Summary
La transformación exitosa de la línea germinal en el gusano cogollero, Spodoptera frugiperda,se logró utilizando ARNm de la transposasa hiperactiva piggyBac.
Abstract
La inserción estable de carga genética en los genomas de insectos utilizando elementos transponibles es una herramienta poderosa para estudios genómicos funcionales y el desarrollo de estrategias genéticas de manejo de plagas. El elemento transponible más utilizado en la transformación de insectos es piggyBac,y la transformación de la línea germinal basada en piggyBacse ha llevado a cabo con éxito en insectos modelo. Sin embargo, todavía es un desafío emplear esta tecnología en insectos no modelo que incluyen plagas agrícolas. Este artículo informa sobre la transformación de la línea germinal de una plaga agrícola global, el gusano cogollero (FAW), Spodoptera frugiperda,utilizando la transponasa hiperactiva piggyBac (hyPBase).
En este trabajo, el ARNm hyPBase fue producido y utilizado en lugar del plásmido ayudante en microinyecciones embrionarias. Este cambio condujo a la generación exitosa de FAW transgénicos. Además, también se describen los métodos de cribado de animales transgénicos, la detección rápida basada en PCR de la inserción de transgenes y la determinación del sitio de integración basada en PCR entrelazada asimétrica térmica (TAIL-PCR). Por lo tanto, este trabajo presenta un protocolo para producir FAW transgénico, que facilitará la transgénesis basada en piggyBacen FAW y otros insectos lepidópteros.
Introduction
El gusano cogollero (FAW), Spodoptera frugiperda,es originario de las regiones tropicales y subtropicales de América. Actualmente, este es un insecto herbívoro devastador en más de 100 países en todo el mundo1. Las larvas de FAW se alimentan de más de 350 plantas huésped, incluidos algunos cultivos alimentarios básicos importantes2. La fuerte capacidad de migración de los adultos FAW contribuye a su reciente y rápida propagación desde las Américas a otros lugares1,2. Como resultado, este insecto ahora está amenazando la seguridad alimentaria a nivel internacional. La aplicación de nuevas tecnologías puede facilitar estudios avanzados en FAW y proporcionar estrategias novedosas para controlar esta plaga.
La transformación de la línea germinal de insectos se ha utilizado para estudiar la función de los genes y generar insectos transgénicos para su uso en el control genético3,4. Entre los diversos métodos utilizados para lograr la transformación genética en insectos, el método basado en elementos piggyBac es el método más utilizado5. Sin embargo, debido a la baja tasa de transposición, sigue siendo difícil llevar a cabo la transgénesis en insectos no modelo. Recientemente, se desarrolló una versión hiperactiva de la transposasa piggyBac (hyPBase)6,7. La transformación de la línea germinal se logró en FAW recientemente8,que es el primer informe que utilizó la hyPBase en insectos lepidópteros. En este informe, se describe información detallada sobre el empleo de ARNm de hyPBase en la generación de FAW transgénicos. El método descrito aquí podría aplicarse para lograr la transformación de otros insectos lepidópteros.
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Protocol
1. Síntesis in vitro de arNm hyPBase
NOTA: La secuencia codificante completa de la secuencia hyPBase se sintetizó e insertó en un vector pTD1-Cas9 (consulte la Tabla de materiales)para producir la construcción pTD1-hyPBase, que contiene un casete que expresa hyPBase, promotor T7: poliedrín-5' UTR: hyPBase: poliedrín-3' UTR: poli (A). La secuencia completa de la construcción pTD1-hyPBase se proporciona en el Material suplementario.
- Preparación de la plantilla para síntesis in vitro
- Realice una reacción de PCR para amplificar el cassette que expresa hyPBase utilizando una imprimación hacia adelante, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', y una imprimación inversa 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerasa de alta fidelidad y plásmido pTD1-hyPBase como plantilla.
