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Biology

अतिसक्रिय पिग्गीबेक ट्रांसपोसेस-मध्यस्थता जर्बर्मिन में फॉल आर्कीवर्म, स्पोडोप्टेरा मितव्ययीपरदा

Published: September 23, 2021 doi: 10.3791/62714
Automatic Translation
1, 1
1Department of Entomology, College of Agriculture, Food and Environment, University of Kentucky

Summary

फॉल आर्कीवर्म, स्पोडोप्टेरा फ्रुगिपर्डामें सफल जर्मलाइन परिवर्तन, अतिसक्रिय पिग्गीबेक ट्रांसपोसेस के एमआरएनए का उपयोग करके हासिल किया गया था।

Abstract

ट्रांसपोसेबल तत्वों का उपयोग करके कीट जीनोम में आनुवंशिक कार्गो का स्थिर सम्मिलन कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययनों और आनुवंशिक कीट प्रबंधन रणनीतियों के विकास के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। कीट परिवर्तन में सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला ट्रांसपॉसिबल तत्व पिग्गीबाकहै, और पिग्गीबेकआधारित जर्मलाइन परिवर्तन मॉडल कीड़ों में सफलतापूर्वक आयोजित किया गया है। हालांकि, इस तकनीक को गैर-मॉडल कीड़ों में नियोजित करना अभी भी चुनौतीपूर्ण है जिसमें कृषि कीट शामिल हैं। यह पेपर हाइपरएक्टिव पिग्गीबेक ट्रांसपोसेस (हाइपबेस) का उपयोग करके वैश्विक कृषि कीट, फॉल आर्कीवर्म (एफएआरओ), स्पोडोप्टेरा फ्रुगिपेर्डाके जर्मलाइन परिवर्तन पर रिपोर्ट करता है।

इस काम में भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन में हेल्पर प्लाज्मिड के स्थान पर हाइपबेस एमआरएनए का उत्पादन और इस्तेमाल किया गया। इस बदलाव के कारण ट्रांसजेनिक एफएडब्ल्यू की सफल पीढ़ी हुई । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक जानवरों की स्क्रीनिंग के तरीके, ट्रांसजीन प्रविष्टि का पीसीआर आधारित रैपिड डिटेक्शन, और थर्मल असममित इंटरलैपर्ट (टेल-पीसीआर) -एकीकरण स्थल के आधारित निर्धारण का भी वर्णन किया गया है। इस प्रकार, यह पेपर ट्रांसजेनिक एफएडब्ल्यू का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो एफएडब्ल्यू और अन्य लेपिडोप्टरन कीड़ों में पिग्गीबाक-आधारितट्रांसजेनेसिस की सुविधा प्रदान करेगा।

Introduction

फॉल आर्कीवर्म (एफएडब्ल्यू), स्पोडोप्टेरा मितव्ययीपरडा,अमेरिका के उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय क्षेत्रों के मूल निवासी हैं। वर्तमान में, यहदुनियाभर में 100 से अधिक देशों में एक विनाशकारी कीट शाकाहारी है। FAW लार्वा 350 से अधिक मेजबान पौधों पर फ़ीड, कुछ महत्वपूर्ण मुख्य खाद्य फसलोंसहित 2. एफएडब्ल्यू वयस्कों की मजबूत प्रवास क्षमता अमेरिका से अन्य स्थानों पर हाल ही में तेजी से फैलने में योगदान देती है1,2. नतीजतन, यह कीट अब अंतरराष्ट्रीय स्तर पर खाद्य सुरक्षा को खतरा पैदा कर रहा है। नई प्रौद्योगिकियों को लागू करने से FAW में उन्नत अध्ययन की सुविधा हो सकती है और इस कीट का प्रबंधन करने के लिए उपन्यास रणनीतियां प्रदान की जा सकती हैं।

