין באופן משמעותי את היעילות של סינתזה במבחנה.
  2. סינתזה במבחנה של hyPBase mRNA באמצעות ערכה מסחרית
    1. להפשיר לחלוטין את הריאגנטים הקפואים, לשמור את האנזים ואת תמיסת 2x NTP /CAP על קרח, ולהשאיר את חיץ תגובה 10x מופשר בטמפרטורת החדר.
    2. להרכיב את התגובה בטמפרטורת החדר על ידי הוספת הרכיבים הבאים: פתרון 2x NTP / CAP: 10 μL; מאגר תגובה 10x: 2 μL; DNA תבנית: 0.1-0.2 מיקרוגרם; תערובת אנזימים: 2 μL; מים ללא נוקלאז עד 20 μL.
    3. מערבבים את הריאגנטים ביסודיות על ידי צנרת עדינה של התערובת למעלה ולמטה ודגרה ב 37 °C (2-4 שעות).
  3. התאוששות של mRNA מסונתז על ידי משקעים ליתיום כלוריד
    1. הוסף 30 μL של פתרון משקעים LiCl, לערבב ביסודיות על ידי הבהוב הצינור, ולאחר מכן לשמור על -20 °C (50 °F) במשך ≥ 30 דקות.
    2. צנטריפוגה ב 4 °C (5 °F) במשך 15 דקות במהירות המרבית, ולהסיר בזהירות את supernatant.
    3. לשטוף את הכדור פעם אחת עם 1 מ"ל של 70% אתנול, מחדש צנטריפוגה, ולהסיר את supernatant בזהירות.
    4. יבש את הכדור בטמפרטורת החדר במשך 1-2 דקות, ולאחר מכן resuspend הכדור עם 20-40 μL של מים ללא נוקלאז.
    5. לדלל 1 μL של פתרון mRNA עם 9 μL של מים ללא נוקלאז. קח 2 μL כדי לקבוע את ריכוז mRNA ולהשתמש 8 μL כדי לבדוק את איכות mRNA על ג'ל אגרוז 1% ב 100 V במאגר TAE טרי במשך 40 דקות.
    6. Aliquot פתרון mRNA ולאחסן קפוא ב -70 °C (70 °F) עד שנה אחת.
      הערה: אין לייבש לחלוטין את גלולה mRNA; זה עלול להיות קשה יותר להמיס אותו במים.

2. מיקרו-ינון

  1. אוסף ביצים
    1. מניחים 12 גלמים זכרים ו-12 גלמים נשיים בקופסה 15 ס"מ על 15 ס"מ על 10 ס"מ. מכסים את הקופסה במגבת נייר. מניחים 10% תמיסת סוכרוז בתיבה להאכלת מבוגרים.
    2. ביום 2 לאחר העיקול, לחשוף את המבוגרים לאור אינטנסיבי לילה.
    3. ביום 3 לאחר העיקול, העבירו את המבוגרים מצעד 2.1.2 למקום חשוך. לאסוף את העוברים בתוך 2 שעות לאחר oviposition.
    4. מוסיפים טיפות מים לחתיכת מגבת נייר עם ביצים טריות שנשמרות בצלחת פטרי על קרח. מעבירים את הביצים בעדינות למגלשת זכוכית עם מברשת עדינה ומיישרים אותן אחת אחת על מגלשת זכוכית. שמור את שקופיות הזכוכית עם הביצים המיושרות על קרח לפני microinjection.
  2. הגדרת מיקרו-ערך
    1. הזריקו תערובת של חלבון פלואורסצנטי ירוק מהונדס (EGFP) המבטא פלסמיד (200 ננוגרם/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ננוגרם/ μL), ומים מזוקקים סטריליים לתוך הביצים,תוך שימוש בלחץ הפיצוי של המיקרו-נג'ר האוטומטי (ראה טבלת החומרים ).
    2. שמור את הביצים המוזרקות ב 27 ± 1 °C (60),60 ± 10% לחות יחסית עד הבקיעה.
    3. האכילו את הזחלים בקעו בדיאטה מלאכותית, והעבירו כל זחל לכוס אחת קטנה בשלב ה-instar המוקדם שלה-3 (באורך של כ-6 מ"מ, וצבע הגוף הופך לשחור).