NOTA: La reacción de PCR (volumen final de 50 μL) contiene 5,0 μL de tampón de reacción 10x, 4,0 μL de trifosfato de desoxinucleósido de 10 mM (dNTP), 1,0 μL de plásmido (50 μg/μL), 1,0 μL de polimerasa de alta fidelidad, 1,0 μL cada uno de 10 μM de cebadores hacia adelante y hacia atrás, y 33 μL de agua libre de nucleasa. Los ajustes fueron los siguientes: una incubación inicial de 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 60 °C durante 15 s y 68 °C durante 2 min. - Revise el producto de PCR en un gel de agarosa al 1% a 120 V en tampón fresco de ácido tetraacético tris-acetato-etilendiamina (TAE) durante 30 minutos y purifique el producto con el kit de extracción de gel.
NOTA: No utilice el kit de purificación del producto PCR. Incluso una pequeña cantidad del plásmido pTD1-hyPBase disminuye significativamente la eficiencia de la síntesis in vitro.
- Realice una reacción de PCR para amplificar el cassette que expresa hyPBase utilizando una imprimación hacia adelante, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', y una imprimación inversa 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerasa de alta fidelidad y plásmido pTD1-hyPBase como plantilla.
-
Síntesis in vitro de arNm hyPBase utilizando un kit comercial
- Descongele completamente los reactivos congelados, mantenga la enzima y 2 veces la solución NTP / CAP en hielo y deje el tampón de reacción 10x descongelado a temperatura ambiente.
- Montar la reacción a temperatura ambiente añadiendo los siguientes componentes: 2x solución NTP/CAP: 10 μL; 10x Tampón de reacción: 2 μL; ADN de plantilla: 0.1-0.2 μg; Mezcla de enzimas: 2 μL; Agua libre de nucleasas a 20 μL.
- Mezcle bien los reactivos canalizando suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo e incube a 37 °C durante 2-4 h.
- Recuperación de ARNm sintetizado por precipitación de cloruro de litio
- Agregue 30 μL de solución de precipitación de LiCl, mezcle bien moviendo el tubo y luego manténgalo a -20 ° C durante ≥ 30 min.
- Centrifugar a 4 °C durante 15 min a la velocidad máxima, y retirar con cuidado el sobrenadante.
- Lave el pellet una vez con 1 ml de etanol al 70%, vuelva a centrifugar y retire el sobrenadante con cuidado.
- Seque el pellet a temperatura ambiente durante 1-2 min, y luego vuelva a suspender el pellet con 20-40 μL de agua libre de nucleasas.
- Diluir 1 μL de solución de ARNm con 9 μL de agua libre de nucleasas. Tome 2 μL para determinar la concentración de ARNm y use 8 μL para verificar la calidad del ARNm en un gel de agarosa al 1% a 100 V en tampón TAE fresco durante 40 min.
- Alícuota la solución de ARNm y guárdala congelada a -70 °C durante un máximo de un año.
NOTA: No seque completamente el gránulo de ARNm; puede ser más difícil disolverlo en agua.
2. Microinyección
- Colección de huevos
- Coloque 12 pupas macho y 12 pupas hembra en una caja de 15 cm x 15 cm x 10 cm. Cubra la caja con una toalla de papel. Coloque una solución de sacarosa al 10% en la caja para alimentar a los adultos.
- El día 2 después de la eclosión, exponga a los adultos a una luz intensa durante la noche.
- En el día 3 después de la eclosión, transfiera a los adultos del paso 2.1.2 a un lugar oscuro. Recoger los embriones dentro de las 2 h posteriores a la oviposición.
- Agregue gotas de agua al pedazo de una toalla de papel con huevos frescos guardados en una placa de Petri sobre hielo. Transfiera los huevos suavemente a un portaobjetos de vidrio con un cepillo fino y alinearlos uno por uno en un portaobjetos de vidrio. Mantenga los portaobjetos de vidrio con los huevos alineados en hielo antes de la microinyección.
- Configuración de microinyección
- Inyecte una mezcla de un plásmido transgénico que expresa la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) (200 ng / μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, ARNm hyPBase (200 ng / μL) y agua destilada estéril en los huevos, utilizando la presión de compensación del microinyector automatizado (consulte la Tabla de materiales).
- Mantenga los huevos inyectados a 27 ± 1 °C, 60 ± 10% de humedad relativa hasta la eclosión.
