Summary
Une transformation germinale réussie chez la légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda,a été obtenue en utilisant l’ARNm de la transposase hyperactive piggyBac.
Abstract
L’insertion stable de cargaisons génétiques dans les génomes d’insectes à l’aide d’éléments transposables est un outil puissant pour les études génomiques fonctionnelles et l’élaboration de stratégies de lutte génétique contre les ravageurs. L’élément transposable le plus utilisé dans la transformation des insectes est piggyBac, et la transformation germinale à base de piggyBaca été menée avec succès chez des insectes modèles. Cependant, il est toujours difficile d’utiliser cette technologie dans des insectes non modèles qui incluent des ravageurs agricoles. Cet article rend compte de la transformation germinale d’un ravageur agricole mondial, la légionnaire d’automne (FAW), Spodoptera frugiperda,en utilisant la transposase hyperactive piggyBac (hyPBase).
Dans ce travail, l’ARNm hyPBase a été produit et utilisé à la place du plasmide auxiliaire dans les microinjections embryonnaires. Ce changement a conduit à la génération réussie de FAW transgénique. En outre, les méthodes de dépistage des animaux transgéniques, la détection rapide de l’insertion de transgènes par PCR et la détermination du site d’intégration par PCR entrelacée asymétrique thermique (TAIL-PCR) sont également décrites. Ainsi, cet article présente un protocole pour produire du FAW transgénique, qui facilitera la transgénèse à base de piggyBacchez le FAW et d’autres insectes lépidoptères.
Introduction
La chenille légionnaire d’automne (FAW), Spodoptera frugiperda,est originaire des régions tropicales et subtropicales d’Amérique. Actuellement, il s’agit d’un insecte herbivore dévastateur dans plus de 100 pays à travers le monde1. Les larves de FAW se nourrissent de plus de 350 plantes hôtes, y compris d’importantes cultures vivrières de base2. La forte capacité de migration des adultes FAW contribue à sa récente propagation rapide des Amériques à d’autres endroits1,2. En conséquence, cet insecte menace maintenant la sécurité alimentaire à l’échelle internationale. L’application de nouvelles technologies peut faciliter les études avancées sur la FAW et fournir de nouvelles stratégies pour lutter contre ce ravageur.
La transformation de la lignée germinale des insectes a été utilisée pour étudier la fonction des gènes et générer des insectes transgéniques à utiliser dans le contrôle génétique3,4. Parmi les différentes méthodes utilisées pour réaliser la transformation génétique chez les insectes, la méthode à base d’éléments piggyBac est la méthode la plus utilisée5. Cependant, en raison du faible taux de transposition, il est encore difficile de procéder à la transgénèse chez les insectes non modèles. Récemment, une version hyperactive de la transposase piggyBac (hyPBase) a été développée6,7. La transformation de la lignée germinale a été réalisée dans FAW récemment8, qui est le premier rapport qui a utilisé l’hyPBase chez les insectes lépidoptères. Dans ce rapport, des informations détaillées sur l’utilisation de l’ARNm hyPBase dans la génération de FAW transgénique sont décrites. La méthode décrite ici pourrait être appliquée pour réaliser la transformation d’autres insectes lépidoptères.
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Protocol
1. Synthèse in vitro de l’ARNm hyPBase
REMARQUE: La séquence de codage complète de la séquence hyPBase a été synthétisée et insérée dans un vecteur pTD1-Cas9 (voir la table des matériaux)pour produire la construction pTD1-hyPBase, qui contient une cassette exprimant hyPBase, promoteur T7: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). La séquence complète de la construction pTD1-hyPBase est fournie dans le matériel supplémentaire.
- Préparation du gabarit pour la synthèse in vitro
- Effectuez une réaction PCR pour amplifier la cassette exprimant hyPBase à l’aide d’un apprêt avant, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', et d’un apprêt inverse 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polymérase haute fidélité et plasmide pTD1-hyPBase comme modèle.
