Summary
가을 군벌레, 스포드옵테라 검거르다에서성공적인 생식선 변환은, 활동적인 돼지박 트랜스포사제의 mRNA를 사용하여 달성되었다.
Abstract
유전적 화물을 변형 가능한 원소를 사용하여 곤충 게놈에 안정적으로 삽입하는 것은 기능성 게놈 연구및 유전자 해충 관리 전략을 개발하기 위한 강력한 도구입니다. 곤충 변환에서 가장 많이 사용되는 형질 전환 요소는 돼지 박이며, 돼지 박기반 의 생식선 변환은 성공적으로 모델 곤충에서 수행되었습니다. 그러나, 농업 해충을 포함 하는 비 모델 곤충에이 기술을 채택 하는 여전히 도전. 이 논문은 전 세계 농업 해충, 가을 군벌레 (FAW), 스포드 옵테라 검거르다,활동적인 돼지 박 트랜스포사아제 (hyPBase)를 사용하여 생식선 변환에 보고합니다.
이 작품에서 hyPBase mRNA는 배아 미세 주입에서 도우미 플라스미드 대신 에 생산및 사용되었습니다. 이러한 변화는 트랜스제닉 FAW의 성공적인 세대로 이어졌습니다. 더욱이, 형질전환동물의 선별 방법, PCR 계의 신속한 트랜스진 삽입 및 열 비대칭 인터레이스 PCR(TAIL-PCR) 기반의 통합 부위의 결정도 설명된다. 따라서, 이 논문은 FAW 및 그밖 lepidopteran 곤충에 있는 돼지박기지를 둔 전염을 촉진할 환생 FAW를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.
Introduction
가을 군벌레 (FAW), Spodoptera 검소한다,미국의 열대 및 아열대 지역 출신이다. 현재, 이것은 전 세계 100 개 이상의 국가에서 파괴적인 곤충 초식동물입니다 1. FAW 애벌레는 몇 가지 중요한 주식 작물 을 포함하여 350 개 이상의 호스트 식물에 사료2. FAW 성인의 강력한 이주 능력은 최근 미대륙에서 다른 장소로 급속한 확산에 기여1,2. 그 결과, 이 곤충은 현재 국제적으로 식량 안보를 위협하고 있습니다. 새로운 기술을 적용하면 FAW의 고급 연구를 용이하게하고이 해충을 관리하는 새로운 전략을 제공 할 수 있습니다.
곤충 생식선 변환유전자 기능을 연구하고 유전자 제어3,4에사용하기 위해 형질전환 곤충을 생성하는 데 사용되어 왔다. 곤충의 유전적 변화를 달성하는 데 사용되는 다양한 방법 중, 돼지박 원소 기반 방법은 가장 많이 사용되는 방법5이다. 그러나, 전치의 낮은 비율로 인해, 비 모델 곤충에서 전염을 수행하는 것은 여전히 도전이다. 최근에는 피기박 트랜스포사아제(hyPBase)의 활동적인 버전이6,7로개발되었다. Germline 변환은 최근 FAW에서 달성되었다8,이는 lepidopteran 곤충에 hyPBase를 사용하는 첫 번째 보고서입니다. 본 보고서에서, 형질전환 FAW 생성에 hyPBase mRNA를 채용에 대한 자세한 정보가 설명된다. 여기에 설명된 방법은 다른 lepidopteran 곤충의 변환을 달성하기 위해 적용될 수 있었다.
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Protocol
1. hyPBase mRNA의 체외 합성
참고: hyPBase 서열의 전체 코딩 시퀀스는 합성 및 pTD1-Cas9 벡터에 삽입되었다 (재료의 표참조) hyPBase 표현 카세트를 포함하는 pTD1-hyPBase 구조를 생산, T7 프로모터 : 폴리 헤드린 -5'UTR : hyPBase : 폴리 히프린 - 3'UTR. pTD1-hyPBase 구조의 전체 시퀀스는 보충 재료에제공됩니다.
- 체외 합성을 위한 템플릿 준비
- PCR 반응을 수행하여 전방 프라이머, 5'-atgcgggtgaaataccgcacaggcg-3', 역프라이머 5'-tagaggccaaggttatgctag-3', 고충실도 폴리머라제 및 pTD1-hyPBase 플라미드를 사용하여 하이PBase 표현 카세트를 증폭시한다.