3. סינון פלואורסצנטיות ומעבר גנטי

  1. לאסוף את הגולם ומניחים ~ 150 גלמים נקבה ~ 150 גולם זכר בכלוב 35 ס"מ x 35 ס"מ x 35 ס"מ. לתלות כמה חתיכות של מגבות נייר (~ 30 ס"מ x 15 ס"מ) בכלוב כדי לאסוף את הביצים.
  2. לאסוף את מגבות הנייר עם ביצים מדי יום, ולשמור את הביצים ב 27 ± 1 °C (60°F), 60 ± 10% לחות יחסית עד הבקיעה.
  3. שמור את זחלי ניאון ב 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות כדי לשתק אותם, ולאחר מכן להעביר אותם על צלחת קרה כקרח.
  4. מסך זחלי ניאון משותקים תחת סטריאופיקום פלואורסצנטי. בחר את יילודים חיוביים EGFP, להעלות אותם לשלב הגועל ב ~ 2 שבועות ב 27 ± 1 °C (50 °F), ולהפריד אותם על ידי סקס על פי הבדלי פנוטיפ בקטעי הבטן הגחון.
    הערה: הגולם הנשי יש פתח איברי מין דמוי חריץ על קטע הבטן השמיני ואת השוליים cephalic של החלקים התשיעי והעשירי מתעקל לכיוון פתח איברי המין. פתיחת איברי המין של הגולם הגברי יש עלייה קלה על קטע הבטן התשיעי.
  5. מניחים את הגולם החיובי EGFP ואת הגולם הפראי של המין השני בזכר: יחס נשי של 1:1 בכלוב. Sib לחצות את המבוגרים ביטוי EGFP לייצר את הדורות הבאים.

4. זיהוי PCR של החדרה מהונדסת

  1. לחלץ DNA גנומי מן הסוג הפראי EGFP חיובי זחלים בודדים באמצעות כל ערכת מיצוי DNA גנומי מסחרי בעקבות הוראות היצרן.
  2. ביצוע תגובת PCR באמצעות ה- DNA הגנומי כתבנית; פריימר קדמי, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' הממוקם באזור האמרגן ie1; פריימר הפוך, 5'- aagcactgcacgegtaggtcag-3' הממוקם באזור EGFP של וקטור הטרנספורמציה.
  3. הגדר כל תגובת PCR (נפח סופי של 40 μL) כדי להכיל 20 μL של תערובת פולימראז, 1.0 μL של DNA גנומי (40 מיקרוגרם / μL), 1.0 μL כל אחד של 10 μM קדימה ופריימרים הפוכים, ו 17 μL של מים ללא נוקלאז. השתמש בהגדרות הבאות: דגירה ראשונית של 95 °C (70 °F) למשך 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 95 °C (70 °F) עבור 20 s, 56 °C (56 °F) עבור 20 s ו 68 °C (70 °F) עבור 40 מעלות צלזיוס.
  4. בדוק את מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 1% ב 120 V במשך 30 דקות.