REMARQUE: La réaction pcR (volume final de 50 μL) contient 5,0 μL de tampon de réaction 10x, 4,0 μL de triphosphate désoxynucléoside de 10 mM (dNTP), 1,0 μL de plasmide (50 μg / μL), 1,0 μL de polymérase haute fidélité, 1,0 μL chacun de 10 amorces avant et arrière et 33 μL d’eau sans nucléase. Les réglages étaient les suivants : une incubation initiale de 95 °C pendant 3 min, suivie de 35 cycles de 98 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 15 s et 68 °C pendant 2 min. - Vérifiez le produit PCR sur un gel d’agarose à 1% à 120 V dans un tampon frais d’acide tétraacétique tris-acétate-éthylènediamine (TAE) pendant 30 min et purifiez le produit avec le kit d’extraction en gel.
REMARQUE: N’utilisez pas le kit de purification du produit PCR. Même une quantité infime du plasmide pTD1-hyPBase diminue considérablement l’efficacité de la synthèse in vitro.
- Effectuez une réaction PCR pour amplifier la cassette exprimant hyPBase à l’aide d’un apprêt avant, 5'- atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3', et d’un apprêt inverse 5'- tagaggccccaaggggttatgctag-3', polymérase haute fidélité et plasmide pTD1-hyPBase comme modèle.
-
Synthèse in vitro de l’ARNm hyPBase à l’aide d’un kit commercial
- Décongelez complètement les réactifs congelés, conservez l’enzyme et 2x solution NTP/CAP sur la glace, et laissez le tampon de réaction 10x décongelé à température ambiante.
- Assembler la réaction à température ambiante en ajoutant les composants suivants : 2x solution NTP/CAP : 10 μL ; 10x Tampon de réaction: 2 μL; ADN modèle: 0,1-0,2 μg; Mélange enzymatique: 2 μL; Eau sans nucléase jusqu’à 20 μL.
- Bien mélanger les réactifs en pipetant doucement le mélange de haut en bas et incuber à 37 °C pendant 2-4 h.
- Récupération de l’ARNm synthétisé par précipitation de chlorure de lithium
- Ajouter 30 μL de solution de précipitation LiCl, bien mélanger en agitant le tube, puis maintenir à -20 °C pendant ≥ 30 min.
- Centrifugez à 4 °C pendant 15 min à la vitesse maximale et retirez soigneusement le surnageant.
- Lavez la pastille une fois avec 1 mL d’éthanol à 70 %, recentrifugez et retirez soigneusement le surnageant.
- Sécher la pastille à température ambiante pendant 1 à 2 min, puis la remettre en suspension avec 20 à 40 μL d’eau sans nucléase.
- Diluer 1 μL de solution d’ARNm avec 9 μL d’eau sans nucléase. Prendre 2 μL pour déterminer la concentration d’ARNm et utiliser 8 μL pour vérifier la qualité de l’ARNm sur un gel d’agarose à 1 % à 100 V dans un tampon TAE frais pendant 40 min.
- Aliquoter la solution d’ARNm et conserver congelé à -70 °C jusqu’à un an.
REMARQUE: Ne pas sécher complètement la pastille d’ARNm; il peut être plus difficile de le dissoudre dans l’eau.
2. Microinjection
- Collecte d’œufs
- Placez 12 nymphes mâles et 12 nymphes femelles dans une boîte de 15 cm x 15 cm x 10 cm. Couvrez la boîte avec une serviette en papier. Placez une solution de saccharose à 10% dans la boîte pour nourrir les adultes.
- Le jour 2 après l’éclosion, exposez les adultes à une lumière intense pendant la nuit.
- Le jour 3 après l’éclosion, transférez les adultes de l’étape 2.1.2 dans un endroit sombre. Prélever les embryons dans les 2 heures suivant la ponte.
- Ajoutez des gouttes d’eau sur le morceau d’une serviette en papier avec des œufs frais conservés dans une boîte de Pétri sur de la glace. Transférez doucement les œufs sur une lame de verre avec une brosse fine et alignez-les un par un sur une lame en verre. Gardez les lames de verre avec les œufs alignés sur la glace avant la microinjection.
- Configuration de la micro-injection
- Injecter un mélange d’un plasmide transgénique exprimant la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) (200 ng/ μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, ARNm hyPBase (200 ng / μL) et de l’eau distillée stérile dans les œufs, en utilisant la pression de compensation du micro-injecteur automatisé (voir la table des matériaux).
- Conserver les œufs injectés à 27 ± 1 °C, 60 ± 10 % d’humidité relative jusqu’à l’éclosion.