참고: PCR 반응(50 μL의 최종 부피)에는 10x 반응 버퍼의 5.0 μL이 포함되어 있습니다. 4.0 μL 의 10 mM 데옥시뉴클레오사이드 삼중산염(dNTP), 플라스미드 1.0 μL(50μg/μL), 고충실도 폴리머라제 1.0 μL, 10μM 의 전방 및 역프라이머 각각 1.0 μL, 뉴클레아스 프리 워터 33 μL. 설정은 다음과 같이: 3 분 동안 95 °C의 초기 인큐베이션, 10 초에 대한 98 °C의 35 사이클, 15 초에 대한 60 °C, 2 분 동안 68 °C. - 신선한 트리세테이트 에틸렌디아민 테트라아세산(TAE) 완충제에서 120V의 1% 아가로즈 젤로 PCR 제품을 30분 간 확인하고 젤 추출 키트로 제품을 정화합니다.
참고 : PCR 제품 정화 키트를 사용하지 마십시오. pTD1-hyPBase 플라스미드의 미량조차도 체외 합성의 효율을 크게 감소시다.
- PCR 반응을 수행하여 전방 프라이머, 5'-atgcgggtgaaataccgcacaggcg-3', 역프라이머 5'-tagaggccaaggttatgctag-3', 고충실도 폴리머라제 및 pTD1-hyPBase 플라미드를 사용하여 하이PBase 표현 카세트를 증폭시한다.
-
상용 키트를 이용한 hyPBase mRNA의 체외 합성
- 냉동 시약을 완전히 해동하고, 효소와 2배 NTP/CAP 용액을 얼음 위에 보관하고, 해동된 10x 반응 버퍼를 실온에서 남깁니다.
- 다음 구성 요소를 추가하여 실온에서 반응을 조립 : 2x NTP / CAP 용액 : 10 μL; 10x 반응 버퍼: 2 μL; 템플릿 DNA: 0.1-0.2 μg; 효소 혼합: 2 μL; 20 μL에 핵이없는 물.
- 혼합물을 위아래로 부드럽게 파이프팅하여 시약을 37°C에서 2-4h로 부드럽게 섞는다.
- 염화리튬 강수량에 의한 합성 mRNA 의 회수
- LiCl 침전액의 30 μL을 추가하고 튜브를 가볍게 섞은 다음 -20 °C에서 ≥ 30 분 동안 유지하십시오.
- 최대 속도로 15분 동안 4°C의 원심분리기는 상체를 조심스럽게 제거합니다.
- 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 한 번 씻고, 재원심분리기를 조심스럽게 제거합니다.
- 실온에서 펠릿을 1-2분 동안 건조한 다음, 20-40 μL의 뉴클레아제 없는 물로 펠릿을 다시 분리한다.
- 핵이 없는 물의 9μL로 mRNA 용액 1μL을 희석시하십시오. 2 μL을 사용하여 mRNA 농도를 결정하고 8 μL을 사용하여 신선한 TAE 버퍼에서 100 V에서 1% 아가로즈 젤에서 mRNA 품질을 확인하십시오.
- mRNA 용액을 알리쿼트하고 최대 1년 동안 -70°C에서 냉동 보관하십시오.
참고 : mRNA 펠릿을 완전히 건조시키지 마십시오. 물에 녹는 것이 더 어려울 수 있습니다.
2. 미세 주입
- 계란 컬렉션
- 15cm x 15cm x 10cm 상자에 12개의 수컷 강아지와 12개의 암컷 강아지를 놓습니다. 종이 타월로 상자를 덮습니다. 성인에게 먹이를 주기 위해 10% 자당 용액을 상자에 놓습니다.
- 2일째에 포스트 백과사전, 하룻밤 강렬한 빛에 성인을 노출.
- 3일째에는 성인을 2.1.2단계에서 어두운 곳으로 옮기는다. 배반 후 2 시간 이내에 배아를 수집합니다.
- 신선한 달걀을 얼음 위에 보관한 종이 타월 조각에 물 방울을 넣습니다. 계란을 미세한 브러시로 유리 슬라이드에 부드럽게 옮기고 유리 슬라이드에 하나씩 정렬합니다. 마이크로 주입하기 전에 유리 슬라이드를 얼음 위에 정렬 된 계란과 함께 유지하십시오.
- 미세 주입 설정
- 형질 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)-표현 플라스미드 (200 ng/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ng/μL), 및 멸균 증류수를 계란에 주입하여 자동화 된 미세 주입기의 보상 압력을 사용하여 (재료의 표참조).
- 주입된 계란을 27± 1°C, 60± 10% 상대 습도에서 부화할 때까지 보관하십시오.