- Alimente a las larvas eclosionadas con una dieta artificial y transfiera cada larva a una taza pequeña a principios de la3ª etapa instar (~ 6 mm de longitud, y el color del cuerpo se vuelve negro).
3. Cribado de fluorescencia y cruce genético
- Recoge las pupas y coloca ~150 pupas hembra y ~150 pupas macho en una jaula de 35 cm x 35 cm x 35 cm. Cuelgue varios trozos de toallas de papel (~ 30 cm x 15 cm) en la jaula para recoger los huevos.
- Recoja las toallas de papel con huevos diariamente y mantenga los huevos a 27 ± 1 ° C, 60 ± 10% de humedad relativa hasta la eclosión.
- Mantenga las larvas neonatas a 4 °C durante 5 minutos para inmovilizarlas y luego transfiéralas a una placa helada.
- Examinar las larvas neonoliadas inmovilizadas bajo un estereomicroscopio de fluorescencia. Seleccione los neonatos EGFP positivos, elévelos a la etapa pupal en ~ 2 semanas a 27 ± 1 ° C, y sepárelos por sexo de acuerdo con las diferencias de fenotipo en los segmentos ventrales del abdomen.
NOTA: La pupa hembra tiene una abertura genital en forma de hendidura en el octavo segmento abdominal y los márgenes cefálicos del noveno y décimo segmento que se curvan hacia la abertura genital. La abertura genital de la pupa masculina tiene una ligera elevación en el noveno segmento abdominal. - Coloque las pupas EGFP positivas y las pupas de tipo salvaje del sexo opuesto en una proporción macho:hembra de 1:1 en una jaula. Sib-cruza los adultos que expresan EGFP para producir las siguientes generaciones.
4. Detección por PCR de inserción transgénica
- Extraiga ADN genómico de las larvas individuales de tipo silvestre y EGFP positivo utilizando cualquier kit de extracción de ADN genómico comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Realizar una reacción de PCR utilizando el ADN genómico como plantilla; una cartilla delantera, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' situada en la región promotora ie1; y un cebador inverso, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' situado en la región EGFP del vector de transformación.
- Configure cada reacción de PCR (volumen final de 40 μL) para que contenga 20 μL de la mezcla de polimerasa, 1,0 μL de ADN genómico (40 μg/μL), 1,0 μL cada uno de los cebadores de 10 μM hacia adelante y hacia atrás, y 17 μL de agua libre de nucleasas. Utilice los siguientes ajustes: una incubación inicial de 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos de 95 °C durante 20 s, 56 °C durante 20 s y 68 °C durante 40 s.
- Revise los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 30 min.
5. Determinación del sitio de inserción transgénica
- Realizar TAIL-PCR de alta eficiencia utilizando ADN genómico como plantilla para determinar el sitio de integración de la inserción de transgenes en los insectos EGFP-positivos.
- Realizar las reacciones de PCR siguiendo los pasos descritos en otra parte9.
- Utilice tres cebadores, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', y P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3', que son específicos del vector piggyBac, en las 3 rondas de reacción de PCR, respectivamente.
- Realizar las reacciones de PCR siguiendo los pasos descritos en otra parte9.
- Secuenciar los productos finales de PCR para determinar el sitio de integración.
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Representative Results
Un constructo para la expresión del promotor T7 que contiene hyPBase: poliedrín-5'UTR: hyPBase: poliedrín-3'UTR: se generó una señal poli (A)(Figura 1A)y se amplificó como un fragmento de PCR de ~2,2 kb para sintetizar el ARNm de hyPBase in vitro (Figura 1B). Luego, se produjo el ARNm hyPBase y se sometió a electroforesis en gel de agarosa. El ARNm del tamaño esperado (~1.1 kb banda) se detectó en un gel de agarosa al 1%(Figura 1C).