- Nourrissez les larves écloses avec un régime artificiel et transférez chaque larve dans une petite tasse au début du stade du3ème stade (~ 6 mm de longueur et la couleur du corps devient noire).
3. Dépistage par fluorescence et croisement génétique
- Recueillez les nymphes et placez ~150 nymphes femelles et ~150 nymphes mâles dans une cage de 35 cm x 35 cm x 35 cm. Suspendez plusieurs morceaux d’essuie-tout (~30 cm x 15 cm) dans la cage pour ramasser les œufs.
- Recueillez les serviettes en papier avec les œufs tous les jours et conservez les œufs à 27 ± 1 ° C, 60 ± 10% d’humidité relative jusqu’à l’éclosion.
- Gardez les larves de nouveau-nés à 4 °C pendant 5 min pour les immobiliser, puis transférez-les sur une plaque glacée.
- Dépister les larves de nouveau-nés immobilisés sous un stéréomicroscope à fluorescence. Sélectionnez les nouveau-nés EGFP positifs, élevez-les au stade nymphal en ~ 2 semaines à 27 ± 1 ° C et séparez-les par sexe en fonction des différences de phénotype au niveau des segments ventraux de l’abdomen.
REMARQUE: La nymphe femelle a une ouverture génitale en forme de fente sur le huitième segment abdominal et les marges céphaliques des neuvième et dixième segments se courbant vers l’ouverture génitale. L’ouverture génitale de la nymphe mâle présente une légère élévation sur le neuvième segment abdominal. - Placez les nymphes EGFP positives et les nymphes de type sauvage du sexe opposé dans un rapport mâle/femelle de 1:1 dans une cage. Sib-croiser les adultes exprimant l’EGFP pour produire les générations suivantes.
4. Détection par PCR de l’insertion transgénique
- Extraire l’ADN génomique des larves individuelles de type sauvage et EGFP positif à l’aide de tout kit commercial d’extraction d’ADN génomique en suivant les instructions du fabricant.
- Effectuer une réaction de PCR en utilisant l’ADN génomique comme modèle; un amorce avant, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttctc-3' situé dans la région promotrice ie1; et un amorce inverse, 5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3' situé dans la région EGFP du vecteur de transformation.
- Configurez chaque réaction de PCR (volume final de 40 μL) pour contenir 20 μL du mélange de polymérase, 1,0 μL d’ADN génomique (40 μg/μL), 1,0 μL chacun des amorces avant et arrière de 10 μM et 17 μL d’eau sans nucléase. Utilisez les réglages suivants : une incubation initiale de 95 °C pendant 3 min, suivie de 35 cycles de 95 °C pendant 20 s, 56 °C pendant 20 s et 68 °C pendant 40 s.
- Vérifiez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% à 120 V pendant 30 min.
5. Détermination du site d’insertion transgénique
- Effectuer une PCR TAIL à haute efficacité en utilisant l’ADN génomique comme modèle pour déterminer le site d’intégration de l’insertion du transgène chez les insectes EGFP positifs.
- Effectuer les réactions PCR en suivant les étapes décrites ailleurs9.
- Utilisez trois amorces, P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', et P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgcgct-3', qui sont spécifiques au vecteur piggyBac, dans les 3 cycles de réaction PCR, respectivement.
- Effectuer les réactions PCR en suivant les étapes décrites ailleurs9.
- Séquencez les produits PCR finaux pour déterminer le site d’intégration.
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Representative Results
Une construction pour l’expression du promoteur T7 contenant de l’hyPBase : polyhédrine-5'UTR : hyPBase : polyhédrine-3'UTR : le signal poly(A) a été généré (Figure 1A) et amplifié sous forme de fragment de PCR d’environ 2,2 kb pour synthétiser l’ARNm hyPBase in vitro (Figure 1B). Ensuite, l’ARNm hyPBase a été produit et soumis à l’électrophorèse sur gel d’agarose. L’ARNm de la taille attendue (bande d’environ 1,1 kb) a été détecté sur un gel d’agarose à 1 %(Figure 1C).
