Summary
秋粘虫 Spodoptera frugiperda的种系转化是使用过度活跃的 piggyBac 转座酶的mRNA实现的。
Abstract
使用转座元件将遗传货物稳定地插入昆虫基因组是功能基因组研究和开发遗传害虫管理策略的强大工具。昆虫转化中最常用的转座元素是 piggyBac，而基于 piggyBac的种系转化已经在模型昆虫中成功进行。然而，在包括农业害虫在内的非模型昆虫中采用这项技术仍然具有挑战性。本文报道了全球农业害虫秋粘虫 （FAW），Spodoptera frugiperda的种系转化，使用过度活跃的 piggyBac 转座酶（hyPBase）。
在这项工作中，生产了hyPBase mRNA，并将其用于胚胎显微注射中的辅助质粒。这一变化导致了转基因FAW的成功诞生。此外，还描述了筛选转基因动物的方法，基于PCR的转基因插入快速检测以及基于热不对称隔行扫描PCR（TAIL-PCR）的整合位点测定。因此，本文提出了一种产生转基因FAW的方案，这将促进FAW和其他鳞翅目昆虫中基于 piggyBac的转基因。
Introduction
秋粘虫（FAW），Spodoptera frugiperda，原产于美国的热带和亚热带地区。目前，这是全球100多个国家的毁灭性昆虫食草动物1。一汽幼虫以350多种寄主植物为食，包括一些重要的主食作物2。一汽成人强大的迁徙能力使其最近从美洲迅速传播到其他地方1，2。因此，这种昆虫现在正威胁着国际上的粮食安全。应用新技术可以促进一汽的高级研究，并提供管理这种害虫的新策略。
昆虫种系转化已被用于研究基因功能并产生转基因昆虫，用于遗传控制3，4。在用于实现昆虫遗传转化的各种方法中，基于piggyBac元素的方法中是最常用的方法5。然而，由于转位率低，在非模型昆虫中进行转基因仍然具有挑战性。最近，开发了一种多活性版本的piggyBac转座酶（hyPBase）6，7。最近第8期在一汽实现了种系转化，这是第一份在鳞翅目昆虫中使用hyPBase的报告。本报告描述了使用hyPBase mRNA产生转基因FAW的详细信息。这里描述的方法可以应用于实现其他鳞翅目昆虫的转化。
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Protocol
1. 体 外 合成hyPBase mRNA
注意：合成hyPBase序列的完整编码序列并将其插入pTD1-Cas9载体（见 材料表）以产生pTD1-hyPBase结构，其中包含一个表达hyPBase的盒，T7启动子：polyhedrin-5' UTR：hyPBase：polyhedrin-3' UTR：polyhedrin-3' UTR：poly（A）。pTD1-hyPBase结构的完整序列在 补充材料中提供。
- 体 外 合成模板的制备
- 使用正向引物5'-atgcggtgtgaaataccacagatgcg-3'和反向引物5'-tagaggccaggtaggttatgctag-3'，高保真聚合酶和pTD1-hyPBase质粒作为模板，进行PCR反应以扩增表达hyPBase的盒。
注：PCR反应（最终体积为50μL）包含5.0μL的10x反应缓冲液，4.0μL的10mM脱氧核苷三磷酸（dNTP），1.0μL质粒（50μg/ μL），1.0μL高保真聚合酶，10μM正反引物各1.0μL，以及33μL无核酸酶水。设置如下：初始孵育95°C3分钟，然后35个循环，98°C持续10秒，60°C孵育15秒，68°C孵育2分钟。 - 在新鲜的Tris-醋酸-乙二胺四乙酸（TAE）缓冲液中以120 V的1%琼脂糖凝胶检查PCR产物30分钟，并用凝胶提取试剂盒纯化产物。
注意：请勿使用 PCR 产品纯化试剂盒。即使是微量的pTD1-hyPBase质粒也会显着降低 体外 合成的效率。
- 使用正向引物5'-atgcggtgtgaaataccacagatgcg-3'和反向引物5'-tagaggccaggtaggttatgctag-3'，高保真聚合酶和pTD1-hyPBase质粒作为模板，进行PCR反应以扩增表达hyPBase的盒。