5. קביעת אתר ההחדרה הטרנסגני

  1. בצעו TAIL-PCR ביעילות גבוהה באמצעות DNA גנומי כתבנית לקביעת אתר האינטגרציה של החדרת טרנסג'נים בחרקים החיוביים ל- EGFP.
    1. בצע את תגובות PCR בעקבות השלבים המתוארים במקום אחר9.
      1. השתמש בשלושה פריימרים, P1: 5'-atcagtgtacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', ו- P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgatcgcgct-3', הספציפיים לווקטור piggyBac, בשלושת הסיבובים של תגובת PCR, בהתאמה.
  2. רצף את מוצרי ה- PCR הסופיים כדי לקבוע את אתר האינטגרציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מבנה לביטוי של מקדם T7 המכיל hyPBase: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: אות פולי (A) נוצר (איור 1A) והוגבר כשבר PCR ~ 2.2 kb כדי לסנתז hyPBase mRNA במבחנה (איור 1B). לאחר מכן, ה- hyPBase mRNA יוצר ונחשף לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. ה- mRNA בגודל הצפוי (כ- 1.1 kb band) זוהה על ג'ל אגרוז 1% (איור 1C).

לאחר מכן הוכן מבנה ביטוי EGFP המבוסס על piggyBac(איור 2A). תערובת של זה plasmid ו hyPBase mRNA, או פתרון PBS, הוזרק לעוברים בתוך 2 שעות לאחר oviposition. בשעה 24 שעות לאחר ההזרקה, אות ארעי של ביטוי EGFP נצפה בעוברים המוזרקים. העוברים שהוזרקו ל-PBS לא הראו אות EGFP (איור 2B),ואילו העוברים שהוזרקו על ידי EGFP ו-hyPBase mRNA הראו פלואורסצנטיות EGFP (איור 2C),מה שמצביע על כך שבניית piggyBac הצליחה. לכן, מקדם hr5ie1 יכול לתפקד במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת.

כ -2,000 ביצים הוזרקו, וכ - 700 מהם התפתחו לגולם. המבוגרים G0 היו עצמיים חצו, וביצים נאספו. זחלי G1 שבקעו מביצים אלה נבדקו לאות EGFP תחת סטרימיקוסקופ פלואורסצנטי. כפי שניתן לראות באיור 3A, הזחלים הטרנסגניים הראו אות EGFP חזק. כדי לבדוק את החדרת קלטת הביטוי EGFP לגנומים של חרקים חיוביים ל- EGFP, קטע המכיל את המקדם ואת שבר EGFP הוגבר באמצעות ה- DNA הגנומי המבודד מהזחלים החיוביים ל- EGFP כתבנית (איור 3B). קטע זה לא זוהה כאשר הדנ"א הגנומי היה מבודד מהזחלים הפראיים כתבנית(איור 3B). על ידי ביצוע יעילות גבוהה TAIL-PCR ורצף של מוצרי PCR, נקבע אתר האינטגרציה של החדרת טרנסג'ן. כפי שניתן לראות באיור 4, אתר שילוב הטרנסג'נים שוכן ב-81אינטרון של הגן דמוי הטווינצ'ין בכרומוזום 26.

