Summary
A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.
Abstract
A inserção estável da carga genética em genomas de insetos usando elementos transposáveis é uma poderosa ferramenta para estudos genômicos funcionais e desenvolvimento de estratégias genéticas de manejo de pragas. O elemento transposável mais usado na transformação de insetos é o piggyBac, e a transformação germinal baseada em piggyBactem sido conduzida com sucesso em insetos modelo. No entanto, ainda é desafiador empregar essa tecnologia em insetos não-modelo que incluem pragas agrícolas. Este artigo relata a transformação germinal de uma praga agrícola global, a minhoca de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,usando a transposase hiperativa piggyBac (hyPBase).
Neste trabalho, o mRNA hyPBase foi produzido e utilizado no lugar de plasmídeo de ajudante em microinjeções de embriões. Essa mudança levou à geração bem sucedida de FAW transgênico. Além disso, também são descritos os métodos de triagem de animais transgênicos, a detecção rápida da inserção transgênica baseada em PCR e a determinação assimétrica do local de integração. Assim, este artigo apresenta um protocolo para produzir FAW transgênico, o que facilitará a transgênese baseada em piggyBacna FAW e outros insetos lepidopteranos.
Introduction
O verme do exército de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,é nativo de regiões tropicais e subtropicais da América. Atualmente, este é um herbívoro de insetos devastador em mais de 100 países em todo o mundo1. As larvas faw se alimentam de mais de 350 plantas hospedeiras, incluindo algumas importantes culturas alimentaresbásicas 2. A forte capacidade migratória dos adultos da FAW contribui para sua recente rápida disseminação das Américas para outros lugares1,2. Como resultado, este inseto está ameaçando a segurança alimentar internacionalmente. A aplicação de novas tecnologias pode facilitar estudos avançados na FAW e fornecer novas estratégias para gerenciar essa praga.
A transformação da germinação de insetos tem sido usada para estudar a função genética e gerar insetos transgênicos para uso no controle genético3,4. Entre os vários métodos utilizados para alcançar a transformação genética em insetos, o método baseado em elementos piggyBac é o método mais utilizado5. No entanto, devido à baixa taxa de transposição, ainda é desafiador realizar transgênese em insetos não modelo. Recentemente, uma versão hiperativa de piggyBac transposase (hyPBase) foi desenvolvida6,7. A transformação germinal foi alcançada na FAW recentemente8, que é o primeiro relatório que utilizou o hyPBase em insetos lepidopteranos. Neste relatório, são descritas informações detalhadas sobre a contratação de mRNA hipPBase na geração de FAW transgênicos. O método aqui descrito poderia ser aplicado para alcançar a transformação de outros insetos lepidopteranos.
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Protocol
1. Síntese in vitro de hipPBase mRNA
NOTA: A sequência completa de codificação da sequência hyPBase foi sintetizada e inserida em um vetor pTD1-Cas9 (ver a Tabela de Materiais) para produzir a construção pTD1-hyPBase, que contém um expresso em hyPBase, promotor T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). A sequência completa da construção pTD1-hyPBase está prevista no Material Suplementar.
- Preparação do modelo para síntese in vitro
- Execute uma reação pcr para amplificar o de expressão hyPBase usando um primer para a frente, 5'- atgcggtgtgaaccgcacagatgcg-3', e um primer reverso de 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerase de alta fidelidade e plasmídeo pTD1-hyPBase como um modelo.
NOTA: A reação do PCR (volume final de 50 μL) contém 5,0 μL de tampão de reação de 10x, 4,0 μL de triphosfato de desoxicosídeo de 10 mM (dNTP), 1,0 μL de plasmid (50 μg/μL), 1,0 μL de alta fidelidade polmerase, 1,0 μL cada um dos primers dianteiros e invertidos de 10 μM e 33 μL de água sem nuclease. As configurações foram as seguintes: uma incubação inicial de 95 °C para 3 min, seguida por 35 ciclos de 98 °C para 10 s, 60 °C para 15 s e 68 °C para 2 min. - Verifique o produto PCR em um gel de 1% de agarose a 120 V em tampão fresco de ácido tetraacético Tris-acetato-etilenodiamina (TAE) por 30 min e purifique o produto com o kit de extração de gel.
