Summary
생체 내 Förster 공명 에너지 전송 측정을 위한 표준 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 설정하고 데이터 평가를 위한 프로토콜이 제공됩니다.
Abstract
감미화 된 방출 기반 Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 실험은 쉽게 수행되지만 미세한 설정에 의존합니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경은 생물학자를위한 주력이되었다. 상용 시스템은 레이저 전력 조정 및 검출기 감도에서 높은 유연성을 제공하며 종종 다른 검출기를 결합하여 완벽한 이미지를 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 유연성으로 인해 다양한 실험 및 설정에서 강도 기반 데이터를 비교하는 것은 종종 불가능합니다. 생물학자 친화적 인 절차는 장점이며 레이저 및 검출기 설정을 간단하고 신뢰할 수있는 조정할 수 있습니다.
더욱이, 살아있는 세포에 있는 FRET 실험은 단백질 발현 및 기증자 수용자 비율에 있는 가변성에 의해 영향을 받기 때문에, 단백질 발현 수준은 데이터 평가를 위해 고려되어야 합니다. 여기에 설명된 단백질 발현 및 레이저 강도 및 검출기 설정 조정을 위한 루틴을 포함하여 안정적이고 재현 가능한 FRET 측정을 위한 간단한 프로토콜이 있습니다. 데이터 평가는 알려진 FRET 효율의 불소 융합으로 교정에 의해 수행됩니다. 단순성을 향상시키기 위해, 교정 요인은 세포에서 그리고 재조합 형광 단백질을 측정해서 얻어진 비교되었습니다.
Introduction
Förster 공명 에너지 전송 (((F)RET)는 전형적으로 형광 분광법에 의해 관찰되지만, 공정 자체는 형광류 사이에서 발생하는 것으로 제한되지 않는다. 기본 이폴-이폴 커플링은 단순히 발광 기증자 분자와 빛을 흡수하는 수용자가 필요합니다. 이는 정규화된 기증자 방출 및 수용자 흡광도 스펙트럼의 필수 스펙트럼 중첩 일체형 J로부터 유래된다. 그러나 RET는 형광과 경쟁하기 때문에, 에너지 전달은 형광 방출의 변경에 의해 측정될 수 있게 됩니다: RET는 기증자의 담금질 및 감안기 방출을 유도합니다.
형광소 기반 RET는 생물 발광 공명 에너지 전달 (BRET)에서 분리하기 위해 형광 공명 에너지 전송 (FRET)이라고합니다. RET는 0.5-10 nm2 의 범위에서 널리 퍼져 있는 기증자와 수용자 사이의 거리에 크게 의존하며, 따라서 단백질과 그 복합체의 치수와 동일한 범위에서. 둘째, RET는 이폴-이폴 방향 카파 제곱에 의존한다. 단백질 에 바인딩된 형광의 회전적 자유가 분자량과 느린 회전 이완으로 인해 소홀히 할 수 있다는 사실과 결합된 RET는 형태 적 변화의 분석을 허용합니다3.
소위 Förster 반경은 스펙트럼 중첩 일체형과 겹침의 파장 범위를 기반으로하므로 적색 광 흡수 크로모포레스는 청광 흡수 염료보다 Förster radii가 더 길어집니다. FRET 측정의 동적 범위는 R0과 1.× 5 × R0으로 제한되기 때문에 FRET 쌍 ECFP-EYFP는 4.9 nm4의 R0으로 인해 2.5-7.3 nm의 동적 범위를 가지고 있습니다.
불소화의 밝기는 어금니 멸종 계수와 양자 수율의 제품에 의해 제공됩니다. FRET 측정의 경우 거의 유사한 밝기의 형광을 선택하는 것이 유리합니다. 이것은 기증자 담금질 및 감질된 수용자 방출의 탐지를 향상시킵니다. 또한 현미경 시스템의 교정을 선호합니다. 자주 사용되는 FRET 쌍의 시안 및 형광 단백질을 살펴보면 시안 형광 단백질의 낮은 밝기가 명백해집니다(그림 1A).