Ensuite, une construction d’expressionEGFP basée sur piggyBac a été préparée (Figure 2A). Un mélange de ce plasmide et de l’ARNm hyPBase, ou solution de PBS, a été injecté dans les embryons dans les 2 heures suivant la ponte. 24 heures après l’injection, un signal transitoire d’expression de l’EGFP a été observé dans les embryons injectés. Les embryons injectés de PBS ne présentaient pas de signal EGFP(Figure 2B),tandis que les embryons injectés de plasmide exprimant l’EGFP et d’ARNm hyPBase présentaient une fluorescence EGFP(Figure 2C),ce qui indique que la construction de piggyBac a réussi. Ainsi, le promoteur hr5ie1 peut fonctionner au début du développement embryonnaire.
Environ 2 000 œufs ont été injectés et environ 700 d’entre eux se sont transformés en nymphes. Les adultes du G0 ont été auto-croisés et des œufs ont été collectés. Les larves G1 écloses à partir de ces œufs ont été examinées pour le signal EGFP sous un stéréomicroscope à fluorescence. Comme le montre la figure 3A,les larves transgéniques ont montré un fort signal EGFP. Pour tester l’insertion de la cassette d’expression EGFP dans les génomes des insectes EGFP positifs, un fragment contenant le promoteur et le fragment EGFP a été amplifié en utilisant l’ADN génomique isolé des larves EGFP positives comme modèle(Figure 3B). Ce fragment n’a pas été détecté lorsque l’ADN génomique a été isolé des larves de type sauvage comme modèle(figure 3B). En effectuant une PCR TAIL à haute efficacité et le séquençage des produits PCR, le site d’intégration de l’insertion du transgène a été déterminé. Comme le montre la figure 4,le site d’intégration du transgène se trouve dans le 81e intron du gène de type Twinchin dans le chromosome 26.
Figure 1: Production d’ARNm hyPBase. (A) La cassette exprimant hyPBase contenant le promoteur T7 : polyhédrine-5'UTR : hyPBase : polyédrine-3'UTR : signal poly(A) a été construite. (B) Le modèle d’ADN ~2,2 kb pour la synthèse de l’ARNm hyPBase a été amplifié à partir de la construction hyPBase. La voie de gauche montre l’échelle de 1 kb sur le même gel. (C) Un ARNm hyPBase d’environ 1,1 kb a été synthétisé à partir du modèle d’ADN amplifié. La voie de gauche montre l’échelle de 1 kb sur le même gel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Expression de l’EGFP dans les embryons injectés. (A) Schéma du vecteur piggyBac utilisé dans cette étude. (B) Aucun signal EGFP n’a été détecté chez les embryons injectés avec 1x PBS. (C) Le signal EGFP a été détecté dans des embryons injectés avec le vecteur piggyBac et l’ARNm hyPBase. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : EGFP = protéine fluorescente verte améliorée et PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Caractérisation de l’expression transgénique de l’EGFP dans les larves de FAW de type transgénique mais pas chez les larves de FAW de type sauvage. Barres d’échelle = 0,5 mm. (B) Analyse PCR de l’insertion génomique des transgènes. Une paire d’amorces ciblant les régions promoteur et EGFP a été utilisée pour amplifier un fragment d’environ 0,5 kb en utilisant l’ADN génomique isolé de larves de FAW transgéniques ou de type sauvage comme modèle. Abréviations : EGFP = protéine fluorescente verte améliorée et FAW = légionnaire d’automne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Insertion génomique de la construction piggyBac. L’insertion génomique de la construction piggyBac dans la FAW transgénique a été déterminée par TAIL-PCR et séquençage. La localisation des chromosomes et les séquences d’ADN génomique partielles flanquant les limites de la construction piggyBac sont montrées. Abréviations : FAW = légionnaire d’automne et TAIL-PCR = PCR entrelacée asymétrique thermique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Matériel supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le faible taux de transposition et la difficulté d’administrer des composants transgéniques dans des embryons frais limitent le succès de la transformation de la lignée germinale chez de nombreux insectes non modèles, en particulier ceux de l’ordre, les lépidoptères. Pour augmenter le taux de transformation de la lignée germinale, une version hyperactive de la transposase piggyBac la plus utilisée (hyPBase) a été développée7,10. À ce jour, la transformation réussie de la lignée germinale chez les insectes lépidoptères est principalement rapportée dans le ver à soie modèle de l’insecte, Bombyx mori11. Cependant, il est toujours difficile de mener des travaux de transgénèse chez d’autres insectes lépidoptères, y compris certains ravageurs agricoles majeurs.