-
使用商业试剂盒体外合成hyPBase mRNA
- 完全解冻冷冻试剂，将酶和2x NTP / CAP溶液保持在冰上，并将解冻的10x反应缓冲液留在室温下。
- 通过加入以下组分在室温下组装反应：2x NTP / CAP溶液：10μL;10x反应缓冲液：2μL;模板DNA： 0.1-0.2 μg;酶混合物：2μL;无核酸酶水至20μL。
- 通过轻轻地上下移液混合物并在37°C孵育2-4小时来彻底混合试剂。
- 氯化锂沉淀回收合成的mRNA
- 加入30μLLiCl沉淀溶液，通过轻拂管彻底混合，然后在-20°C下保持≥30分钟。
- 以最大速度在4°C下离心15分钟，并小心地除去上清液。
- 用1mL 70%乙醇洗涤沉淀一次，重新离心，并小心地除去上清液。
- 在室温下干燥沉淀1-2分钟，然后用20-40μL无核酸酶水重悬沉沉淀。
- 用9μL无核酸酶水稀释1μLmRNA溶液。取2μL测定mRNA浓度，使用8μL在新鲜TAE缓冲液中以100 V在1%琼脂糖凝胶上检查mRNA质量40分钟。
- 等分mRNA溶液并在-70°C下冷冻储存长达一年。
注意：不要完全干燥mRNA沉淀;它可能更难溶解在水中。
2. 显微注射
- 卵子收集
- 将12只雄性蛹和12只雌性蛹放入15厘米x 15厘米x 10厘米的盒子中。用纸巾盖住盒子。将10%蔗糖溶液放入盒子中喂食成人。
- 在闭合后的第2天，将成虫暴露在强光下过夜。
- 在关闭后的第3天，将成年人从步骤2.1.2转移到黑暗的地方。产卵后2小时内收集胚胎。
- 将水滴到纸巾上，将新鲜鸡蛋放在冰上的培养皿中。用细刷子将鸡蛋轻轻地转移到载玻片上，并在载玻片上逐个对齐。在显微注射之前，将载玻片与对齐的鸡蛋放在冰上。
- 显微注射设置
- 使用自动显微注射器的补偿压力，将转基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达质粒（200ng / μL），pBac：hr5ie1-EGFP-SV40，hyPBase mRNA（200ng / μL）和无菌蒸馏水的混合物注入鸡蛋中（ 见 材料表）。
- 将注射的卵保持在27±1°C，60±10%相对湿度下，直到孵化。
- 以人工饲料喂养孵化的幼虫，并在3龄 早期阶段将每个幼虫转移到一个小杯子中（长度约6毫米，体色变黑）。
3. 荧光筛选和基因杂交
- 收集蛹，将约150只雌性蛹和约150只雄性蛹放入35厘米×35厘米的笼子中。在笼子里挂几张纸巾（约30厘米x 15厘米）以收集鸡蛋。
- 每天用鸡蛋收集纸巾，并将鸡蛋保持在27±1°C，60±10%相对湿度，直到孵化。
- 将新生儿幼虫在4°C下保持5分钟以固定它们，然后将它们转移到冰冷的盘子上。
- 在荧光立体显微镜下筛查固定的新生儿幼虫。选择EGFP阳性的新生儿，在~2周内在27±1°C将其提升到蛹期，并根据腹腹部段的表型差异按性别分开。
注意：雌性蛹在第八个腹节上有一个狭缝状的生殖器开口，第九节和第十节的头缘向生殖器开口弯曲。雄性蛹的生殖器开口在第九个腹节上有轻微的抬高。 - 将EGFP阳性蛹和异性野生型蛹放在笼子中以1：1的比例的雄性：雌性。兄弟姐妹交叉表达EGFP的成虫以产生后代。
4. 转基因插入的PCR检测
- 按照制造商的说明，使用任何商业基因组DNA提取试剂盒从野生型和EGFP阳性个体幼虫中提取基因组DNA。
- 使用基因组DNA作为模板进行PCR反应;一个前向引物，5'-acgtacctcctcgtgttccgttc-3'位于IE1启动子区域;和反向引物，5'-aagcactgcacgccgtaggtcag-3'位于EGFP区域的转化载体。
- 设置每个PCR反应（最终体积为40μL）以包含20μL聚合酶混合物，1.0μL基因组DNA（40μg/ μL），1.0μL10μM正反引物和17μL无核酸酶水。使用以下设置：初始孵育95°C3分钟，然后35个循环，95°C持续20秒，56°C20秒，68°C循环40秒设置。
- 在120 V下在1%琼脂糖凝胶上检查PCR产物30分钟。
5. 转基因插入位点的测定