그러나 수용자의 수명은 기증자의 수명보다 낮아야 하며, 에너지 전달을 위한 수용자의 가용성을 보장해야 합니다. 수락자의 수명이 기증자의 수명을 초과하는 경우, 기증자가 다시 흥분할 때 수락자는 여전히 흥분 상태에있을 수 있습니다. mTurquoise와 같은 고급 시안 형광 단백질은 수명이 연장되어 FRET의 증가 확률에 기여합니다(그림1B). FRET의 확률은 또한 수용자의 어금니 소멸 계수에 따라 달라집니다.
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Protocol
참고: 다음 프로토콜의 경우 이전에 설명된 바와 같이 프토플라스트의 일시적인 과도 전환이 수행되었습니다12. 아래에 간단한 설명이 제공됩니다.
1. 프토플라스트의 일시적인 전환
- 아라비도시스 탈리아나 에코타입 컬럼비아의 건강한 잎 ~4 g을 1mm 슬라이스로 자르고 효소 용액 20mL로 옮기십시오 (1.5 % 셀룰라아제; 0.4% 마메로지메; 0.1% 소 세럼 알부민 분수 V; 0.4 M 매니톨; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-morpholino)에탄설포닉산(MES), pH 5.7; 10mM CaCl2).
- 잎 조각을 진공 침수한 다음 실온에서 2 시간 동안 교반되는 배양이 뒤따릅니다. 100 × g에서 3 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 수확하십시오.
- W5 솔루션(154m NaCl; 125m CaCl2; 5mM KCl; 2mM MES, pH 5.7)으로 프토플라스트를 세척하고 MMG 솔루션(0.4M Mannitol; 15m M MgCl2; 4mM MES, pH 5.7)으로 재보선합니다.
- 폴리에틸레네글리콜(PEG) 4000의 존재시 삼투성 쇼크에 의한 8웰 슬라이드에서 트랜스페션을 수행한다. 프토플라스트 서스펜션의 20 μL을 플라스미드 DNA 5μL(5 μg/μL) 및 PEG 용액 25μL(0.2M 매니톨, 0.1 M CaCl2, 40% PEG 4000)과 혼합합니다.
- 삼투압 조건의 부드러운 재조정에 의해 삼투압 쇼크를 반전.
참고 : 관심샘플 외에도 기증자와 수락자의 표현만으로도 기증자와 수용자의 스펙트럼 출혈을 각각 결정해야 합니다. 기증자와 수용자의 융합 단백질은 교정 목적으로도 표현되어야 합니다. 형광 단백질 발현은 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(pCaMV35S)의 통제하에 있었다. 모든 측정에 대해, 두 개의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (LSM1 및 LSM2)이 사용되었다. LSM1에는 FRET 측정을 위해 기증자 신호가 GaAsP 검출기에 의해 감지되었으며 FRET 및 수용자 방출은 광증으로 기록되었습니다. LSM2에는 기증자, FRET 및 수용자 방출의 검출에 사용되었던 두 개의 광증증이 있습니다.
2. 레이저 조정
참고: 여기서, 아르곤 이온 레이저의 458nm 및 514 nm 라인은 향상된 시안 형광 단백질 (ECFP)-및 향상된 노란 형광 단백질 (EYFP) 표지 단백질 사이 FRET 분석을 위해 적용되었습니다. 재현 가능한 데이터 수집의 경우 두 줄이 비슷한 강도로 조정되었습니다. 이는 전송 광승화 또는 반사 모드에 의해 달성되었다.
- 전송 광증으로 레이저 조정
- 조정을 위해 빈 우물을 사용합니다.
- 라인 스캐닝 모드와 히스토그램 뷰를 선택합니다.
- 레이저 강도를 최소한으로 줄이고 검출기 게인을 감지 가능한 배경 소음으로 조정합니다.
- 0.5%의 단계로 레이저 강도를 높이고 해당 신호를 기록합니다.
- 두 레이저 라인에 대한 루틴을 적용합니다.
- 반사 모드로 레이저 조정
- 조정을 위해 빈 우물을 사용합니다.