कीट रोगाणु परिवर्तन का उपयोग जीन कार्य का अध्ययन करने और आनुवंशिक नियंत्रण में उपयोग के लिए ट्रांसजेनिक कीट उत्पन्न करने के लिए किया गया है3, 4,4. कीड़ों में आनुवंशिक परिवर्तन प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न तरीकों में, पिग्गीबाक तत्व-आधारित विधि सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधि5है। हालांकि, पक्षांतरण की कम दर के कारण, गैर-मॉडल कीड़ों में ट्रांसजेनेसिस का संचालन करना अभी भी चुनौतीपूर्ण है। हाल ही में, पिग्गीबेक ट्रांसपोसेस (हाइपबेस) का एक अतिसक्रिय संस्करण6,7विकसित किया गया था। हाल ही में8एफएडब्ल्यू में जर्मलाइन परिवर्तन हासिल किया गया था, जो पहली रिपोर्ट है जिसने लेपिडोप्टरन कीड़ों में हाइपबेस का उपयोग किया था। इस रिपोर्ट में ट्रांसजेनिक एफएडब्ल्यू पैदा करने में हाइपबेस एमआरएनए को नियोजित करने के बारे में विस्तृत जानकारी बताई गई है । यहां वर्णित विधि को अन्य लेपिडोप्टरन कीड़ों के परिवर्तन को प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. हाइपबेस एमएनए के इन विट्रो संश्लेषण

नोट: हाइपबेस अनुक्रम का पूर्ण कोडिंग अनुक्रम संश्लेषित किया गया था और पीटीडी1-Cas9 वेक्टर में डाला गया था (सामग्री की तालिकादेखें) pTD1-hyPBase निर्माण का उत्पादन करने के लिए, जिसमें एक हाइपबेस-एक्सप्रेसिंग कैसेट, T7 प्रमोटर: पॉलीहेड्रिन-5 ' यूटीआर: हाइपबेस: पॉलीड्रिन-3 ' यूटीआर: पॉली (ए) का उत्पादन करने के लिए । पीटीडी1-हाइपबेस निर्माण का पूरा अनुक्रम अनुपूरक सामग्रीमें प्रदान किया गया है।

  1. इन विट्रो संश्लेषण के लिए टेम्पलेट की तैयारी
    1. एक फॉरवर्ड प्राइमर, 5'-atgcggtgtgaatacccagatgg-3', और एक रिवर्स प्राइमर 5'-tagaggccccaaggtagttgctag-3', उच्च निष्ठा बहुलक, और pTD1-hyPBase plasmid का उपयोग कर hyPBase व्यक्त कैसेट बढ़ाना करने के लिए एक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन करें ।
      नोट: पीसीआर रिएक्शन (50 माइक्रोन की अंतिम मात्रा) में 10x रिएक्शन बफर का 5.0 माइक्रोन, 10 एमएम डीऑक्सी न्यूक्लियोसाइड ट्राइफोस्फेट (डीएनटीपी), प्लाज्मिड का 1.0 माइक्रोन (50 माइक्रोन/एसएल), हाई-फिडेलिटी पॉलीमरेस का 1.0 माइक्रोन, माइक्रोन 1.0 μL 10 μM आगे और रिवर्स प्राइमर के प्रत्येक, और नाभिक मुक्त पानी के 33 μL. सेटिंग्स इस प्रकार थे: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस की शुरुआती इनक्यूबेशन, इसके बाद 10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 15 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट के लिए 68 डिग्री सेल्सियस।
    2. ताजा ट्रिज़-एसीटेट-एथिलेंडियामाइन टेट्राएकेटिक एसिड (टीएई) बफर में 120 वी पर 1% एगरल्ड जेल पर पीसीआर उत्पाद को 30 मिनट के लिए देखें और जेल निष्कर्षण किट के साथ उत्पाद को शुद्ध करें।
      नोट: पीसीआर उत्पाद शुद्धि किट का उपयोग न करें। यहां तक कि pTD1-hyPBase प्लाज्मिड की एक ट्रेस राशि इन विट्रो संश्लेषण की दक्षता को काफी कम कर देती है।
  2. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर हाइपबेस mRNA के विट्रो संश्लेषण में
    1. जमे हुए अभिकर्मकों को पूरी तरह से पिघला दें, एंजाइम और 2x एनटीपी/कैप समाधान को बर्फ पर रखें, और कमरे के तापमान पर गल 10x रिएक्शन बफर छोड़ दें।
    2. निम्नलिखित घटकों को जोड़कर कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया को इकट्ठा करें: 2x NTP/CAP समाधान: 10 μL; 10x रिएक्शन बफर: 2 माइक्रोन; टेम्पलेट डीएनए: 0.1-0.2 माइक्रोन; एंजाइम मिश्रण: 2 μL; नाभिक मुक्त पानी 20 माइक्रोन करने के लिए।
    3. रिएजेंट्स को धीरे-धीरे मिश्रण को ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं और 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. लिथियम क्लोराइड वर्षा द्वारा संश्लेषित mRNA की वसूली
    1. 30 μL LiCl वर्षा समाधान जोड़ें, ट्यूब को फ्लिक करके अच्छी तरह से मिलाएं, और फिर ≥ 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. अधिकतम गति से 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें, और ध्यान से सुपरनेट को हटा दें।
    3. 70% इथेनॉल, री-सेंट्रलाइज के 1 मिलील के साथ एक बार गोली धोएं, और सुपरनेटेंट को ध्यान से हटा दें।
    4. 1-2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गोली सूखी, और फिर नाभिक मुक्त पानी के 20-40 μL के साथ गोली को फिर से खर्च करें ।
    5. नाभिक मुक्त पानी के 9 माइक्रोन के साथ mRNA समाधान के 1 μL पतला। एमआरएनए एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 2 माइक्रोन लें और 40 मिनट के लिए ताजा टीएई बफर में 100 वी पर 1% एगर उठे हुए जेल पर एमआरएनए की गुणवत्ता की जांच करने के लिए 8 माइक्रोन का उपयोग करें।
    6. एक वर्ष तक -70 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए एमआरएनए समाधान और स्टोर को अलीकोट करें।
      नोट: पूरी तरह से mRNA गोली सूखी मत करो; इसे पानी में घोलना कठिन हो सकता है।