- 부화유를 인공 식단에 먹이고, 각 애벌레를3rd instar 초반에 작은 컵 한 잔으로 옮기고(길이가 6mm, 바디 컬러는 검게 변합니다).
3. 형광 검사 및 유전 횡단
- 35cm x 35cm x 35cm 케이지에 새끼를 모으고 ~ 150 개의 암컷 강아지와 ~ 150 개의 수컷 강아지를 배치하십시오. 계란을 수집하기 위해 케이지에 종이 타월 (~ 30cm x 15cm)의 여러 조각을 걸어.
- 매일 달걀로 종이 타월을 수집하고, 27 ± 1 °C, 60 ± 10 % 상대 습도에서 부화 될 때까지 보관하십시오.
- 신산 유충을 4°C에서 5분 동안 보관한 다음 얼음 냉판으로 옮긴다.
- 형광 스테레오 현미경으로 고정 된 신생아 애벌레를 검사하십시오. EGFP 양성 신생아를 선택하고, 27± 1°C에서 ~2주 만에 푸팔 단계로 올리고, 복부 세그먼트의 표현형 차이에 따라 성별에 따라 분리한다.
참고 : 여성 강아지는 여덟 번째 복부 세그먼트에 슬릿 같은 생식기 개구부와 생식기 개구부를 향해 휘어진 아홉 번째 및 열 번째 세그먼트의 세팔릭 마진을 가지고 있습니다. 남성 강아지의 생식기 개구부는 아홉 번째 복부 세그먼트에 약간의 고도가 있습니다. - EGFP 양성 강아지와 이성의 야생 형 강아지를 남성에 놓습니다 : 케이지에 1:1의 여성 비율. 다음 세대를 생산하기 위해 EGFP 를 표현하는 성인을 Sib-cross.
4. 형질 전환 삽입의 PCR 검출
- 제조 업체의 지시에 따라 모든 상업적게놈 DNA 추출 키트를 사용 하 여 야생 형 및 EGFP 양성 개별 애벌레에서 게놈 DNA를 추출.
- 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여 PCR 반응을 수행; ie1 프로모터 지역에 위치한 5'-acgtacgctcctccgttccgttc-3' 전방 프라이머; 및 역프라이머, 5'-aagcactgcacgccgtaggtcag-3' 변환 벡터의 EGFP 영역에 위치.
- 각 PCR 반응(40 μL의 최종 부피)을 설정하여 폴리머라제 혼합물의 20 μL, 게놈 DNA 1.0 μL(40 μg/μL), 10μM 의 전방 및 역프라이머 각각 1.0 μL, 뉴클레아제 없는 물의 17μL을 포함한다. 다음 설정을 사용하십시오: 3분 동안 95°C의 초기 인큐베이션, 20s용 95°C의 35사이클, 20s용 56°C, 40s 설정의 경우 68°C가 뒤따릅니다.
- PCR 제품을 1% 아가로즈 젤120 V에서 30분 동안 확인하십시오.
5. 형질전환 삽입 부위의 결정
- EGFP 양성 곤충에서 트랜스진 삽입의 통합 부위를 결정하기 위해 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여 고효율 TAIL-PCR을 수행한다.
- 다른 곳에서 설명된 단계9다음에PCR 반응을 수행한다.
- P1: 5'-atcagtgacactctaccgcattgaagcacgcc-3', P2: 5'tcacgggagctccagcggcgactg-3', 및 P3: 5'atgttaatgcgcgcgacggacgcgct-3', p3: 5'-atgttaatgcgcgacggacgcgct-3'를 사용 하 여, p1, p1의 반응에 특정, 3'.
- 다른 곳에서 설명된 단계9다음에PCR 반응을 수행한다.
- 최종 PCR 제품을 시퀀스하여 통합 사이트를 결정합니다.
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Representative Results
hyPBase 함유 T7 프로모터의 발현을 위한 구조: 폴리히드린-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: 폴리헤드론-3'UTR: 폴리(A) 신호가 생성되었다(도1A)및 hyPBase mRNA 생체외(도 1B)를합성하기 위해 ~2.2kb PCR 단편으로 증폭되었다. 이어서, hyPBase mRNA가 생성되고 아가로즈 겔 전기포광을 하였다. 예상 크기의 mRNA(~1.1kb 대역)는 1% 아가로즈겔(도 1C)에서검출되었다.