- 리플렉션 필터를 적용하고, 사용 가능한 경우 반사 모드를 켭타리모드로 전환합니다.
- 검출기 파장 범위가 레이저의 파장을 커버해야 합니다.
- 라인 스캐닝 모드와 히스토그램 뷰를 선택합니다.
- 레이저 강도를 최소한으로 줄이고 검출기 게인을 감지 가능한 배경 소음으로 조정합니다.
- 목표를 가장 낮은 위치로 이동합니다.
- 커버슬립의 반사가 표시될 때까지 목표를 위로 이동합니다.
- 0.5%의 단계로 레이저 강도를 높이고 해당 신호를 기록합니다.
- 두 레이저 라인에 대한 루틴을 적용합니다.
- 데이터 평가
- 데이터를 타부레이트하고 신호 강도로 데이터를 정렬합니다.
- 상대 레이저 전력에 대한 신호 강도를 플롯합니다.
- 유사한 신호 강도를 초래하는 레이저 강도를 선택합니다.
3. 광증의 조정
참고: 레이저 조정 후, 광증증은 유사한 감도를 얻기 위해 개별 이득으로 조정되었습니다. 이 교정은 관심의 파장 범위의 중심에있는 514 nm 레이저 라인으로 수행되었다.
- 조정을 위해 빈 우물을 사용합니다.
- 리플렉션 필터를 적용하고 사용 가능한 경우 반사 모드로 전환합니다.
- 검출기 파장 범위가 레이저(514nm)의 파장을 커버해야 합니다.
- 라인 스캐닝 모드와 히스토그램 뷰를 선택합니다.
- 검출기 게인을 최대값의 절반으로 줄이고 레이저 강도를 감지 가능한 배경 소음으로 조정합니다.
- 목표를 가장 낮은 위치로 이동합니다.
- 커버슬립의 반사가 표시될 때까지 목표를 위로 이동합니다.
- 50~ 100V 단계로 검출기 게인을 늘리고 해당 신호를 기록합니다.
- 두 검출기모두에 대해 3.1~ 3.8단계를 적용합니다.
- 데이터 평가
- 각 검출기에 대한 검출기 게인에 대한 강도를 플롯합니다.
- 개별 검출기 이득을 선택하여 유사한 감도를 얻습니다.
4. FRET 이미지 수집
참고: 이미지 수집 을 설정하기 위한 관심 샘플부터 시작합니다.
- FRET 쌍 ECFP/EYFP에 대한 이중 이분해성 미러 MBS 458/514와 같은 적절한 필터/이색 거울을 선택합니다. 모든 채널에 동일한 이차 미러를 사용하여 라인별 스캐닝을 활성화합니다. 살아있는 세포의 화상 진찰을 위한 물 침수 목표를 선택하십시오. 12비트 또는 16비트 스캐닝과 적당한 스캐닝 속도를 선택합니다.
- ECFP/EYFP의 경우 기증자 검출을 위한 검출 범위, 바람직하게는 470-510 nm 및 530-600 nm의 수용자/FRET 검출을 정의한다. 445nm 또는 440 nm 다이오드 레이저를 사용하는 경우 450 nm에서 510nm를 검출 범위로 사용하십시오. 아쿠스토 광학 빔 스플리터(AOBS)의 경우 원치 않는 수용자 감지를 방지하기 위해 450~500nm 범위에서 기증자 검출을 정의한다.
- 3.10.2에 따라 검출기 설정을 적용합니다.
- 2.3.2에 따라 레이저 설정을 적용합니다. 필요한 경우 얻어진 레이저 파워 테이블에 기초하여 레이저 강도를 수정합니다. 신호 대 잡음 비율이 검출기의 전체 동적 범위(12비트 스캐닝의 경우 0에서 4095사이의 강도)를 커버해야 합니다.
- 레이저 강도를 유지하고 검출기는 일정하게 얻을 수 있습니다. 핀홀 직경을 미세 조정에 사용합니다.
참고: 핀홀 직경의 변화는 공간 해상도에 영향을 미칩니다. - 측정을 수행합니다(20개 이상의 셀의 이미지를 가져 가라).