Les principales limites et les étapes clés de l’établissement d’une lignée FAW transgénique à l’aide de ce protocole sont la synthèse d’ARNm hyPBase de haute qualité et la livraison de composants de transposition piggyBac dans les embryons précoces. Les deux composants principaux du système piggyBac traditionnel sont un plasmide donneur contenant la cargaison à insérer dans le génome et un plasmide auxiliaire fournissant la transposase12. Pour augmenter l’efficacité de la transformation, des promoteurs très actifs sont utilisés dans le plasmide auxiliaire pour conduire l’expression de la transposase13,14. Comme ces promoteurs sont généralement obtenus à partir d’insectes modèles, leur activité chez d’autres insectes peut ne pas être aussi élevée que chez l’espèce à partir de laquelle le promoteur a été identifié. Ainsi, l’ARNm transposase est plus efficace que le plasmide auxiliaire, ce qui peut améliorer la transformation de la lignée germinale chez la plupart des insectes non modèles.
Dans ce protocole, l’ARNm hyPBase a été préparé in vitro en construisant un plasmide contenant la cassette exprimant hyPBase (promoteur T7 : polyhédrine-5'UTR : hyPBase : polyédrine-3'UTR : signal poly(A)). Le promoteur T7 permet la synthèse in vitro de l’ARNm à l’aide de kits de synthèse d’ARNm disponibles dans le commerce. La polyhédrine-5'UTR et la polyhédrine-3'UTR pourraient aider à améliorer la transcription de l’ARNm hyPBase in vitro et la traduction de la protéine hyPBase in vivo. La présence du signal poly (A) permet d’améliorer la stabilité de l’ARNm hyPBase in vivo15. En outre, l’injection des composants piggyBac dans les embryons très précoces avec un nombre limité de cellules en division est également essentielle pour améliorer les chances de délivrer des progéniteurs composant le système piggyBac des cellules germinales. Les événements de transposition se produisant dans les cellules germinales pourraient être hérités. Dans ce protocole, les embryons FAW âgés de moins de 2 heures ont été collectés et conservés sur la glace pour ralentir leur développement avant l’injection. Pour la plupart des insectes, la collecte d’embryons le plus tôt possible et la recherche d’un moyen de ralentir leur développement pourraient également contribuer à la réussite de la transformation de la lignée germinale.
L’utilisation de protéines fluorescentes dans la transgénèse des insectes aide à identifier les animaux transgéniques. Dans ce protocole, le promoteur IE1, qui a été signalé comme un promoteur efficace et omniprésent chez les insectes lépidoptères11, dérivé du gène précoce immédiat de la polyédrose nucléaire multicapside Autographa california (AcNPV), a été fusionné avec l’amplificateur hr5 pour stimuler l’expression de l’EGFP. Chez les individus transgéniques chez lesquels l’EGFP a été inséré dans le génome de la FAW, le signal de l’EGFP a pu être observé à tous les stades (données non présentées). La confirmation moléculaire de l’insertion médiée par piggyBacétait généralement effectuée par transfert de Southern ou PCR inverse et séquençage. Dans ce protocole, l’amplification par PCR d’un fragment dans la cargaison transgénique a été utilisée pour confirmer rapidement l’insertion transgénique. En outre, une méthode TAIL-PCR à haute efficacité basée sur la PCR a été utilisée pour identifier le site d’intégration de l’insertion transgénique9, qui est facile à manipuler par rapport à la méthode de PCR inverse largement utilisée. La méthode TAIL-PCR à haut rendement a été développée pour identifier les sites d’intégration transgénique dans les plantes. Dans cette étude, cette méthode est utilisée pour la première fois chez les insectes. Le protocole présenté fournit un moyen efficace de générer un FAW transgénique et pourrait également être appliqué à de nombreux autres insectes modèles et non modèles.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
La recherche rapportée est soutenue par la National Science Foundation I / UCRC, le Center for Arthropod Management Technologies, sous le numéro de subvention IIP-1821936 et par des partenaires de l’industrie, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 et le National Institute of Food and Agriculture, DÉPARTEMENT DE L’Agriculture des États-Unis (2019-67013-29351 et 2353057000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