2. माइक्रोइंजेक्शन

  1. अंडा संग्रह
    1. 15 सेमी x 15 सेमी x 10 सेमी बॉक्स में 12 पुरुष प्यूप और 12 मादा प्यूप रखें। बॉक्स को कागज के तौलिया से ढक दें। वयस्कों को खिलाने के लिए बॉक्स में 10% सुक्रोज समाधान रखें।
    2. दिन 2 के बाद eclosion, रात भर तीव्र प्रकाश के लिए वयस्कों का पर्दाफाश।
    3. 3 पोस्ट eclosion पर, वयस्कों को चरण 2.1.2 से एक अंधेरे जगह पर स्थानांतरित करें। अंडाशय के बाद 2 घंटे के भीतर भ्रूण ले लीजिए।
    4. बर्फ पर पेट्री डिश में रखे ताजा अंडे के साथ एक कागज तौलिया के टुकड़े में पानी की बूंदें जोड़ें । अंडे को धीरे-धीरे एक महीन ब्रश के साथ ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें और उन्हें ग्लास स्लाइड पर एक-एक करके संरेखित करें। माइक्रोइंजेक्शन से पहले बर्फ पर गठबंधन अंडे के साथ ग्लास स्लाइड रखें।
  2. माइक्रोइंजेक्शन सेटअप
    1. एक ट्रांसजेनिक संवर्धित हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) का मिश्रण इंजेक्ट करें-प्लाज्मिड (२०० एनजी/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (२०० एनजी/μL), और अंडे में बाँझ आसुत पानी, स्वचालित माइक्रोइनक्टर के मुआवजे के दबाव का उपयोग कर (सामग्री की मेजदेखें) व्यक्त ।
    2. इंजेक्शन अंडे को 27 ± 1 डिग्री सेल्सियस, 60 ± 10% सापेक्ष आर्द्रता को हैचिंग तक रखें।
    3. एक कृत्रिम आहार पर रची लार्वा को खिलाएं, और प्रत्येक लार्वा को शुरुआती 3इंडस्टार चरण (~ 6 मिमी लंबाई में, और शरीर-रंग काला हो जाता है) पर एक छोटे कप में स्थानांतरित करें।