- 使用基因组DNA作为模板进行高效的TAIL-PCR，以确定EGFP阳性昆虫中转基因插入的整合位点。
- 按照其他地方描述的步骤进行PCR反应9。
- 在3轮PCR反应中，分别使用三种引物，P1：5'-atcagtgacacttaccattgaagcacgcc-3'，P2：5'-tcacgggagctccaagcgcgactg-3'和P3：5'-atgtcctaaatgcacagcagacggcgcgct-3'，它们分别对 piggyBac 载体具有特异性。
- 按照其他地方描述的步骤进行PCR反应9。
- 对最终的PCR产物进行测序以确定整合位点。
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Representative Results
一种表达含hyPBase的T7启动子的构建体：polyhedrin-5'UTR：hyPBase：polyhedrin-3'UTR：产生聚（A）信号（图1A）并扩增为〜2.2 kb PCR片段以在体外合成hyPBase mRNA（图1B）。然后，产生hyPBase mRNA并进行琼脂糖凝胶电泳。在1%琼脂糖凝胶上检测到预期大小（〜1.1 kb条带）的mRNA（图1C）。
然后，制备基于 piggyBac的EGFP表达结构（图2A）。该质粒和hyPBase mRNA或PBS溶液的混合物在产卵后2小时内注射到胚胎中。在注射后24小时，在注射的胚胎中观察到EGFP表达的瞬时信号。注射PBS的胚胎没有显示EGFP信号（图2B），而表达EGFP的质粒和hyPBase mRNA注射的胚胎显示出EGFP荧光（图2C），表明 piggyBac 的构建是成功的。因此 ，hr5ie1 启动子可以在早期胚胎发育期间发挥作用。
注射了大约2，000个卵，其中约700个发育成蛹。G0成虫自交，并收集卵子。从这些卵中孵化出来的G1幼虫在荧光立体显微镜下检查EGFP信号。如图 3A所示，转基因幼虫表现出强烈的EGFP信号。为了测试将EGFP表达盒插入EGFP阳性昆虫的基因组中，使用从EGFP阳性幼虫中分离的基因组DNA作为模板扩增含有启动子和EGFP片段的片段（图3B）。当从野生型幼虫中分离出基因组DNA作为模板时，未检测到该片段（图3B）。通过对PCR产物进行高效TAIL-PCR和测序，确定了转基因插入的整合位点。如图 4所示，转基因整合位点位于26号染色体中Twinchin样基因的第81个 内含子。
图1：hyPBase mRNA的产生（A）构建了含有T7启动子的hyPBase表达盒：polyhedrin-5'UTR：hyPBase：polyhedrin-3'UTR：poly（A）信号。（B） 用于合成hyPBase mRNA的~2.2 kb DNA模板是从hyPBase构建体扩增而来的。左侧通道显示在同一凝胶上运行的1-kb梯子。（C） 从扩增的DNA模板中合成了~1.1 kb的hyPBase mRNA。左侧通道显示在同一凝胶上运行的1-kb梯子。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：EGFP在注射胚胎中的表达（A）本研究中使用的piggyBac载体的示意图。（B）在注射1x PBS的胚胎中没有检测到EGFP信号。（C）EGFP信号在注射了piggyBac载体和hyPBase mRNA的胚胎中检测到。比例尺 = 50 μm。缩写：EGFP = 增强型绿色荧光蛋白，PBS = 磷酸盐缓冲盐水。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：转基因FAW的表征（A）EGFP在转基因中表达，但不在野生型FAW幼虫中。比例尺 = 0.5 mm.（B）对转基因基因组插入的PCR分析。使用一对靶向启动子和EGFP区域的引物，使用从转基因或野生型FAW幼虫中分离的基因组DNA作为模板来扩增〜0.5 kb片段。缩写：EGFP =增强型绿色荧光蛋白，FAW =秋粘虫。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：piggyBac构建体的基因组插入。通过TAIL-PCR和测序测定了转基因FAW中piggyBac构建体的基因组插入。显示了染色体定位和部分基因组DNA序列，这些序列位于piggyBac构建体边界的两侧。缩写：FAW = 秋粘虫和 TAIL-PCR = 热不对称隔行 PCR。请点击此处查看此图的放大版本。