NOTA: Não utilize o kit de purificação do produto PCR. Mesmo uma quantidade de traço do plasmídeo pTD1-hyPBase diminui significativamente a eficiência da síntese in vitro.
- Execute uma reação pcr para amplificar o de expressão hyPBase usando um primer para a frente, 5'- atgcggtgtgaaccgcacagatgcg-3', e um primer reverso de 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polimerase de alta fidelidade e plasmídeo pTD1-hyPBase como um modelo.
-
Síntese in vitro do hippbase mRNA usando um kit comercial
- Descongele completamente os reagentes congelados, mantenha a enzima e a solução NTP/CAP 2x no gelo e deixe o tampão de reação desoçado em temperatura ambiente.
- Monte a reação à temperatura ambiente adicionando os seguintes componentes: solução 2x NTP/CAP: 10 μL; 10x Tampão de reação: 2 μL; DNA do modelo: 0.1-0.2 μg; Mistura de enzimas: 2 μL; Água sem nuclease a 20 μL.
- Misture bem os reagentes, encanar suavemente a mistura para cima e para baixo e incubar a 37 °C por 2-4 h.
- Recuperação do mRNA sintetizado por precipitação de cloreto de lítio
- Adicione 30 μL de Solução de Precipitação LiCl, misture bem apertando o tubo e, em seguida, mantenha -20 °C por ≥ 30 min.
- Centrifugar a 4 °C por 15 min na velocidade máxima e remover cuidadosamente o sobrenatante.
- Lave a pelota uma vez com 1 mL de 70% de etanol, reclímfusuga e remova o sobrenante cuidadosamente.
- Seque a pelota à temperatura ambiente por 1-2 min e, em seguida, resuspenque a pelota com 20-40 μL de água sem nuclease.
- Diluir 1 μL de solução mRNA com 9 μL de água sem nuclease. Tome 2 μL para determinar a concentração de mRNA e use 8 μL para verificar a qualidade do mRNA em um gel de 1% de agarose a 100 V em tampão TAE fresco por 40 minutos.
- Aliquot a solução mRNA e armazene congelado a -70 °C por até um ano.
NOTA: Não seque completamente a pelota de mRNA; pode ser mais difícil dissolvê-lo na água.
2. Microinjeção
- Coleta de ovos
- Coloque 12 pupas machos e 12 pupas fêmeas em uma caixa de 15 cm x 15 cm x 10 cm. Cubra a caixa com uma toalha de papel. Coloque uma solução de sacarose de 10% na caixa para alimentar adultos.
- No segundo dia pós-eclosão, exponha os adultos à luz intensa durante a noite.
- No dia 3 após a eclosão, transfira os adultos da etapa 2.1.2 para um lugar escuro. Recolher os embriões dentro de 2h após a oviposição.
- Adicione gotas de água ao pedaço de uma toalha de papel com ovos frescos mantidos em uma placa de Petri no gelo. Transfira os ovos suavemente para um deslizamento de vidro com uma escova fina e alinhe-os um a um em uma lâmina de vidro. Mantenha os slides de vidro com os ovos alinhados no gelo antes da microinjeção.
- Configuração de microinjeção
- Injete uma mistura de uma proteína fluorescente verde transgênica (EGFP) expressando plasmídeo (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hipPBase mRNA (200 ng/μL) e água destilada estéril nos ovos, usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado (ver a Tabela dos Materiais).
- Mantenha os ovos injetados a 27 ± 1 °C, 60 ± umidade relativa até chocar.
- Alimente as larvas eclodidas em uma dieta artificial e transfira cada larva para um pequeno copo no estágioinstar 3 no início (~6 mm de comprimento, e a cor do corpo fica preta).