5. 크로스토크 수정 결정
참고: 기증자 또는 수용자만 표현하는 세포는 각각 기증자 스펙트럼 출혈(DSBT) 및 수용자 스펙트럼 출혈(ASBT)을 결정해야 합니다. 섹션 4에 설명된 동일한 설정을 유지합니다.
- 기증자 불소호를 표현하는 세포로 FRET 측정을 수행합니다.
- 수용자 불소호를 발현하는 세포로 FRET 측정을 수행합니다.
6. 비밀러 외.13에 따른 측정 의 교정
참고: 알려진 FRET 효율의 기증자 수용자 융합을 표현하는 세포가 필요합니다. 여기서, 0.46의 FRET 효율을 가진 ECFP-5 aa-EYFP 융합이 사용되었습니다4. 섹션 4에 설명된 동일한 설정을 유지합니다.
- 기증자 수용자 융합을 표현하는 세포로 FRET 측정 수행
7. 데이터 평가
- 각 프로파일에 두 개의 셀이 하나 이하의 셀을 포함하지 않도록 셀의 선 프로파일을 가져옵니다. 프로필을 텍스트 파일로 저장합니다.
- 데이터 섹션의 텍스트 파일 가져오기 옵션을 사용하여 텍스트 파일을 스프레드시트로 가져옵니다.
- Max 함수를 적용하여 최대 값을 읽어보십시오.
- 표에 획득한 값을 나열하고, 기증자 배출 ID, FRET 배출 IF, 수용자 방출 IA 및 최소 4개의 데이터 세트에 대한 각각의 컬럼이 있습니다: 기증자 전용, 수락자 만, 기증자 수용자 융합 및 측정.
참고: 기증자의 흥분은 또한 수용자의 직접적인 흥분을 초래하고 α 값에 의해 설명되는 ASBT를 일으키는 원인이 됩니다. - 방정식(1)을 사용하여 허용자 전용 데이터 집합을 사용하여 ASBT α 값을 계산합니다.
(1)
참고: 다음 방정식에서 모든 α 값의 중앙값을 사용합니다. 기증자는 수용자의 감응 방출과 방출 크로스토크를 초래하는 광범위한 방출 스펙트럼을 보여줍니다. 이 DSBT는 β 값에 의해 제공됩니다. - 방정식(2)을 사용하여 기증자 전용 데이터 집합을 사용하여 기증자 스펙트럼 출혈 β 값을 계산합니다.
(2)
참고: 다음 방정식의 모든 β 값의 중앙값을 사용합니다. 교정 계수는 ξ FRET 유래 기증자의 선형 관계를 설명하고 수용자의 민감 방출을 민감화합니다. 다음 방정식에서 7.5 및 7.6의 중앙값을 사용합니다. - 기증자-수용자 융합 데이터 집합과 수학식(3)을 사용하여 FRET 효율 E(0.46)를 사용하여 ξ 교정 계수를 계산합니다.
(3)
참고: 다음 방정식의 모든 ξ 값의 중앙값을 사용합니다. - 수학식(4) 및 (5)를 사용하여 관심 있는 단백질 쌍의 FRET 효율성을 계산합니다.
(4)
(5) - 표현력 및/또는 기부자 수용률의 효과를 추정합니다: FRET 효율성에 대하여 ID, IF 및 IA 의 합을 플롯합니다. 선형 회귀를 수행합니다. 그래프가 가파르고 R2 가 높을수록 발현 레벨의 영향이 높거나 기증자와 수용자의 차이가 더 크다.
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Representative Results
공초점 레이저 스캐닝 현미경의 조정
레이저 조정은 레이저 강도가 증가함에 따라 방출의 선형 증가를 드러냈다(그림 2 및 표 1). 아르곤 이온 레이저에 대 한 예상 대로, 514 nm 라인의 방출 458 nm 라인의 방출 보다 훨씬 높은 458 nm 라인의 방출, 가파른 경사에 의해 입증. 후속 실험의 경우, 레이저 전력은 각각 4.5%와 6.5%로 514nm 라인과 458nm 라인에 선택되었다. 그 결과 1123(514nm)과 1141(458nm)의 거의 동일한 방출 강도가 발생했습니다.