3. फ्लोरेसेंस स्क्रीनिंग और जेनेटिक क्रॉसिंग

  1. पिल्ला ले लीजिए और एक 35 सेमी x 35 सेमी x 35 सेमी पिंजरे में ~ 150 महिला पिल्ले और ~ 150 पुरुष पिल्ले रखें। अंडे इकट्ठा करने के लिए पिंजरे में कागज तौलिए (~ 30 सेमी x 15 सेमी) के कई टुकड़े लटकाएं।
  2. रोजाना अंडे के साथ पेपर तौलिए लीजिए, और अंडे को 1 डिग्री सेल्सियस ± 27 पर रखें, 60 ± 10% सापेक्ष आर्द्रता को हैचिंग तक रखें।
  3. नवजात लार्वा को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि उन्हें स्थिर किया जा सके, और फिर उन्हें बर्फ-ठंडी प्लेट पर स्थानांतरित करें।
  4. फ्लोरेसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत स्थिर नवजात लार्वा को स्क्रीन करें। ईजीएफपी-पॉजिटिव नवजातों का चयन करें, उन्हें ~2 सप्ताह में 27 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर प्यूपल चरण में उठाएं, और वेंट्रल पेट खंडों में फेनोटाइप मतभेदों के अनुसार उन्हें सेक्स से अलग करें।
    नोट: मादा पिल्ला में आठवें पेट के खंड पर एक भट्ठा की तरह जननांग खोलने और जननांग खोलने की ओर घुमावदार नौवें और दसवें खंडों के सेफेलिक मार्जिन है । नर प्यूपा के जननांग खोलने से नौवें पेट के खंड पर थोड़ी ऊंचाई होती है।
  5. एक पुरुष में EGFP-सकारात्मक पिल्ला और विपरीत लिंग के जंगली प्रकार के पिल्ले रखें: एक पिंजरे में 1:1 की महिला अनुपात। एसआईबी-निम्नलिखित पीढ़ियों का उत्पादन करने के लिए EGFP-व्यक्त वयस्कों को पार करें।

4. ट्रांसजेनिक प्रविष्टि की पीसीआर का पता लगाना

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए किसी भी वाणिज्यिक जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके जंगली प्रकार और ईजीएफपी-सकारात्मक व्यक्तिगत लार्वा से जीनोमिक डीएनए निकालें।
  2. एक टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर एक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन; ie1 प्रमोटर क्षेत्र में स्थित एक फॉरवर्ड प्राइमर, 5'-एसीजीटीसीजीटीसीटीजीटीटीसीटीजीटी-3;; और एक रिवर्स प्राइमर, 5'-aagcactgcacgccggtcag-3' परिवर्तन वेक्टर के EGFP क्षेत्र में स्थित है ।
  3. प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया (40 माइक्रोन की अंतिम मात्रा) को पॉलीमरेज मिश्रण के 20 माइक्रोन, जीनोमिक डीएनए के 1.0 माइक्रोन (40 माइक्रोन/माइक्रोन), 1.0 माइक्रोन प्रत्येक 10 माइक्रोन फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर, और नाभिक मुक्त पानी के 17 माइक्रोन शामिल करने के लिए सेट करें। निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस का प्रारंभिक इनक्यूबेशन, इसके बाद 20 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 20 एस के लिए 56 डिग्री सेल्सियस और 40 एस सेटिंग्स के लिए 68 डिग्री सेल्सियस।
  4. 30 मिनट के लिए 120 वी पर 1% एगर उठे जेल पर पीसीआर उत्पादों की जांच करें।