3. Triagem de fluorescência e travessia genética
- Colete a pupae e coloque ~150 pupas fêmeas e ~150 pupas machos em uma gaiola de 35 cm x 35 cm x 35 cm. Pendure vários pedaços de toalhas de papel (~30 cm x 15 cm) na gaiola para coletar os ovos.
- Recolhe as toalhas de papel com ovos diariamente e mantenha os ovos a 27 ± 1 °C, 60 ± 10% de umidade relativa até eclodir.
- Mantenha as larvas de nénato a 4 °C por 5 minutos para imobilizá-las e, em seguida, transfira-as para uma placa gelada.
- Trie as larvas imobilizadas de recém-nascidos sob um estereóscópio de fluorescência. Selecione os recém-nascidos positivos do EGFP, eleve-os para o estágio pupal em ~2 semanas a 27 ± 1 °C, e separe-os por sexo de acordo com as diferenças de fenótipo nos segmentos do abdômen ventral.
NOTA: A pupa fêmea tem uma abertura genital semelhante à fenda no oitavo segmento abdominal e as margens cefálicas do nono e décimo segmentos curvados em direção à abertura genital. A abertura genital da pupa masculina tem uma leve elevação no nono segmento abdominal. - Coloque a pupae EGFP-positiva e a pupae do tipo selvagem do sexo oposto em um macho: proporção feminina de 1:1 em uma gaiola. Sib-cross os adultos expressos do EGFP para produzir as gerações seguintes.
4. Detecção de PCR de inserção transgênica
- Extrair DNA genômico das larvas individuais do tipo selvagem e EGFP positivo usando qualquer kit de extração de DNA genômico comercial seguindo as instruções do fabricante.
- Realizar uma reação pcr usando o DNA genômico como modelo; um primer avançado, 5'-acgtacgctccccctgtgttccgttc-3' localizado na região promotora ie1; e um primer reverso, 5'-aagcactacccgtaggtcag-3' localizado na região EGFP do vetor de transformação.
- Configure cada reação pcr (volume final de 40 μL) para conter 20 μL da mistura de polimerase, 1,0 μL de DNA genômico (40 μg/μL), 1,0 μL cada um dos primers dianteiros e reversos de 10 μM e 17 μL de água sem nuclease. Use as seguintes configurações: uma incubação inicial de 95 °C para 3 min, seguida por 35 ciclos de 95 °C para 20 s, 56 °C para 20 s e 68 °C para 40 s.
- Verifique os produtos PCR em um gel de 1% agarose a 120 V por 30 min.
5. Determinação do local de inserção transgênica
- Realize tail-PCR de alta eficiência usando DNA genômico como modelo para determinar o local de integração da inserção transgênica nos insetos positivos do EGFP.
- Execute as reações do PCR seguindo as etapas descritas em outros lugares9.
- Use três primers, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacacgcc-3', P2: 5'tcacgggagctccaagcggcgactg-3', e P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggcgcgct-3', que são específicos para o vetor piggyBac, nas 3 rodadas de reação pcr, respectivamente.
- Execute as reações do PCR seguindo as etapas descritas em outros lugares9.
- Sequencie os produtos pcr finais para determinar o local de integração.
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Representative Results
Uma construção para a expressão do promotor T7 contendo hippBase: poliedrin-5'UTR: hyPBase: poliedrin-3'UTR: poly (A) sinal foi gerado(Figura 1A) e amplificado como um fragmento de PCR ~2,2 kb para sintetizar hipPBase mRNA in vitro (Figura 1B). Em seguida, o mRNA hyPBase foi produzido e submetido à eletroforese de gel agarose. O mRNA do tamanho esperado (~1,1 kb de banda) foi detectado em um gel de 1% de agarose(Figura 1C).