일정한 레이저 전력에서 검출기 이득을 변화면 분석된 두 검출기 모두에 대한 기하급수적 동작이 밝혀졌습니다. 유사한 방출 강도는 700 V의 이득을 위해 수득되었다(도 3). 레이저 라인의 조정은 선형 동작의 이점을 얻었지만 검출기의 조정은 기하급수적 동작의 영향을 받을 수 있으므로 더 높은 전압에서 게인이 약간 변경되어 현저한 차이가 발생할 수 있습니다. 불행히도, 레이저 전력을 늘리는 것은 세포 독성이 있고 광표백을 촉진하기 때문에 이 높은 범위는 살아있는 세포에서 측정에 관심이 있습니다.
스펙트럼 출혈 을 결정
처음에, 기증자와 수용자의 스펙트럼 출혈-스루는 재조합 정제 된 ECFP 및 EYFP로 분석되었다; DSBT β = 0.498 및 ASBT α = 0.100. ECFP 또는 EYFP를 발현하는 세포도 마찬가지였다. LSM 2의 경우 예상 DSBT는 β 0.207(평균 ± SD)± 1.602 =0.602± ASBT는 0.018± 0.018로 α. 중앙값은 β = 1.506 및 α = 0.120이었습니다. 살아있는 세포에서 얻은 데이터와 재조합 단백질로 얻은 데이터 사이의 이러한 불일치는 살아있는 세포에서 스펙트럼 출혈의 결정을 생략하는 것이 불가능하다는 것을 보여줍니다. 이것은 세포 안료에 기인할 가능성이 있습니다.
이미지는 ECFP에 비해 EYFP의 높은 밝기를 보여줍니다 (그림 4 및 표 2). 서로 다른 레이저 설정에 의해 밝기의 차이를 보상기증자와 FRET 채널의 동적 범위를 향상시킵니다. 조정에 대해 수행한 것처럼 레이저 강도를 측정하여 상대적 출력을 제공하면 측정의 재현성이 증가합니다.
LSM 1의 경우, β = 0.171 ± 0.044, α = 0.094 ± 0.031 α = 0.084 및 β = 0.180. ASBT의 결정은 레이저 조정 및 단일 검출기에 따라 달라지므로 ASBT의 결정이 잘 수행되었습니다. DBST는 두 개의 검출기를 포함, 두 현미경에 대 한 크게 다른 결과 결과. LSM 2에는 두 개의 광증증이 장착되어 있는 반면 LSM 1에는 GaAsP 검출기와 광증, 서로 다른 스펙트럼 특성과 감도가 있는 두 가지 유형의 검출기를 사용합니다. 따라서 두 개의 동일한 검출기로 조정이 더 잘 작동합니다.
측정 의 교정
보정을 위해 α 및 β 중앙값이 적용되었고 ECFP 및 EYFP의 융합을 알려진 FRET 효율(E = 0.46)의 표준으로 사용하였다. 재조합 및 정제 된 ECFP-EYFP의 교정은 13.44의 ξ 값을 초래했으며 생체 내 측정은 1.525 ± 1.844의 ξ 값을 밝혔습니다. 중앙값은 0.798로, 높은 표준 편차와 함께 극단적인 이상값을 드러냈습니다. LSM 1의 경우 값은 ξ = ξ = 1.883의 중앙값이 있는 0.807± 1.978이었다. LSM 2 및 LSM 1의 경우 ξ(표 3)의 계산을 위해 얻은 데이터 집합은 학생의 t-test(p > 0.2)에서 입증한 통계적으로 동일했습니다.
FRET 측정
개념의 증거로서, FRET 측정은 기증자 수용자 융합과 함께 반복되었다. 측정된 FRET 효율은 정제단백질의 경우 0.47± 0.07, LSM 2를 가진 살아있는 세포에서 0.47 ± 0.06(표 4)이었다. 살아있는 세포에서 측정의 중앙값은 E = 0.45이었다. LSM 1의 경우 FRET 효율은 0.46 ± 0.09로 E = 0.45(표 4)의 중앙값이 있었습니다. 이러한 데이터는 알려진 FRET 효율의 FRET 구조로 효과적인 교정을 보여줍니다.