이어서, 돼지박계EGFP 발현구조(도 2A)를준비하였다. 이 플라스미드 및 hyPBase mRNA 또는 PBS 용액의 혼합물은 oviposition 후 2 시간 이내에 배아로 주입되었습니다. 주사 후 24시간에서, 주입된 배아에서 EGFP 발현의 일시적인 신호가 관찰되었다. PBS 주입 배아는 EGFP 신호(도2B)를나타내지 않았고, EGFP-발현 플라스미드 및 hyPBase mRNA 주입 배아는 EGFP 형광(도2C)을보였으며, 이는 피기박 시공이 성공적이었음을 나타낸다. 따라서, hr5ie1 프로모터는 초기 배아 발달 중에 기능할 수 있다.
약 2,000개의 알이 주입되었고, 그 중 ~700마리가 푸파로 발전했습니다. G0 성인은 자기 교차했다, 계란은 수집되었다. 이 계란에서 부화한 G1 애벌레는 형광 스테레오 현미경의 밑에 EGFP 신호에 대해 검토되었습니다. 도 3A에도시된 바와 같이, 형질전환애벌레는 강한 EGFP 신호를 보였다. EGFP 양성 곤충의 게놈내로 EGFP 발현 카세트의 삽입을 테스트하기 위해, 발기인 및 EGFP 단편을 함유한 단편은 EGFP 양성 애벌레로부터 분리된 게놈 DNA를 템플릿으로 사용하여 증폭되었다(도3B). 이 단편은 유전체 DNA가 야생형 애벌레로부터 분리되었을 때 검출되지않았다(도 3B). PCR 제품의 고효율 TAIL-PCR 및 시퀀싱을 수행함으로써, 트랜스진 삽입의 통합 부위가 결정되었다. 도 4에도시된 바와 같이, 트랜스진 통합 부위는 염색체 26에서 트윈친과 같은 유전자의 81st 인트론에 있다.
도 1: hyPBase mRNA의 생산. (A)T7 프로모터를 포함하는 hyPBase 표현 카세트: 폴리헤드린-5'UTR: hyPBase: 폴리헤드린-3'UTR: 폴리(A) 신호가 생성되었다. (B)hyPBase mRNA를 합성하기 위한 ~2.2 kb DNA 템플릿이 hyPBase 구조로부터 증폭되었다. 왼쪽 차선은 동일한 젤에서 1kb 사다리가 달리는 것을 보여줍니다. (C)A ~1.1 kb hyPBase mRNA는 증폭된 DNA 템플릿으로부터 합성되었다. 왼쪽 차선은 동일한 젤에서 1kb 사다리가 달리는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 주입된 배아에서 EGFP의 발현. (A)이 연구에서 사용되는 피기박 벡터의 회로도도. (B)1x PBS로 주입된 배아에서 EGFP 신호가 검출되지 않았다. (C)EGFP 신호는 피기박 벡터 및 hyPBase mRNA를 주입한 배아에서 검출되었다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질 및 PBS = 인산염 완충식식염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 형질전환 FAW의 특성화.(A) EGFP 발현은 형질전환하지만 야생형 FAW 애벌레에서는 발현되지 않는다. 스케일 바 = 0.5 mm.(B)PCR 분석의 게놈 삽입의 형질전환. 프로모터 및 EGFP 영역을 표적으로 하는 프라이머 한 쌍은 형질전환 또는 야생형 FAW 애벌레로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 ~0.5 kb 단편을 프렌터로 증폭시키는 데 사용되었다. 약어: EGFP = 향상된 녹색 형광 단백질 및 FAW = 가을 군벌레. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 피기박 구조의 유전체 삽입. 형질전환 FAW에서 피기박 구조의 유전체 삽입은 TAIL-PCR 및 시퀀싱에 의해 결정되었다. 피기박 구조의 경계를 좌우하는 염색체 국소화 및 부분 게놈 DNA 서열이 표시됩니다. 약어: FAW = 가을 군벌레 및 TAIL-PCR = 열 비대칭 인터레이스 PCR. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
트랜스제닉 성분을 신선한 배아로 전달하는 낮은 비율과 트랜스제너란을 신선한 배아로 전달하는 어려움은 많은 비모델 곤충, 특히 질서, Lepidoptera의 생식선 변환의 성공을 제한합니다. 세균선 변환 속도를 높이기 위해 가장 널리 사용되는 피기박 트랜스포사아제(hyPBase)의 활동적인 버전이7,10을개발하였다. 현재까지, lepidopteran 곤충의 성공적인 생식선 변환은 주로 모델 곤충 누에, 봄비스 모리(11)에보고된다. 그러나 일부 주요 농업 해충을 포함한 다른 lepidopteran 곤충에서 과기 전위 작업을 수행하는 것은 여전히 도전적입니다.
이 프로토콜을 사용하여 형질 전환 FAW 라인을 확립하는 주요 제한 및 주요 단계는 고품질 hyPBase mRNA를 합성하고 초기 배아에 피기박 전달 구성 요소를 제공하는 것입니다. 전통적인 돼지 박 시스템의 두 가지 핵심 구성 요소는 게놈에 삽입할 화물을 포함하는 기증자 플라스미드와 트랜스포지아제(12)를 제공하는 도우미 플라스미드이다. 변환 효율을 높이기 위해, 고활성 프로모터는 트랜스포지아제13,14의발현을 구동하기 위해 도우미 플라스미드에 사용된다. 이러한 프로모터는 일반적으로 모형 곤충에게서 얻어지므로, 그밖 곤충에 있는 그들의 활동은 프로모터가 확인된 종에서와 같이 높지 않을 수 있습니다. 따라서, 트랜스포사제 mRNA는 대부분의 비모델 곤충에서 생식선 변환을 향상시킬 수 있는 도우미 플라스미드보다 더 효과적입니다.
본 프로토콜에서 hyPBase mRNA는 hyPBase 발현 카세트(T7 프로모터: 폴리헤드린-5'UTR: hyPBase: 폴리헤드린-3'UTR: 폴리(A) 신호)를 포함하는 플라스미드를 생성하여 시험관내에서 제조하였다. T7 프로모터는 시판되는 mRNA 합성 키트를 사용하여 mRNA의 체외 합성을 허용합니다. 폴리헤드린-5'UTR과 폴리헤드린-3'UTR 모두 생체외에서 hyPBase mRNA의 전사를 개선하고 생체 내에서 hyPBase 단백질의 번역을 개선하는 데 도움이 될 수 있다. 폴리(A) 신호의 존재는 생체 내hyPBase mRNA의 안정성을 향상시키는 데 도움이된다. 추가적으로, 분리 세포의 제한된 수와 매우 초기 배아로 피기박 성분의 주입은 또한 생식선 세포의 돼지 박 시스템 구성 요소 선조를 제공의 기회를 개선하는 것이 중요하다. 생식선 세포에서 발생하는 전치 이벤트는 상속 될 수있다. 이 프로토콜에서, FAW 배아는 2 시간 미만의 오래된 집합되고 주입의 앞에 그들의 발달을 감속하기 위하여 얼음에 보관되었습니다. 대부분의 곤충의 경우 가능한 한 빨리 배아를 수집하고 발달을 늦출 방법을 찾는 것도 성공적인 생식선 변환에 도움이 될 수 있습니다.
곤충 트랜스제네시스에서 형광성 단백질을 사용하면 형질 전환 동물의 식별에 도움이됩니다. 본 프로토콜에서, IE1 프로모터는 lepidopteran 곤충(11)에서효율적이고 유비쿼터스 프로모터로 보고되었으며, Autographa California 멀티캡시드 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)에서 유래하여 바로 초기 유전자로, EGFP의 발현을 구동하기 위해 hr5 증강과 융합되었다. EGFP가 FAW 게놈에 삽입된 형질 전환 개인에서 EGFP 신호는 모든 단계에서 관찰될 수 있었습니다(도시되지 않은 데이터). 돼지박-매개삽입의 분자 확인은 일반적으로 남부 블롯 또는 역 PCR 및 시퀀싱에 의해 수행되었다. 이 프로토콜에서, 형질화화물내의 파편의 PCR 증폭은 형질전환 삽입을 신속하게 확인하는 데 사용되었다. 또한, PCR 기반의 고효율 TAIL-PCR 방법은 널리 사용되는 역 PCR 방법에 비해 조작하기 쉬운 형질 삽입9의통합 부위를 식별하기 위해 채택되었다. 고효율 TAIL-PCR 방법은 식물내의 형질전환 통합 현장을 식별하기 위해 개발되었다. 이 연구에서는 곤충에서 처음으로 이 방법이 사용됩니다. 제시된 프로토콜은 형질 전환 FAW를 생성하는 효과적인 방법을 제공하고 또한 많은 다른 모델 및 비 모델 곤충에 추가 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
보고된 연구는 국립 과학 재단 I/UCRC에 의해 지원됩니다, 자지동물 관리 기술 센터, 그랜트 No IIP-1821936에 따라 및 산업 파트너에 의해, 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 보조금 번호 2019-67013-29351 및 국립 식품 농업 연구소, 미국 농업의 부(2019-67019)와 미국 농농업부 (2019-67019)와 미국 농무부 (2019-67013)와 2353057000 미국 농무부 (2019-67013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
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