Em seguida, foi preparada uma construção de expressão EGFP baseada em piggyBac(Figura 2A). Uma mistura deste plasmídeo e hippBase mRNA, ou solução PBS, foi injetada em embriões dentro de 2 h após a oviposição. Às 24 horas após a injeção, observou-se um sinal transitório de expressão EGFP nos embriões injetados. Os embriões injetados pelo PBS não apresentaram sinal EGFP (Figura 2B),enquanto os embriões injetados por EGFP e hyPBase mRNA apresentaram fluorescência EGFP(Figura 2C),indicando que a construção do cofrinhoBac foi bem sucedida. Assim, o promotor hr5ie1 pode funcionar durante o desenvolvimento embrionário precoce.
Aproximadamente 2.000 ovos foram injetados, e ~700 deles se desenvolveram em pupas. Os adultos do G0 foram auto-cruzados, e os ovos foram coletados. As larvas G1 eclodidas desses ovos foram examinadas para o sinal EGFP sob um estereótipo de fluorescência. Como mostrado na Figura 3A,as larvas transgênicas apresentaram um forte sinal EGFP. Para testar a inserção do de expressão EGFP nos genomas dos insetos positivos do EGFP, um fragmento contendo o promotor e o fragmento EGFP foi amplificado utilizando o DNA genômico isolado das larvas positivas do EGFP como modelo(Figura 3B). Este fragmento não foi detectado quando o DNA genômico foi isolado das larvas do tipo selvagem como modelo (Figura 3B). Ao realizar tail-PCR de alta eficiência e sequenciamento dos produtos PCR, foi determinado o local de integração da inserção transgênica. Como mostrado na Figura 4, o local de integração transgene está no 81st intron do gene twinchin-like no cromossomo 26.
Figura 1: Produção de hyPBase mRNA. (A) O que expressa o hyPBase contendo o promotor T7: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) sinal foi construído. (B) O modelo de DNA de ~2,2 kb para sintetizar o mRNA hippbase foi amplificado a partir da construção hyPBase. A faixa da esquerda mostra a escada de 1 kb correr no mesmo gel. (C) Um mRNA de ~1,1 kb hyPBase foi sintetizado a partir do modelo de DNA amplificado. A faixa da esquerda mostra a escada de 1 kb correr no mesmo gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão de EGFP em embriões injetados. (A) Diagrama esquemático do vetor piggyBac utilizado neste estudo. (B) Nenhum sinal EGFP foi detectado em embriões injetados com 1x PBS. (C) O sinal EGFP foi detectado em embriões injetados com o vetor piggyBac e o mRNA hyPBase. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada e PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização da expressãoFAW. (A)EGFP transgênica, mas não em larvas FAW do tipo selvagem. Barras de escala = 0,5 mm. (B) Análise pcr da inserção genômica dos transgênicos. Um par de primers voltados para as regiões promotoras e EGFP foram usados para amplificar um fragmento de ~0,5 kb usando o DNA genômico isolado de larvas FAW transgênicas ou selvagens como modelo. Abreviaturas: EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada e FAW = Verme do exército de outono. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Inserção genômica da construção de piggyBac. A inserção genômica da construção de piggyBac em FAW transgênica foi determinada por TAIL-PCR e sequenciamento. A localização do cromossomo e as sequências parciais de DNA genômico que flanqueiam os limites da construção do piggyBac são mostradas. Abreviaturas: FAW = Faltou armyworm e TAIL-PCR = PCR assimétrico assimétrico térmico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A baixa taxa de transposição e a dificuldade de entregar componentes transgênicos em embriões frescos limitam o sucesso da transformação germinal em muitos insetos não-modelo, especialmente aqueles da ordem, Lepidoptera. Para aumentar a taxa de transformação germinal, foi desenvolvida uma versão hiperativa da transposase de piggyBac mais utilizada (hyPBase)7,10. Até o momento, a transformação germinal bem sucedida em insetos lepidopteranos é relatada principalmente no modelo bicho-da-seda inseto, Bombyx mori11. No entanto, a realização de trabalhos de transgênese em outros insetos lepidopteranos, incluindo algumas pragas agrícolas importantes, ainda é um desafio.