발현 수준 및 기증자 수용자 비율의 효과
분석된 데이터 집합의 경우 FRET 효율성은 식 수준에 영향을 받지 않았습니다. 기증자와 수용자의 융합으로 인해 비율도 일정했습니다. 이전 데이터 집합을 포함하여 한 경우식 수준에 대한 종속성을 드러냈습니다(그림 5). 라벨이 부착된 바쿠올라 ATPase(V-ATPase) 서브유닛, VHA-A-ECFP 및 VHA-a-EYFP 간의 FRET 효율은 신호 강도 증가로 감소했습니다. 대조적으로, VHA-E1-ECFP와 VHA-C-EYFP 사이의 상호 작용은 신호 강도와 무관했다. VHA-A 및 VHA-a의 경우, VHA-A의 3개 사본은 VHA-A-ECFP로 점점 대체되어, 이는 단지내 VHA-a의 단일 사본과 비교하여 기증자의 과잉을 초래합니다. VHA-E1은 세 개의 사본 형태로 존재할 수 있지만 VHA-C의 높은 용해도는 이 예제에서 이 효과를 폐지할 수 있습니다. 여기서 FRET 효율성은 비교적 낮습니다. 이 간단한 방법을 사용하면 표현식 및 비율 아티팩트를 테스트할 수 있습니다.
그림 1: 형광 단백질 FRET 쌍과 시안 방출 기증자의 개요. (A) 쌍의 Förster 반과 기증자와 수용자의 밝기는 잘 특징인 FRET 쌍을 위해 주어집니다. (B) 기증자 및 수락자 수명 비교. 회색 별표는 다수 지수 붕괴를 나타냅니다. 약어: FRET = Förster 공명 에너지 전송; CFP = 시안 형광 단백질; GFP = 녹색 형광 단백질; YFP = 황형 단백질; mX = 단조록 X; EX = 향상된 X; SX = 슈퍼 X. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 레이저 조정. 레이저의 방출은 커버슬립의 반사에 의해 기록되고 LSM의 수반광학 튜닝 필터에 의해 변조되는 상대 레이저 강도에 대하여 플롯되었다. 아르곤-이온 레이저의 458nm 라인(A)과 514nm 라인(B)의 방출이 도시된다. 약어: LSM = 레이저 스캐닝 현미경; r.u. = 상대 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 검출기 게인 및 방출 강도. 결과 방출 강도는 검출기 1(A) 및 검출기 2(B)에 대해 각각 300에서 750 V 및 750 V까지 검출기 이득을 위한 반사 모드로 기록되었다. 약어 = r.u. = 상대 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 스펙트럼 출혈 이미지는 기증자, FRET 및 수락자 채널에서 얻어졌습니다. (A) 정제형 형광 단백질로 얻은 이미지; 스케일 바 = 100 μm; (b) 형광 단백질을 발현하는 세포에 대한 대응 이미지; 배율 막대 = 10 μm. (C) 획득된 SBT 값의 그래프; sD에 ± 의미합니다. 약어: FRET = Förster 공명 에너지 전송; SBT = 스펙트럼 출혈 을 통해; ECFP = 향상된 시안 형광 단백질; EYFP = 향상된 황형 단백질; LSM = 레이저 스캐닝 현미경; ASBT = 수락자 SBT; DSBT = 기증자 SBT. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 발현 수준 및/또는 기부자 수용자 비율의 효과입니다. 기증자, FRET 및 수락자 채널의 배출량합계는 FRET 효율성에 반하는 음모를 꾸몄습니다. 이는 VHA-E1-ECFP 및 VHA-C-EYFP(A), VHA-A-ECFP 및 VHA-A-EYFP(B), ECFP-EYFP 융합(C)에 대해 수행되었습니다. 선형 회귀가 수행되었습니다. 방정식과 R2 가 제공됩니다. 