Luego, se preparó una construcción de expresión EGFP basada en piggyBac(Figura 2A). Una mezcla de este plásmido y arNm de hyPBase, o solución de PBS, se inyectó en embriones dentro de las 2 h posteriores a la oviposición. A las 24 h después de la inyección, se observó una señal transitoria de expresión de EGFP en los embriones inyectados. Los embriones inyectados por PBS no mostraron señal de EGFP (Figura 2B), mientras que el plásmido que expresa EGFP y los embriones inyectados con ARNm de hyPBase mostraron fluorescencia de EGFP (Figura 2C), lo que indica que la construcción de piggyBac fue exitosa. Por lo tanto, el promotor hr5ie1 puede funcionar durante el desarrollo embrionario temprano.
Se inyectaron aproximadamente 2,000 huevos, y ~ 700 de ellos se convirtieron en pupas. Los adultos G0 se cruzaron por sí mismos y se recolectaron huevos. Las larvas G1 nacidas de estos huevos fueron examinadas para detectar la señal EGFP bajo un estereomicroscopio de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 3A,las larvas transgénicas mostraron una fuerte señal de EGFP. Para probar la inserción del cassette de expresión egFP en los genomas de insectos EGFP positivos, se amplificó un fragmento que contenía el promotor y el fragmento EGFP utilizando el ADN genómico aislado de las larvas EGFP positivas como plantilla(Figura 3B). Este fragmento no se detectó cuando se aisló el ADN genómico de las larvas de tipo silvestre como plantilla (Figura 3B). Mediante la realización de TAIL-PCR de alta eficiencia y la secuenciación de los productos de PCR, se determinó el sitio de integración de la inserción del transgén. Como se muestra en la Figura 4,el sitio de integración del transgén se encuentra en el intrón 81st del gen similar a Twinchin en el cromosoma 26.
Figura 1: Producción de arNm hyPBase. (A) Se construyó el casete que expresa hyPBase que contiene el promotor T7: poliedrín-5'UTR: hyPBase: poliedrín-3'UTR: señal poli (A). (B) La plantilla de ADN de ~2,2 kb para sintetizar el ARNm de hyPBase se amplificó a partir de la construcción de hyPBase. El carril izquierdo muestra la escalera de 1 kb en el mismo gel. (C) Se sintetizó un ARNm hyPBase de ~1,1 kb a partir de la plantilla de ADN amplificado. El carril izquierdo muestra la escalera de 1 kb en el mismo gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Expresión de EGFP en embriones inyectados. (A) Diagrama esquemático del vector piggyBac utilizado en este estudio. (B)No se detectó ninguna señal de EGFP en embriones inyectados con 1x PBS. (C) La señal EGFP se detectó en embriones inyectados con el vector piggyBac y el ARNm hyPBase. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: EGFP = proteína fluorescente verde mejorada y PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de la expresión de FAW transgénicos. (A) Expresión de EGFP en larvas de FAW transgénicas pero no en larvas de FAW de tipo silvestre. Barras de escala = 0,5 mm. (B) Análisis por PCR de inserción genómica de los transgenes. Se utilizaron un par de cebadores dirigidos al promotor y a las regiones EGFP para amplificar un fragmento de ~ 0.5 kb utilizando el ADN genómico aislado de larvas FAW transgénicas o de tipo silvestre como plantilla. Abreviaturas: EGFP = proteína fluorescente verde mejorada y FAW = gusano cogollero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Inserción genómica del constructo piggyBac. La inserción genómica del constructo piggyBac en FAW transgénico se determinó mediante TAIL-PCR y secuenciación. Se muestra la localización cromosómica y las secuencias parciales de ADN genómico que flanquean los límites de la construcción piggyBac. Abreviaturas: FAW = Gusano cogollero y TAIL-PCR = PCR termométrica interlazada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La baja tasa de transposición y la dificultad de administrar componentes transgénicos en embriones frescos limitan el éxito de la transformación de la línea germinal en muchos insectos no modelo, especialmente aquellos de orden, Lepidoptera. Para aumentar la tasa de transformación de la línea germinal, se desarrolló una versión hiperactiva de la transposasa piggyBac más utilizada (hyPBase)7,10. Hasta la fecha, la transformación exitosa de la línea germinal en insectos lepidópteros se informa principalmente en el modelo de gusano de seda de insectos, Bombyx mori11. Sin embargo, la realización del trabajo de transgénesis en otros insectos lepidópteros, incluidas algunas de las principales plagas agrícolas, sigue siendo un desafío.