补充材料。请点击此处下载此文件。
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Discussion
低转位率和将转基因成分递送到新鲜胚胎中的困难限制了许多非模型昆虫的种系转化的成功，特别是那些来自目鳞翅目昆虫的昆虫。为了提高种系转化率，开发了一种使用最广泛的piggyBac转座酶（hyPBase）的多活性版本7，10。迄今为止，鳞翅目昆虫种系转化的成功主要见于模型昆虫蚕，Bombyx mori11。然而，在其他鳞翅目昆虫（包括一些主要的农业害虫）中进行转基因工作仍然具有挑战性。
使用该协议建立转基因FAW系的主要局限性和关键步骤是合成高质量的hyPBase mRNA并将piggyBac转位组分递送到早期胚胎中。传统piggyBac系统的两个核心组成部分是包含要插入基因组的货物的供体质粒和提供转座酶12的辅助质粒。为了提高转化效率，在辅助质粒中使用高活性启动子来驱动转座酶13，14的表达。由于这些启动子通常来自模型昆虫，因此它们在其他昆虫中的活性可能不如鉴定出启动子的物种高。因此，转座酶mRNA比辅助质粒更有效，这可以改善大多数非模型昆虫的种系转化。
在该协议中，通过构建含有hyPBase表达盒（T7启动子：polyhedrin-5'UTR：hyPBase：polyhedrin-3'UTR：polyhedrin-3'UTR：poly（A）信号）的质粒 在体外 制备hyPBase mRNA。T7启动子允许使用市售的mRNA合成试剂盒 在体外 合成mRNA。多面体-5'UTR和多面体-3'UTR都有助于改善hyPBase mRNA 在体外的 转录和hyPBase蛋白 在体内的翻译。聚（A）信号的存在有助于增强hyPBase mRNA 在体内15中的稳定性。此外，将 piggyBac 组分注射到具有有限数量分裂细胞的早期胚胎中对于提高提供生殖系细胞的 piggyBac 系统组分祖细胞的机会也至关重要。生殖细胞中发生的转位事件可能是遗传的。在该协议中，收集不到2小时的FAW胚胎并将其保存在冰上，以减缓其注射前的发育。对于大多数昆虫来说，尽早收集胚胎并找到减缓其发育的方法也有助于成功的种系转化。
在昆虫转基因中使用荧光蛋白有助于识别转基因动物。在该协议中，IE1启动子（据报道是鳞翅目昆虫11中有效且无处不在的启动子）与hr5增强子融合以驱动EGFP的表达。 在将EGFP插入FAW基因组的转基因个体中，可以在所有阶段观察到EGFP信号（数据未显示）。 piggyBac介导的插入的分子确认通常通过南方印迹或反向PCR和测序进行。在该协议中，使用转基因货物中片段的PCR扩增来确认转基因插入。此外，采用基于PCR的高效TAIL-PCR方法鉴定转基因插入9的整合位点，与广泛使用的逆向PCR方法相比，该整合位点易于操作。开发高效TAIL-PCR方法鉴定植物中的转基因整合位点。在这项研究中，这种方法首次用于昆虫。所提出的方案为产生转基因FAW提供了一种有效的方法，也可以进一步应用于许多其他模型和非模型昆虫。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
报告的研究得到了美国国家科学基金会I / UCRC，节肢动物管理技术中心的支持，根据资助号IIP-1821936以及行业合作伙伴，农业和食品研究计划竞争性补助金号2019-67013-29351和美国农业部国家粮食和农业研究所（2019-67013-29351和2353057000）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
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