약어: FRET = Förster 공명 에너지 전송; ECFP = 향상된 시안 형광 단백질; EYFP = 향상된 황형 단백질; VHA = vacuolar ATPase 하위 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: ECFP 및 EYFP의 기증자 및 수락자 출혈 형광 단백질의 스펙트럼은 FP 데이터베이스14로부터 얻어졌다. (A) 감과 감이 있는 배출 실험 중에, 기증자와 수용자의 광대 한 부분은 각각 PMT1 및 PMT2라는 개별 광증에 의해 검출된다. ECFP 방출은 또한 458 nm와 여기시 수용자 검출기에 의해 검출될 수 있다. PMT2로 계산된 기증자 스펙트럼 출혈은 PMT1에 의해 검출된 방출의 40.6%입니다. (B) EYFP의 방출 스펙트럼은 EYFP가 시안 기증자의 여기를 자주 적용하는 458 nm에서 직접 여기를 나타낸다는 것을 보여줍니다. 예상 흥분 효율은 514 nm에서 흥분의 9.6 %입니다. 약어: FP = 형광 단백질; ECFP = 향상된 시안 형광 단백질; EYFP = 향상된 황형 단백질; PMT = 광증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 레이저 전력 및 신호 강도. 458nm 라인의 신호 강도는 파란색으로 주어지며, 그린514 nm 라인의 신호 강도가 주어집니다. 실험에 적용된 강도는 회색으로 강조 표시됩니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: SBT 판정을 위한 신호 강도. 기록된 최대값과 계산된 α 및 β 값이 부여됩니다. 약어: SBT = 스펙트럼 출혈 을 통해; LSM = 레이저 스캐닝 현미경; FRET = Förster 공명 에너지 전송; ASBT = 수락자 SBT; DSBT = 기증자 SBT. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 교정을 위한 신호 강도. 기록된 최대값과 계산된 ξ 값이 주어집니다. 보정된 값은 SBT를 뺀 FRET 신호 강도에 해당합니다. 약어: SBT = 스펙트럼 출혈 을 통해; LSM = 레이저 스캐닝 현미경; FRET = Förster 공명 에너지 전송. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: FRET 측정을 위한 신호 강도. 기록된 최대값과 E 값이 제공됩니다. 보정된 값은 SBT를 뺀 FRET 신호 강도에 해당합니다. 보정된 E 값은 ξ 보정하여 계산되었습니다. 약어: SBT = 스펙트럼 출혈 을 통해; LSM = 레이저 스캐닝 현미경; FRET = Förster 공명 에너지 전송; cal. = 보정. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기증자 담금질 및 민감 감응수용자 방출은 FRET의 기증자 또는 수용자 기반 계산을 허용하는 선형 관계가 특징입니다. 선형의 해당 요소는 상호 값4인 G 계수(기증자를 수락자)또는 xi(기증자에 대한 수락자)라고 합니다. 형광 현미경 검사법에 의한 형광 단백질 사이의 FRET를 측정하려면 형광 단백질의 광범위한 흡수 및 방출 스펙트럼으로 인해 DSBT 및 ASBT에 대한 교정이 종종 필요합니다. 그러나, 많은 수정은 측정 가능한 ASBT에 의존, 이는 프로토콜 섹션에서 방정식의 분모의 요인입니다 7, α = 0 정의되지 않은 방정식의 결과5,6.
이러한 효과를 피하기 위해 레이저 강도의 조정을 하는 것이 좋습니다. 이를 통해 수락자 기반 계산을 사용하고 부적절한 기부자 수용자 비율을 쉽게 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, Beemiller 및 동료의 방정식이 적용되어 알려진 FRET 효율의 단일 참조 구조에 의해 간단한 교정의 이점이 있습니다. 검출기의 조정은 특히 두 가지 유형의 검출기가 적용되는 경우에 매우 중요합니다. 두 개의 동일한 광증증과 동일한 이득으로 얻은 이전 데이터는 수년 동안 여러 실험에 대해 일정한 β = 0.61의 결과이며 검출기 조정이 재현성에 유리하다는 것을 입증했습니다. 검출기가 신뢰할 수 있는 조정을 허용하지 않는 경우 프레임별 모드에서 단일 검출기가 있는 순차 검사는 검출기 특성의 바이어스를 방지하는 옵션이 될 수 있습니다.