5. ट्रांसजेनिक प्रविष्टि स्थल का निर्धारण

  1. ईजीएफपी-पॉजिटिव कीड़ों में ट्रांसजीन प्रविष्टि के एकीकरण स्थल को निर्धारित करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके उच्च दक्षता वाली पूंछ-पीसीआर करें।
    1. 9और बताए गए चरणों के बाद पीसीआर प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करें ।
      1. तीन प्राइमर, पी 1 का उपयोग करें: 5'-atcagtgacacttaccccgcattgacacgcccc-3', P2: 5'-tcacggggctccaccgccgct-3', जो क्रमशः पीसीआर प्रतिक्रिया के 3 दौर में पिग्गीबाक वेक्टर के लिए विशिष्ट हैं।
  2. एकीकरण साइट निर्धारित करने के लिए अंतिम पीसीआर उत्पादों को अनुक्रम करें।

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Representative Results

हाइपबेस युक्त T7 प्रमोटर की अभिव्यक्ति के लिए एक निर्माण: पॉलीहेड्रिन-5'यूटीआर: हाइपबेस: पॉलीहेड्रिन-3'यूटीआर: पॉली (ए) सिग्नल उत्पन्न किया गया था(चित्रा 1 ए)और वाय्रो (चित्रा 1B)में हाइपीबेस एमआरएनए को संश्लेषित करने के लिए ~ 2.2 केबी पीसीआर टुकड़ा के रूप में परिलक्षित होता है। फिर, हाइपबेस एमआरएनए का उत्पादन किया गया और एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के अधीन किया गया। अपेक्षित आकार (~ 1.1 केबी बैंड) के एमआरएनए को 1% एगर उठे जेल(चित्रा 1C)पर पाया गया था।

फिर, एक पिग्गीबाक आधारित ईजीएफपीअभिव्यक्ति निर्माण(चित्रा 2 ए)तैयार किया गया था। इस प्लाज्मिड और हाइपबेस एमआरएनए, या पीबीएस समाधान का मिश्रण, अंडाशय के बाद 2 घंटे के भीतर भ्रूण में इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन के बाद 24 घंटे में, इंजेक्शन भ्रूण में ईजीएफपी अभिव्यक्ति का क्षणिक संकेत देखा गया था। पीबीएस-इंजेक्ट किए गए भ्रूणों ने ईजीएफपी सिग्नल(चित्रा 2B) नहीं दिखाया,जबकि ईजीएफपी-एक्सप्रेसिंग प्लाज्मिड और हाइपबेस एमएनए-इंजेक्शन भ्रूण ने ईजीएफपी फ्लोरेसेंस(चित्रा 2C) दिखाया,जो यह दर्शाता है कि पिग्गीबाक निर्माण सफल रहा । इस प्रकार, hr5ie1 प्रमोटर प्रारंभिक भ्रूण विकास के दौरान कार्य कर सकते हैं।

लगभग 2,000 अंडे इंजेक्ट किए गए थे, और उनमें से ~ 700 प्यूप में विकसित हुए थे। G0 वयस्कों स्वयं को पार कर रहे थे, और अंडे एकत्र किए गए । इन अंडों से रची गई जी 1 लार्वा की जांच फ्लोरोसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत ईजीएफपी सिग्नल के लिए की गई थी । जैसा कि चित्र 3 एमें दिखाया गया है, ट्रांसजेनिक लार्वा ने एक मजबूत ईजीएफपी संकेत दिखाया। ईजीएफपी-पॉजिटिव कीड़ों के जीनोम में ईजीएफपी अभिव्यक्ति कैसेट के सम्मिलन का परीक्षण करने के लिए, प्रमोटर और ईजीएफपी टुकड़े वाले एक टुकड़े को एक टेम्पलेट(चित्रा 3B)के रूप में ईजीएफपी-सकारात्मक लार्वा से अलग जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके परिलक्षित किया गया था। इस टुकड़े का पता तब नहीं चला जब जीनोमिक डीएनए को टेम्पलेट(चित्रा 3B)के रूप में जंगली प्रकार के लार्वा से अलग किया गया था। उच्च दक्षता वाली पूंछ-पीसीआर और पीसीआर उत्पादों के अनुक्रमण का आयोजन करके, ट्रांसजीन प्रविष्टि की एकीकरण साइट निर्धारित की गई थी। जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है, ट्रांसजीन एकीकरण साइट गुणसूत्र 26 में ट्विनचिन जैसे जीन के 81सेंट इंट्रॉन में निहित है।