Figure 1
איור 1: ייצור של hyPBase mRNA. (A)הקלטת המבטאת את hyPBase המכילה את מקדם T7: פוליהדרין-5'UTR: hyPBase: פוליהדרין-3'UTR: אות פולי (A) נבנה. (B)תבנית ה- DNA של ~ 2.2 kb לסינתזה של hyPBase mRNA הוגברה ממבנה hyPBase. הנתיב השמאלי מראה את סולם 1-kb לרוץ על אותו ג'ל. (C)mRNA hyPBase ~ 1.1 kb היה מסונתז מתבנית ה- DNA המוגברת. הנתיב השמאלי מראה את סולם 1-kb לרוץ על אותו ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ביטוי של EGFP בעוברים מוזרקים. (A)תרשים סכמטי של וקטור piggyBac המשמש במחקר זה. (B)לא זוהה אות EGFP בעוברים שהוזרקו עם PBS 1x. (C)אות EGFP זוהה בעוברים מוזרק עם וקטור piggyBac ו hyPBase mRNA. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: EGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר ו- PBS = תמיסת מלח עם אגירת פוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אפיון של FAW מהונדס. (A) ביטוי EGFP מהונדס אך לא בזחלי FAW מסוג בר. מוטות קנה מידה = 0.5 מ"מ. (B)ניתוח PCR של החדרה גנומית של transgenes. זוג פריימרים המתמקדים באזורי האמרגן וה- EGFP שימשו להגברת שבר ~ 0.5 kb באמצעות ה- DNA הגנומי המבודד מזחלי FAW מהונדסים או פראיים כתבנית. קיצורים: EGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר ו- FAW = תולעת צבא סתיו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: החדרה גנומית של מבנה piggyBac. החדרה גנומית של מבנה piggyBac ב FAW מהונדס נקבע על ידי TAIL-PCR ורצף. לוקליזציה כרומוזום ורצפי DNA גנומי חלקיים מאגפים את הגבולות של מבנה piggyBac מוצגים. קיצורים: FAW = תולעת צבא סתיו ו- TAIL-PCR = PCR אסימטרי תרמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חומר משלים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיעור הנמוך של טרנספוזיציה וקושי בהעברת רכיבים מהונדסים לעוברים טריים מגבילים את ההצלחה של טרנספורמציה נבטים בחרקים רבים שאינם מודל, במיוחד אלה מהסדר, לפידופטרה. כדי להגדיל את קצב הטרנספורמציה של חיידקים, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase הנפוץ ביותר (hyPBase)פותחה 7,10. עד כה, טרנספורמציה חיידקית מוצלחת חרקים lepidopteran מדווח בעיקר במודל תולעת משי חרקים, Bombyx מורי11. עם זאת, ביצוע עבודות טרנסגנזה בחרקים לפידוטרנים אחרים, כולל כמה מזיקים חקלאיים גדולים, עדיין מאתגר.

המגבלות העיקריות והצעדים העיקריים של הקמת קו FAW מהונדס באמצעות פרוטוקול זה הם סינתזה של hyPBase mRNA באיכות גבוהה ואספקת רכיבי טרנספוזיציה piggyBac לעוברים המוקדמים. שני מרכיבי הליבה של מערכת piggyBac המסורתית הם פלסמיד תורם המכיל את המטען שיוכנס לגנום ופלטסמיד עוזר המספק את transposase12. כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, מקדמים פעילים מאוד משמשים plasmid העוזר כדי להניע את הביטוי של transposase13,14. מכיוון שמקדמים אלה מתקבלים בדרך כלל מחרקים לדוגמה, פעילותם בחרקים אחרים עשויה להיות לא גבוהה כמו במינים שמהם זוהה האמרגן. לכן, mRNA transposase יעיל יותר מאשר plasmid העוזר, אשר עשוי לשפר את טרנספורמציה נבטים ברוב החרקים שאינם מודל.

בפרוטוקול זה, hyPBase mRNA הוכן במבחנה על ידי בניית plasmid המכיל את קלטת ה- hyPBase מבטאת (מקדם T7: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: אות פולי (A). מקדם T7 מאפשר סינתזה במבחנה של mRNA באמצעות ערכות סינתזה mRNA זמין מסחרית. הן פוליהדרין-5'UTR והן polyhedrin-3'UTR יכולים לעזור בשיפור התמלול של hyPBase mRNA במבחנה ותרגום של חלבון hyPBase ב vivo. נוכחותו של אות פולי (A) מסייעת לשפר את היציבות של hyPBase mRNA ב vivo15. בנוסף, הזרקת רכיבי piggyBac לתוך העוברים המוקדמים מאוד עם מספר מוגבל של תאים מתחלקים הוא גם קריטי כדי לשפר את הסיכויים של אספקת אבות רכיב מערכת piggyBac של תאים נבטים. אירועי הטרנספוזיציה המתרחשים בתאי הנבט יכולים לעבור בירושה. בפרוטוקול זה, עוברים FAW בני פחות משעתיים נאספו ונשמרו על קרח כדי להאט את התפתחותם לפני ההזרקה. עבור רוב החרקים, איסוף עוברים מוקדם ככל האפשר ומציאת דרך להאט את התפתחותם יכולים גם לעזור בשינוי חיידקים מוצלח.

שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים בטרנסגנזה חרקים מסייע בזיהוי בעלי חיים מהונדסים. בפרוטוקול זה, מקדם IE1, אשר דווח להיות מקדם יעיל בכל מקום חרקים lepidopteran11, נגזר וירוס polyhedrosis גרעיני Multicapsid קליפורניה (AcNPV) התמזג עם משפר hr5 כדי להניע את הביטוי של EGFP. אצל אנשים מהונדסים שבהם EGFP הוכנס לגנום FAW, ניתן היה לצפות באות EGFP בכל השלבים (נתונים שאינם מוצגים). אישור מולקולרי של piggyBac-בתיווך הכנסה בוצע בדרך כלל על ידי כתם דרומי או PCR הפוך ורצף. בפרוטוקול זה, הגברת PCR של שבר במטען מהונדס שימשה כדי לאשר את הכניסה מהונדסת במהירות. בנוסף, שיטת TAIL-PCR מבוססת PCR המבוססת על PCR שימשה לזיהוי אתר האינטגרציה של החדרה מהונדסת9, אשר קל לטפל בהשוואה לשיטת PCR הפוכה בשימוש נרחב. שיטת TAIL-PCR היעילה פותחה לזיהוי אתרי האינטגרציה הטרנסגניים בצמחים. במחקר זה, שיטה זו משמשת בפעם הראשונה חרקים. הפרוטוקול המוצג מספק דרך יעילה ליצירת FAW מהונדס וניתן להחיל אותו גם על חרקים רבים אחרים מדגם ולא מודל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחקר שדווח נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע I/UCRC, המרכז לטכנולוגיות ניהול פרוקי רגליים, תחת Grant No IIP-1821936 ועל ידי שותפים בתעשייה, חקלאות ויוזמת מחקר מזון מענק תחרותי מס ' 2019-67013-29351 והמכון הלאומי למזון וחקלאות, משרד החקלאות האמריקאי (2019-67013-29351 ו- 2353057000).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5" Dental Cotton Rolls PlastCare USA 8542025591 REARING
1 oz Souffle Cup Lids DART PL1N
1 oz Souffle Cups DART P100N REARING
48 oz Plastic Deli Containers Genpack AD48 REARING
Add-on Filter Set (Green) NightSea LLC SFA-BLFS-GR SCREENING
Borosilicate Glass Sutter Instruments BF100-50-10 INJECTION
Borosilicate Glass SUTTER INSTRUMENT BF-100-50-10
Dissecting Scope Nikon SMZ745T SCREENING
Featherweight Forceps BioQuip 4750 REARING
Gutter Guard ThermWell Products VX620 REARING
Inverted Microscope Olympus IX71 INJECTION
Microinjector Narishige IM-300 INJECTION
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000 INJECTION
Microscope Slides VWR 16004-22 INJECTION
NightSea Full System NightSea LLC SFA-RB-DIM SCREENING
Nitrogen Gas AWG/Scott-Gross NI 225 INJECTION
Paper Towels Bounty  43217-45074 REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet Southland Products, Inc N/A [Request Species/Quantity] REARING
Spodoptera frugiperda Eggs Benzon Research, Inc N/A [Request Species/Quantity] REARING
Taq MasterMix polymerase mixture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
  2. Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
  3. Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
  4. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
  5. Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
  6. Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
  7. Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
  8. Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
  9. Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
  10. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  11. Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
  12. Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  13. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
  14. Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
  15. Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).

Tags

Biology גיליון 175 טרנסגנזה piggyBac transposase היפראקטיבי mRNA מיקרו-בייג'ק עוברי Spodoptera frugiperda
<em>piggyBac</em> טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, <em>Spodoptera frugiperda</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, X., Palli, S. R. Hyperactive… More

Chen, X., Palli, S. R. Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda. J. Vis. Exp. (175), e62714, doi:10.3791/62714 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter