Summary
秋のミズ、 スポドプテラ・フルギペルダでの生殖細胞系列変換に成功し、多動 性ピギーババトランス ポザーゼのmRNAを用いて達成した。
Abstract
トランスポーザブル要素を用いた昆虫ゲノムへの遺伝貨物の安定的な挿入は、機能的ゲノム研究と遺伝的害虫管理戦略の開発のための強力なツールです。昆虫変換で最も使用されるトランスポーザ要素はピギーバクであり、ピギーバク系生殖細胞系列変換はモデル昆虫で正常に行われている。しかし、この技術を農業害虫を含む非モデル昆虫に採用することは依然として困難です。本論文は、多動性ピギーバツトランスポザーゼ(hyPBase)を用いた世界的な農業害虫、秋のミズ(FAW)、スポドプテラ・フルギペルダの生殖細胞系列転換について報告する。
この研究では、hyPBase mRNAを生成し、胚マイクロインジェクションでヘルパープラスミドの代わりに使用した。この変化は、トランスジェニックFAWの生成に成功しました。さらに、トランスジェニック動物のスクリーニング方法、トランスジーン挿入のPCRベースの迅速な検出、および熱非対称インターレースPCR(TAIL-PCR)ベースの統合部位の決定、および、インテグレーション部位の決定についても説明する。したがって、この論文は、FAWおよび他の鱗翅目昆虫における ピギーバックベースのトランスジェネシスを促進するトランスジェニックFAWを産生するプロトコルを提示する。
Introduction
秋のミミズ(FAW)、スポドプテラフルギペルダは、アメリカの熱帯および亜熱帯地域に自生しています。現在、これは世界100カ国以上で壊滅的な昆虫草食動物です。FAW幼虫は、いくつかの重要な主食作物2を含む350以上の宿主植物を供給する。FAW成人の強い移住能力は、アメリカ大陸から他の場所への最近の急速な広がりに貢献しています1,2 .その結果、この昆虫は現在、国際的に食料安全保障を脅かしています。新しい技術を適用すると、FAWの高度な研究を容易にし、この害虫を管理するための新しい戦略を提供することができます。
昆虫生殖細胞系列の形質転換は遺伝子機能を研究し、遺伝子制御3,4で使用するトランスジェニック昆虫を生成するために用いられている。昆虫の遺伝的変換を達成するために使用される様々な方法の中で、ピギーバクト元素ベースの方法は、最も使用される方法5です。しかし、転位率が低いため、非モデル昆虫のトランスジェネシスを行うことは依然として困難です。最近、ピギーバクトランスポザーゼ(hyPBase)の多動バージョンが6,7を開発した。生殖細胞系の形質転換は、最近8号機で達成されたが、これは鱗翅目昆虫にhyPBaseを使用した最初の報告である。本報告では、トランスジェニックFAWの生成におけるhyPBase mRNAの採用に関する詳細な情報が記載されている。ここで説明する方法は、他の鱗翅目昆虫の形質転換を達成するために適用することができる。
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Protocol
1. ハイプベースmRNAの インビトロ 合成
注:hyPBaseシーケンスの完全なコーディングシーケンスを合成し、pTD1-Cas9ベクターに挿入しました( 材料表を参照)、hyPBase発現カセット、T7プロモーターを含むpTD1-hyPBaseコンストラクトを生成します:ポリヘドリン-5' UTR:hyPBase:ポリヘドリン-3' UTR:ポリ(A)。pTD1-hyPBase コンストラクトの完全なシーケンスは 、補足資料に用意されています。
- インビトロ合成のためのテンプレートの調製
- 前方プライマー、5'-atgcgggtgtgaaatgcacagatg-3'、および逆プライマー5'-タガッカッグカグッタタグ3'、高忠実度ポリメラーゼ、およびpTD1-hyPBaseプラスミドを使用して、hyPBase発現カセットを増幅するPCR反応を実行します。
注:PCR反応(最終体積50 μL)には、5.0 μLの10x反応バッファーが含まれています。 4.0 μLの10 mMデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)、プラスミド1.0 μL(50 μg/μL)、1.0 μLの高忠実度ポリメラーゼ、1.0 μLそれぞれ10μM前方および逆プライマー、および33μLのヌクレアーゼを含まない水。設定は、3分間95°C、10sの98°C、15sの60°C、2分間68°Cの35サイクルの初期インキュベーションを行った。 - 新鮮なトリス酢酸エチレン酢酸(TAE)バッファーで120Vの1%アガロースゲルでPCR産物を30分間チェックし、ゲル抽出キットで製品を精製します。
注: PCR 製品の精製キットは使用しないでください。pTD1-hyPBaseプラスミドの微量であっても、 インビトロ 合成の効率が著しく低下する。
- 前方プライマー、5'-atgcgggtgtgaaatgcacagatg-3'、および逆プライマー5'-タガッカッグカグッタタグ3'、高忠実度ポリメラーゼ、およびpTD1-hyPBaseプラスミドを使用して、hyPBase発現カセットを増幅するPCR反応を実行します。
-
商用キットを用いたhyPBase mRNAのインビトロ合成
- 凍結した試薬を完全に解凍し、酵素と2倍のNTP/CAP溶液を氷上に保ち、解凍した10倍の反応バッファーを室温にしておきます。
- 2x NTP/CAP溶液:10 μLを加えて、室温で反応を組み立てます。10x反応バッファー:2 μL;テンプレートDNA:0.1-0.2 μg;酵素ミックス:2 μL;ヌクレアーゼフリー水を20μLにする。
- 混合物を上下に軽くピペット化して試薬を十分に混ぜ、37°Cで2〜4時間インキュベートします。
- 塩化リチウム沈殿による合成mRNAの回収
- 30 μLのLiCl沈殿液を加え、チューブをフリックして十分に混ぜ合わせ、-20°Cで30分間≥。
- 4°Cで最大速度で15分間遠心分離機を使用し、上清を慎重に取り除きます。
- ペレットを1mLの70%エタノールで1回洗い、再遠心分離機を使用し、上清を慎重に取り除きます。
- ペレットを室温で1〜2分間乾燥させ、20~40 μLのヌクレアーゼを含まない水でペレットを再懸濁します。
- mRNA溶液を1μLのヌクレアーゼフリー水で希釈します。2 μLを取ってmRNA濃度を決定し、8 μLを使用して、新鮮なTAEバッファーで100 Vの1%アガロースゲルのmRNA品質を40分間チェックします。
- アリコートmRNA溶液を、-70°Cで1年間冷凍保存する。
注:mRNAペレットを完全に乾燥させないでください。水に溶かすのが難しいかもしれません。
2. マイクロインジェクション
- 卵のコレクション
- 12匹のオスの子犬と12匹の雌の子犬を15cm x 15cm x 10 cmの箱に入れます。箱をペーパータオルで覆います。大人に餌を与える箱の中に10%のスクロース溶液を入れます。
- 2日目のポストエローションでは、一晩で強烈な光に成人をさらします。
- 3日目のポストエローションでは、大人をステップ2.1.2から暗い場所に移します。卵位後2時間以内に胚を収集する。
- 新鮮な卵を氷の上のペトリ皿に入れておいたペーパータオルに水を加えます。細かいブラシで卵をグラススライドにそっと移し、グラススライドの上に一つずつ揃えます。マイクロインジェクションの前に氷の上に整列した卵でガラススライドを保ちます。
- マイクロインジェクションのセットアップ
- トランスジェニック強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)発現プラスミド(200 ng/μL)、pBac:hr5ie1-EGFP-SV40、hyPBase mRNA(200 ng/μL)、無菌蒸留水を卵に注入し、自動マイクロインジェクターの補償圧力を使用します( 材料表を参照)。
- 注入した卵は27±1°C、60±10%の相対湿度で孵化するまで保管してください。
- 孵化した幼虫を人工食で食べ、初期の3番目 のインスターステージ(約6mmの長さ、体の色が黒くなる)で各幼虫を1つの小さなカップに移します。
3. 蛍光スクリーニングと遺伝子交差
- 子犬を収集し、35 cm x 35 cm x 35 cmケージに~150匹の雌の子犬と~150匹のオスの子犬を入れます。卵を集めるために、紙タオル(約30cm x 15cm)を数枚かけてケージに入れます。
- 毎日卵と一緒にペーパータオルを集め、卵を孵化するまで27±1°C、60±10%の相対湿度に保ちます。
- 新生児の幼虫を固定化するために5分間4°Cに保ち、氷冷プレートに移します。
- 蛍光体顕微鏡で固定化された新生児幼虫をスクリーニングします。EGFP陽性新生児を選択し、27±1°Cで〜2週間でプパルステージに上げ、腹側腹部のセグメントでの表現型の違いに応じて性別によって分離します。
注:女性の子犬は、8番目の腹部セグメントにスリットのような生殖器の開口部を有し、性器開口部に向かって曲がる9番目と10番目のセグメントの頭蓋マージンを有する。雄の子犬の生殖器の開口部は、9番目の腹部のセグメントにわずかな上昇を有する。 - EGFP陽性の子犬と異性の野生型の子犬を男性に入れる:ケージ内の女性比1:1。Sibは、以下の世代を生産するためにEGFP発現大人を横断する。
4. トランスジェニック挿入の PCR 検出
- 野生型およびEGFP陽性の個々の幼虫から、メーカーの指示に従って任意の市販のゲノムDNA抽出キットを使用してゲノムDNAを抽出します。
- ゲノムDNAをテンプレートとして使用してPCR反応を行う;ie1プロモーター領域にある前方プライマー、5'-acgtacgcttc-3'逆プライマー、5'-aagcactgcacgccgtcag-3'変換ベクトルのEGFP領域に位置する。
- 各PCR反応(最終体積40μL)を設定し、ポリメラーゼ混合物20μL、ゲノムDNA1.0μL(40μg/μL)、1.0 μLそれぞれ10μM順および逆プライマー、17μLのヌクレアーゼを含まない水を含みます。初期インキュベートは3分間95°C、20sは95°C、20sは56°C、40s設定では68°Cの初期インキュベーションを行います。
- 120 Vの1%アガロースゲルでPCR産物を30分間チェックします。
5. トランスジェニック挿入部位の決定
- EGFP陽性昆虫中の遺伝子導入の統合部位を決定するためのテンプレートとしてゲノムDNAを用いて高効率TAIL-PCRを行う。
- PCR反応は、他の場所で説明した手順9に従って行う。
- P1:5'-アカグガクトクタコカチカクチャク-3'、P2:5'-tcacgggctagccgactg-3'、およびP3:5'-アクトクトガクカクガッコッグcgct-3'の3つのプライマーを使用してください。
- PCR反応は、他の場所で説明した手順9に従って行う。
- 最終的な PCR 製品をシーケンスして、統合サイトを決定します。
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Representative Results
ハイPBase含有T7プロモーターの発現のための構築物:ポリヘドリン-5'UTR:hyPBase:ポリ(A)シグナルを生成し、体外でhyPBase mRNAを合成するために〜2.2kbのPCR断片として増幅した(図1B)。次いで、hyPBase mRNAを製造し、アガロースゲル電気泳動を行った。予想サイズのmRNA(約1.1kbバンド)を1%アガロースゲルで検出した(図1C)。
次いで、ピギーバックベースのEGFP発現構築物を用意した(図2A)。このプラスミドとhyPBase mRNA、またはPBS溶液の混合物を、卵位後2時間以内に胚に注入した。注射後24時間で、注入された胚においてEGFP発現の一過性シグナルが観察された。PBS注入胚はEGFPシグナル(図2B)を示さなかったのに対し、EGFP発現プラスミドおよびhyPBase mRNA注入胚はEGFP蛍光を示した(図2C)、ピギーバクの構築が成功したことを示す。したがって、hr5ie1プロモーターは、初期胚発生時に機能し得る。
約2,000個の卵が注入され、そのうち約700個が子犬に成長しました。G0の成人は自己交差し、卵を採取した。これらの卵から孵化したG1幼虫を蛍光体顕微鏡下でEGFP信号について調べた。 図3Aに示すように、トランスジェニック幼虫は強いEGFPシグナルを示した。EGFP陽性昆虫のゲノムへのEGFP発現カセットの挿入を試験するために、プロモーターおよびEGFPフラグメントを含む断片を、EGFP陽性幼虫から分離したゲノムDNAを鋳型として用いて増幅した(図3B)。この断片は、ゲノムDNAが鋳型として野生型幼虫から単離された場合には検出されなかった(図3B)。高効率のTAIL-PCRおよびPCR産物のシーケンシングを行うことで、トランスジーン挿入の集積部位を決定した。 図4に示すように、トランスジーン集積部位は、染色体26におけるTwinchin様遺伝子の81番目 のイントロンにある。
図1:hyPBase mRNAの製造(A)T7プロモーターを含むハイPBase発現カセット:ポリヘドリン-5'UTR:hyPBase:ポリヘドリン-3'UTR:ポリ(A)シグナルが構築された。(B) hyPBase mRNAを合成するための〜2.2kbのDNAテンプレートをhyPBase構築物から増幅した。左のレーンは、同じゲル上で 1 kb のラダーランを示します。(C)1.1 kbのハイプベースmRNAを増幅DNAテンプレートから合成した。左のレーンは、同じゲル上で 1 kb のラダーランを示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:注入胚におけるEGFPの発現(A)本研究で用いたピギーバクベクターの概略図(B)1x PBSを注入した胚ではEGFPシグナルは検出されなかった。(C)EGFPシグナルは、ピギーバクベクターおよびhyPBase mRNAを注射した胚で検出された。スケールバー= 50 μm略語: EGFP = 強化された緑色蛍光タンパク質およびPBS = リン酸緩衝生理食塩基。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:トランスジェニックFAW(A)の遺伝子導入型のEGFP発現の特徴は、トランスジェニックではありますが、野生型のFAW幼虫では発現しません。スケールバー=0.5mm(B)トランス遺伝子のゲノム挿入のPCR分析。プロモーターおよびEGFP領域を標的とするプライマーのペアを使用して、トランスジェニックまたは野生型FAW幼虫から分離したゲノムDNAを鋳型として使用して、約0.5kbの断片を増幅した。略語: EGFP = 強化された緑色蛍光タンパク質と FAW = 秋のミミズ.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: ピギーバクト コンストラクトのゲノム挿入 トランスジェニックFAWにおける ピギーバク コンストラクトのゲノム挿入はTAIL-PCRおよびシーケンシングによって決定した。 piggyBac 構築物の境界に隣接する染色体局在および部分ゲノムDNA配列が示されている。略語: FAW = 秋のミズおよび TAIL-PCR = 熱非対称インターレース PCR。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
転位率が低く、トランスジェニック成分を新鮮な胚に送達するのが難しいため、多くの非モデル昆虫、特に順番による生殖細胞質変態の成功が制限されます。生殖細胞系列の変換速度を高めるために、最も広く使用されているピギーババトランスポザーゼ(hyPBase)の多動バージョンが7,10を開発した。現在までに、鱗翅目昆虫における生殖細胞系列の変換が主にモデル昆虫カイコ、ボンビクスモリ11で報告されている。しかし、いくつかの主要な農業害虫を含む他の鱗翅目昆虫でトランスジェネリー作業を行うことは依然として困難です。
このプロトコルを使用してトランスジェニックFAWラインを確立する主な制限と重要なステップは、高品質のhyPBase mRNAを合成し、初期胚にピギーバクトランスポーズ成分を送達することです。従来のピギーバク系の2つのコア成分は、ゲノムに挿入される貨物を含むドナープラスミドと、トランスポザーゼ12を提供するヘルパープラスミドである。変換効率を高めるために、高活性プロモーターがトランスポザーゼ13,14の発現を駆動するヘルパープラスミドに用いられる。これらのプロモーターは通常、モデル昆虫から得られるので、他の昆虫におけるそれらの活性は、プロモーターが同定された種のように高くない場合がある。したがって、トランスポザーゼmRNAはヘルパープラスミドよりも効果的であり、これはほとんどの非モデル昆虫において生殖細胞系の形質転換を改善する可能性がある。
このプロトコルでは、hyPBase mRNAを、ハイPBase発現カセットを含むプラスミドを構築することによって インビトロで 調製した(T7プロモーター:ポリヘドリン-5'UTR:hyPBase:ポリヘドリン-3'UTR:ポリ(A)シグナル)。T7プロモーターは市販のmRNA合成キットを使用してmRNAの インビトロ 合成を可能にする。多面体-5'UTRとポリヘドリン-3'UTRの両方が 、生体内で のhyPBase mRNAの転写および 生体内でのhyPBaseタンパク質の翻訳を改善するのに役立つ可能性がある。ポリ(A)シグナルの存在は 、生体内15におけるhyPBase mRNAの安定性を高めるのに役立つ。さらに、限られた数の分裂細胞を有する非常に初期の胚への ピギーバクト 成分の注入は、生殖細胞の ピギーバクト 系成分前駆物質を送達する可能性を高めるためにも重要である。生殖細胞内で起こる転置イベントは遺伝し得る。このプロトコルでは、生後2時間未満のFAW胚を採取し、注射前に発達を遅くするために氷の上に保管した。ほとんどの昆虫にとって、できるだけ早く胚を採取し、その発達を遅くする方法を見つけることは、生殖細胞系列の変換を成功させるのにも役立つ可能性があります。
昆虫トランスジェネシスで蛍光タンパク質を使用することは、トランスジェニック動物の同定に役立ちます。このプロトコルにおいて、IE1プロモーターは、オカナカリフォルニア多カプシド核多面性多面症ウイルス(AcNPV)に由来するレピドプテラン昆虫11における効率的かつユビキタスなプロモーターであると報告されており、EGFPの発現を駆動するためにhr5エンハンサーと融合した。EGFPが一汽ゲノムに挿入されたトランスジェニック個体では、EGFPシグナルは全ての段階で観察することができた(データは示さない)。ピギーバク-媒介挿入の分子確認は、通常、サザンブロットまたは逆PCRおよびシーケンシングによって行われた。このプロトコルでは、トランスジェニックカーゴ内のフラグメントのPCR増幅を用いて、トランスジェニック挿入を迅速に確認した。また、広く使用されている逆PCR法と比較して操作が容易なトランスジェニック挿入9の集積部位を同定するために、PCRベースの高効率TAIL-PCR法を採用しました。高効率のTAIL-PCR法は、植物のトランスジェニック集積部位を同定するために開発されました。本研究では、この方法は昆虫で初めて使用されます。提示されたプロトコルは、トランスジェニックFAWを生成する効果的な方法を提供し、また、他の多くのモデルおよび非モデル昆虫にさらに適用することができる。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
報告された研究は、国立科学財団I/UCRC、節足動物管理技術センター、グラントNo IIP-1821936の下で、業界パートナー、農業・食品研究イニシアチブ競争助成金第2019-67013-29351と米国農務省(2019-67013-29 2353057000 33)と国立食品農業研究所(2019-67013-29333)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
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