Figure 1
चित्रा 1:हाइपबेस एमआरएनए का उत्पादन। (ए)हाइपबेस-एक्सप्रेसिंग कैसेट जिसमें टी 7 प्रमोटर: पॉलीहेड्रिन-5'यूटीआर: हाइपबेस: पॉलीहेड्रिन-3'यूटीआर: पॉली (ए) सिग्नल का निर्माण किया गया था। (ख)हाइपबेस एमआरएनए को संश्लेषित करने के लिए ~ 2.2 केबी डीएनए टेम्पलेट को हाइपबेस निर्माण से परिलक्षित किया गया था। बाईं लेन एक ही जेल पर 1-kb सीढ़ी चलाने से पता चलता है । (ग)एक ~ 1.1 केबी हाइपबेस एमआरएनए को प्रवर्धित डीएनए टेम्पलेट से संश्लेषित किया गया था। बाईं लेन एक ही जेल पर 1-kb सीढ़ी चलाने से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:इंजेक्शन भ्रूण में ईजीएफपी की अभिव्यक्ति। (A)इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पिग्गीबाक वेक्टर का योजनाबद्ध आरेख। (ख)1x पीबीएस के साथ इंजेक्ट किए गए भ्रूणों में कोई ईजीएफपी सिग्नल नहीं पाया गया । (C) पिग्गीबाक वेक्टर और हाइपबेस एमआरएनए के साथ इंजेक्शन वाले भ्रूणों में ईजीएफपी सिग्नल का पता चला । स्केल बार = 50 माइक्रोन। संक्षिप्त नाम: ईजीएफपी = बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन और पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:ट्रांसजेनिक एफएडब्ल्यू का लक्षण वर्णन। (ए)ट्रांसजेनिक में ईजीएफपी अभिव्यक्ति लेकिन जंगली प्रकार के एफएडब्ल्यू लार्वा में नहीं। स्केल बार = 0.5मिमी ट्रांसजीन के जीनोमिक सम्मिलन का पीसीआर विश्लेषण। प्रमोटर और ईजीएफपी क्षेत्रों को लक्षित करने वाले प्राइमर की एक जोड़ी का उपयोग टेम्पलेट के रूप में ट्रांसजेनिक या जंगली प्रकार के एफएडब्ल्यू लार्वा से अलग जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके ~ 0.5 केबी टुकड़े को बढ़ाने के लिए किया गया था। संक्षिप्त नाम: EGFP = बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन और FAW = पतन आर्कीवर्म । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: पिग्गीबाक निर्माण का जीनोमिक सम्मिलन। ट्रांसजेनिक एफएडब्ल्यू में पिग्गीबाक निर्माण का जीनोमिक प्रविष्टि पूंछ-पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया गया था। वर्णिका स्थानीयकरण और आंशिक जीनोमिक डीएनए दृश्यों को पिग्गीबाक निर्माण की सीमाओं को फ्लैंक करते हुए दिखाया गया है। संक्षिप्त: FAW = पतन आर्कीवर्म और पूंछ-पीसीआर = थर्मल असममित इंटरलैस्ड पीसीआर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ट्रांसजेनिक घटकों को ताजा भ्रूण में पहुंचाने की कम दर और ट्रांसजेनिक घटकों को वितरित करने में कठिनाई कई गैर-मॉडल कीड़ों में जर्मलाइन परिवर्तन की सफलता को सीमित करती है, विशेष रूप से आदेश से, लेपिडोप्टेरा। जर्मलाइन परिवर्तन दर को बढ़ाने के लिए, सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले पिग्गीबेक ट्रांसपोसेस (हाइपबेस) का एक अतिसक्रिय संस्करण7,10विकसित किया गया था। आज तक, लेपिडोप्टरन कीड़ों में सफल जर्मलाइन परिवर्तन मुख्य रूप से मॉडल कीट रेशम कीट, बॉम्बिक्स मोरी11में सूचित किया गया है। हालांकि, कुछ प्रमुख कृषि कीटों सहित अन्य लेपिडोप्टरन कीड़ों में ट्रांसजेनेसिस का काम करना अभी भी चुनौतीपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके ट्रांसजेनिक एफएडब्ल्यू लाइन स्थापित करने की प्रमुख सीमाएं और प्रमुख कदम उच्च गुणवत्ता वाले हाइपबेस एमआरएनए को संश्लेषित कर रहे हैं और जल्दी भ्रूण में पिग्गीबेक पक्षांतरण घटकों को वितरित कर रहे हैं। पारंपरिक पिग्गीबाक प्रणाली के दो मुख्य घटक एक दाता प्लाज्मिड हैं जिनमें कार्गो को जीनोम में डाला जाता है और एक सहायक प्लाज्मिड ट्रांसपोसे12प्रदान करता है। परिवर्तन दक्षता बढ़ाने के लिए, अत्यधिक सक्रिय प्रमोटरों का उपयोग सहायक प्लाज्मिड में ट्रांसपोसे13, 14की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए कियाजाताहै। चूंकि ये प्रमोटर आमतौर पर मॉडल कीड़ों से प्राप्त होते हैं, अन्य कीड़ों में उनकी गतिविधि उन प्रजातियों के रूप में अधिक नहीं हो सकती है जहां से प्रमोटर की पहचान की गई थी। इस प्रकार, ट्रांसपोसेस एमआरएनए हेल्पर प्लाज्मिड की तुलना में अधिक प्रभावी है, जो अधिकांश गैर-मॉडल कीड़ों में जर्मलाइन परिवर्तन में सुधार कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हाइपबेस एमआरएनए को एक प्लाज्मिड का निर्माण करके विट्रो में तैयार किया गया था जिसमें हाइपबेस-एक्सप्रेसिंग कैसेट (T7 प्रमोटर: पॉलीहेड्रिन-5'यूटीआर: हाइपबेस: पॉलीहेड्रिन-3'यूटीआर: पॉली (ए) सिग्नल) शामिल है। T7 प्रमोटर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एमआरएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके एमआरएनए के विट्रो संश्लेषण की अनुमति देता है। पॉलीहेड्रिन-5'यूटीआर और पॉलीहेड्रिन-3'यूटीआर दोनों ही विट्रो में हाइपबेस एमआरएनए के ट्रांसक्रिप्शन और वीवो में हाइपबेस प्रोटीन के अनुवाद में सुधार करने में मदद कर सकतेहैं। पॉली (ए) सिग्नल की उपस्थिति वीवो15में हाइपबेस एमआरएनए की स्थिरता को बढ़ाने में मदद करती है। इसके अतिरिक्त, पिग्गीबाक घटकों को सीमित संख्या में विभाजित कोशिकाओं के साथ बहुत जल्दी भ्रूण में इंजेक्शन भी जर्बैक कोशिकाओं के पिग्गीबाक सिस्टम घटक जनक देने की संभावना में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है। जर्मलाइन कोशिकाओं में होने वाली पक्षांतरण घटनाओं को विरासत में मिला जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, FAW भ्रूण से कम 2 घंटे पुराने एकत्र किए गए और इंजेक्शन से पहले अपने विकास को धीमा करने के लिए बर्फ पर रखा गया । अधिकांश कीड़ों के लिए, जितनी जल्दी हो सके भ्रूण एकत्र करना और उनके विकास को धीमा करने का तरीका ढूंढना सफल जर्मलाइन परिवर्तन में भी मदद कर सकता है।

कीट ट्रांसजेनेसिस में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग ट्रांसजेनिक जानवरों की पहचान में मदद करता है। इस प्रोटोकॉल में, आईई1 प्रमोटर, जिसे लेपिडोपटेरन कीड़े11में एक कुशल और सर्वव्यापी प्रमोटर बताया गया है, जो ऑटोग्राफा कैलिफोर्निया मल्टीकैप्सिड न्यूक्लियर पॉलीहेडोसिस वायरस (एसीएनपीवी) से तत्काल प्रारंभिक जीन से प्राप्त हुआ था, को ईजीएफपी की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए hr5 बढ़ाने के साथ जोड़ा गया था। ट्रांसजेनिक व्यक्तियों में, जिनमें ईजीएफपी को एफएओई जीनोम में डाला गया था, ईजीएफपी सिग्नल सभी चरणों में देखा जा सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। पिग्गीबाक-मध्यस्थता प्रविष्टि की आणविक पुष्टि आमतौर पर दक्षिणी दाग या व्युत्क्रम पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा की जाती थी। इस प्रोटोकॉल में ट्रांसजेनिक कार्गो में एक टुकड़े के पीसीआर प्रवर्धन का इस्तेमाल ट्रांसजेनिक प्रविष्टि की पुष्टि के लिए तेजी से किया गया था । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक प्रविष्टि 9 के एकीकरण स्थल की पहचान करने के लिए पीसीआर आधारित उच्च दक्षता वाली पूंछ-पीसीआर विधिको नियोजितकिया गया था, जो व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले व्युत्क्रम पीसीआर विधि की तुलना में हेरफेर करना आसान है। पौधों में ट्रांसजेनिक एकीकरण स्थलों की पहचान करने के लिए उच्च दक्षता वाली पूंछ-पीसीआर विधि विकसित की गई थी। इस अध्ययन में, इस विधि का उपयोग पहली बार कीड़ों में किया जाता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक एफएडब्ल्यू उत्पन्न करने का एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है और इसे कई अन्य मॉडल और गैर-मॉडल कीड़ों पर भी लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