As principais limitações e os principais passos do estabelecimento de uma linha FAW transgênica usando este protocolo são sintetizar mRNA hipPBase de alta qualidade e fornecer componentes de transposição de piggyBac nos primeiros embriões. Os dois componentes principais do sistema tradicional de piggyBac são um plasmídeo doador contendo a carga a ser inserida no genoma e um plasmídeo auxiliar fornecendo a transposase12. Para aumentar a eficiência de transformação, promotores altamente ativos são usados no plasmídeo auxiliar para impulsionar a expressão da transposase13,14. Como esses promotores são geralmente obtidos a partir de insetos modelo, sua atividade em outros insetos pode não ser alta como nas espécies das quais o promotor foi identificado. Assim, a transposase mRNA é mais eficaz do que o plasmídeo auxiliar, o que pode melhorar a transformação germinal na maioria dos insetos não-modelo.
Neste protocolo, o hipPBase mRNA foi preparado in vitro através da construção de um plasmídeo contendo o que expressa o hyPBase (promotor T7: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: poly (A) sinal). O promotor T7 permite síntese in vitro de mRNA usando kits de síntese de mRNA disponíveis comercialmente. Tanto poliédrin-5'UTR quanto poliedrin-3'UTR podem ajudar a melhorar a transcrição do hippBase mRNA in vitro e tradução da proteína hyPBase in vivo. A presença do sinal poli (A) ajuda a aumentar a estabilidade do hippBase mRNA in vivo15. Além disso, a injeção dos componentes do piggyBac nos embriões muito precoces com um número limitado de células divisórias também é fundamental para melhorar as chances de fornecer progenitores de componentes do sistema piggyBac de células germinais. Os eventos de transposição que ocorrem nas células germinativas podem ser herdados. Neste protocolo, embriões faw com menos de 2 horas de idade foram coletados e mantidos no gelo para retardar seu desenvolvimento antes da injeção. Para a maioria dos insetos, coletar embriões o mais cedo possível e encontrar uma maneira de retardar seu desenvolvimento também pode ajudar na transformação germinal bem sucedida.
O uso de proteínas fluorescentes na transgênese de insetos ajuda na identificação de animais transgênicos. Neste protocolo, o promotor do IE1, que tem sido relatado como um promotor eficiente e onipresente nos insetos lepidopteranos11, derivado do vírus de poliedrose nuclear multicapsóide autographa california (AcNPV) imediatamente, foi fundido com o melhorador hr5 para conduzir a expressão do EGFP. Em indivíduos transgênicos nos quais o EGFP foi inserido no genoma faw, o sinal EGFP pôde ser observado em todos os estágios (dados não mostrados). A confirmação molecular da inserção mediada por piggyBacfoi geralmente realizada por mancha sul ou PCR inversa e sequenciamento. Neste protocolo, a amplificação pcr de um fragmento na carga transgênica foi utilizada para confirmar a inserção transgênica rapidamente. Além disso, foi utilizado um método TAIL-PCR de alta eficiência baseado em PCR para identificar o local de integração da inserção transgênica9,que é fácil de manipular em comparação com o método PCR inverso amplamente utilizado. O método TAIL-PCR de alta eficiência foi desenvolvido para identificar os locais de integração transgênica nas plantas. Neste estudo, este método é usado pela primeira vez em insetos. O protocolo apresentado fornece uma maneira eficaz de gerar FAW transgênico e também pode ser aplicado a muitos outros modelos e insetos não-modelo.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
A pesquisa relatada é apoiada pela National Science Foundation I/UCRC, o Center for Arthropod Management Technologies, sob o Grant No IIP-1821936 e por parceiros da indústria, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 e o National Institute of Food and Agriculture, Departamento de Agricultura dos EUA (2019-67013-29351 e 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
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