Las principales limitaciones y los pasos clave para establecer una línea FAW transgénica utilizando este protocolo son sintetizar ARNm hyPBase de alta calidad y administrar componentes de transposición de piggyBac en los embriones tempranos. Los dos componentes centrales del sistema tradicional piggyBac son un plásmido donante que contiene la carga que se insertará en el genoma y un plásmido auxiliar que proporciona la transposasa12. Para aumentar la eficiencia de transformación, se utilizan promotores altamente activos en el plásmido ayudante para impulsar la expresión de la transposasa13,14. Como estos promotores generalmente se obtienen de insectos modelo, su actividad en otros insectos puede no ser alta como en la especie a partir de la cual se identificó el promotor. Por lo tanto, el ARNm de transposasa es más efectivo que el plásmido ayudante, lo que puede mejorar la transformación de la línea germinal en la mayoría de los insectos no modelo.
En este protocolo, el ARNm de hyPBase se preparó in vitro mediante la construcción de un plásmido que contenía el casete que expresaba hyPBase (promotor T7: poliedrín-5'UTR: hyPBase: poliedrín-3'UTR: señal poli (A)). El promotor T7 permite la síntesis in vitro de ARNm utilizando kits de síntesis de ARNm disponibles comercialmente. Tanto el poliedrín-5'UTR como el poliedrín-3'UTR podrían ayudar a mejorar la transcripción del ARNm de hyPBase in vitro y la traducción de la proteína hyPBase in vivo. La presencia de la señal poli (A) ayuda a mejorar la estabilidad del ARNm hyPBase in vivo15. Además, la inyección de los componentes de piggyBac en los embriones muy tempranos con un número limitado de células en división también es fundamental para mejorar las posibilidades de entregar progenitores de componentes del sistema piggyBac de células de la línea germinal. Los eventos de transposición que ocurren en las células de la línea germinal podrían ser heredados. En este protocolo, los embriones de FAW de menos de 2 horas de edad fueron recolectados y mantenidos en hielo para ralentizar su desarrollo antes de la inyección. Para la mayoría de los insectos, recolectar embriones lo antes posible y encontrar una manera de ralentizar su desarrollo también podría ayudar a la transformación exitosa de la línea germinal.
El uso de proteínas fluorescentes en la transgénesis de insectos ayuda en la identificación de animales transgénicos. En este protocolo, el promotor IE1, que se ha informado que es un promotor eficiente y ubicuo en insectos lepidópteros11,derivado del gen temprano inmediato del virus de la poliedrosis nuclear multicápside Autographa california (AcNPV), se fusionó con el potenciador hr5 para impulsar la expresión de EGFP. En individuos transgénicos en los que EGFP se insertó en el genoma de FAW, la señal de EGFP se pudo observar en todas las etapas (datos no mostrados). La confirmación molecular de la inserción mediada por piggyBacse realizó generalmente mediante southern blot o PCR inversa y secuenciación. En este protocolo, se utilizó la amplificación por PCR de un fragmento en la carga transgénica para confirmar rápidamente la inserción transgénica. Además, se empleó un método tail-PCR de alta eficiencia basado en PCR para identificar el sitio de integración de la inserción transgénica9,que es fácil de manipular en comparación con el método de PCR inversa ampliamente utilizado. El método tail-PCR de alta eficiencia se desarrolló para identificar los sitios de integración transgénica en las plantas. En este estudio, este método se utiliza por primera vez en insectos. El protocolo presentado proporciona una forma efectiva de generar FAW transgénicos y también podría aplicarse a muchos otros insectos modelo y no modelo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
La investigación reportada es apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias I / UCRC, el Centro de Tecnologías de Manejo de Artrópodos, bajo la Subvención No IIP-1821936 y por socios de la industria, la Subvención Competitiva de la Iniciativa de Investigación Agrícola y Alimentaria No. 2019-67013-29351 y el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura, departamento de agricultura de los Estados Unidos (2019-67013-29351 y 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
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