식물 세포에 있는 측정은 흥분 광 흡수 및 배경 자동 형광 귀착되는 많은 안료에 의해 영향을 받습니다. 셀룰러 안료는 주로 UV에서 파란색 범위4,10에 빛에 의해 흥분된다. 이것은 세포에 있는 측정과 정제한 단백질을 가진 그들 사이 불일치를 설명합니다. 정제된 단백질은 ASBT α 및 DSBT β 대한 예상 값이 각각 수용자 흡수 스펙트럼 및 기증자 방출 스펙트럼으로부터 도출될 수 있기 때문에 조정의 증거로 작용할 수 있다(도 6). ASBT의 값은 세포(α = 0.094)와 정제형 형광(α = 0.114)과 유사하며 514 nm에서 낮은 세포 흡수로 인해 0.096의 예상 값에 가깝습니다. 정제된 단백질을 가진 β = 0.498의 DSBT는 또한 0.406의 예상 값에 가깝습니다. 스펙트럼 출혈을 통해 추가 설정에 따라 달라집니다; 445 또는 440 nm의 다이오드 레이저는 EYFP의 직접 여기를 감소시켜 ASBT를 감소시다. AOBS는 이색 거울보다 더 작은 전송 갭을 특징으로합니다. 따라서 EYFP의 검출은 500~510nm 범위에서 향상되고 기증자 채널에 추가 ASBT가 발생할 수 있다. 그러나 EYFP의 스펙트럼 특성은 덜 효과적인 여기와 저공해 강도를 모두 고려하여 최대 피크의 1% 미만의 방출을 가리킵니다. 필터 간격은 이색 거울로 훨씬 넓어지므로 이러한 수용자 크로스토크가 추가로 억제됩니다.
정제 된 단백질의 값을 사용하는 것은 세포의 상황을 반영하지 않습니다. 요인에 의한 보정ξ 도 마찬가지입니다. 교정 계수는 LSM 모두에 대해 유사하지만, 재조합 단백질을 가진 측정에서 훨씬 더 높았으며 세포 안료의 영향을 드러냈습니다. 이러한 측정에서 배경 잡음은 무시할 수 있지만 감지할 수 있으며 관찰된 강도에 영향을 미치지 않았다는 점을 언급해야 합니다. 기증자 수명 측정과는 달리, 감관된 방출 실험은 기증자 수용자 비율에 민감하여 기증자의 과잉이 FRET 효율을 감소시도록 합니다.
그러나, 단백질 발현은 본 실험에서 CaMV35S-프로모터의 통제하에 있다. 이 프로모터는 식물에 있는 단백질의 과발현을 위해 자주 이용되고 단백질의 비생리적으로 높은 양이 귀착될 수 있습니다13. 이러한 조건에서, 상호 작용의 확률이 증가하고, 거짓 양성 결과는 더 높은 단백질 농도로 생길 수 있습니다. FRET 효율에 대한 방출 강도를 플로팅하면 방출 강도가 증가하여 FRET 효율이 증가하고 발현 수준에 대한 FRET 데이터를 평가할 수 있습니다.
고해상도 지역화 실험을 FRET 측정과 분리하는 것이 좋습니다. 공존을 위해 각 불소에 대해 최적의 설정이 선택되며, FRET 기록, 방출 강도 및 핀홀 직경에 의한 미세 조정은 최적의 이미지 조건을 방해합니다. 그럼에도 불구하고, 세포기관의 분리와 세포 전 세포 구조에 대한 정보는 여전히 FRET 측정에 포함됩니다.
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Disclosures
우리는 모든 저자가 이해 관계의 모든 충돌을 공개하고 경쟁 금융 이익이 없는지 확인합니다.
Acknowledgments
실험은 생물학 학부의 빛 현미경 기술 플랫폼 (LiMiTec)에서 수행되었다, 빌레펠트 대학. 이 작품은 빌레펠트 대학에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
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