रिपोर्ट किए गए शोध को नेशनल साइंस फाउंडेशन I/UCRC द्वारा समर्थित किया गया है, आर्थ्रोपोड मैनेजमेंट टेक्नोलॉजीज के लिए केंद्र, अनुदान संख्या IIP-1821936 के तहत और उद्योग भागीदारों, कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रतिस्पर्धी अनुदान संख्या 2019-67013-29351 और राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान, अमेरिकी कृषि विभाग (2019-67013-29351 और 2353057000) द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5" Dental Cotton Rolls PlastCare USA 8542025591 REARING
1 oz Souffle Cup Lids DART PL1N
1 oz Souffle Cups DART P100N REARING
48 oz Plastic Deli Containers Genpack AD48 REARING
Add-on Filter Set (Green) NightSea LLC SFA-BLFS-GR SCREENING
Borosilicate Glass Sutter Instruments BF100-50-10 INJECTION
Borosilicate Glass SUTTER INSTRUMENT BF-100-50-10
Dissecting Scope Nikon SMZ745T SCREENING
Featherweight Forceps BioQuip 4750 REARING
Gutter Guard ThermWell Products VX620 REARING
Inverted Microscope Olympus IX71 INJECTION
Microinjector Narishige IM-300 INJECTION
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000 INJECTION
Microscope Slides VWR 16004-22 INJECTION
NightSea Full System NightSea LLC SFA-RB-DIM SCREENING
Nitrogen Gas AWG/Scott-Gross NI 225 INJECTION
Paper Towels Bounty  43217-45074 REARING
Spodoptera frugiperda Artificial Diet Southland Products, Inc N/A [Request Species/Quantity] REARING
Spodoptera frugiperda Eggs Benzon Research, Inc N/A [Request Species/Quantity] REARING
Taq MasterMix polymerase mixture

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References

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जीव विज्ञान अंक 175 ट्रांसजेनेसिस अतिसक्रिय पिग्गीबेक ट्रांसपोसेस एमआरएनए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन स्पोडोप्टेरा फ्रुगिपेरा
अतिसक्रिय <em>पिग्गीबेक</em> ट्रांसपोसेस-मध्यस्थता जर्बर्मिन में फॉल आर्कीवर्म, <em>स्पोडोप्टेरा मितव्ययीपरदा</em>
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Chen, X., Palli, S. R. Hyperactive… More

Chen, X., Palli, S. R. Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda. J. Vis. Exp. (175), e62714, doi:10.3791/62714 (2021).

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