Summary
Предусмотрен протокол для установки стандартного конфокального лазерного сканирующего микроскопа для измерений резонансной передачи энергии in vivo Förster с последующей оценкой данных.
Abstract
Эксперименты с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET) на основе сенсибилизированного излучения легко выполняются, но зависят от микроскопической установки. Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы стали рабочей лошадкой для биологов. Коммерческие системы обеспечивают высокую гибкость в регулировке мощности лазера и чувствительности детектора и часто объединяют различные детекторы для получения идеального изображения. Однако сравнение данных, основанных на интенсивности, из разных экспериментов и установок часто невозможно из-за этой гибкости. Удобные для биологов процедуры являются преимуществом и позволяют легко и надежно настраивать настройки лазера и детектора.
Кроме того, поскольку эксперименты FRET в живых клетках зависят от изменчивости экспрессии белка и соотношения донор-акцептор, для оценки данных необходимо учитывать уровни экспрессии белка. Здесь описан простой протокол для надежных и воспроизводимых измерений FRET, включая процедуры оценки экспрессии белка и регулировки интенсивности лазера и настроек детектора. Оценка данных будет проводиться путем калибровки с флуорофорным слиянием известной эффективности FRET. Для повышения простоты сравнивались поправочные коэффициенты, полученные в клетках и путем измерения рекомбинантных флуоресцентных белков.
Introduction
Резонансный перенос энергии Фёрстера ((F)RET) обычно наблюдается с помощью флуоресцентной спектроскопии, хотя сам процесс не ограничивается происходящим между флуорофорами. Лежащая в основе диполь-дипольная связь просто требует светоизлучающей донорской молекулы и светопоглощающего акцептора. Это получено из требуемого спектрального перекрытия интеграла J нормализованных спектров излучения донора и акцепторного поглощения1. Однако, поскольку RET конкурирует с флуоресценцией, передача энергии становится измеримой за счет изменений в флуоресцентном излучении: RET вызывает закалку донора и сенсибилизированную акцепторную эмиссию.
RET на основе флуорофора был назван флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET), чтобы отделить его от биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET). RET сильно зависит от расстояния между донором и акцептором, которое широко находится в диапазоне 0,5-10 нм2 и, таким образом, в том же диапазоне, что и размеры белков и их комплексов. Во-вторых, RET зависит от дипольно-дипольной ориентации каппа в квадрате. В сочетании с тем, что вращательной свободой связанных с белком флуорофоров можно пренебречь из-за молекулярной массы и медленной вращательной релаксации, RET позволяет анализировать конформационные изменения3.
Так называемый радиус Фёрстера основан на спектральном интеграле перекрытия и диапазоне длин волн перекрытия, так что красные хромофоры, поглощающие свет, приводят к более длинным радиусам Фёрстера, чем поглощающие синий свет красители. Поскольку динамический диапазон измерений FRET ограничен 0,5 × R0 и 1,5 × R0, пара FRET ECFP-EYFP имеет динамический диапазон 2,5-7,3 нм благодаря своему R0 4,9 нм4.
Яркость флуорофора задается произведением его коэффициента молярного вымирания и его квантового выхода. Для измерений FRET выгодно выбирать флуорофоры почти одинаковой яркости. Это улучшает обнаружение закалки доноров и сенсибилизированного акцепторного излучения. Это также способствует калибровке системы микроскопии. Глядя на часто используемые пары FRET синих и флуоресцентных белков, становится очевидной более низкая яркость синих флуоресцентных белков (рисунок 1A).
Однако срок службы акцептора должен быть ниже срока службы донора, обеспечивая доступность акцептора для передачи энергии. Если срок службы акцептора превышает срок службы донора, акцептор все еще может находиться в возбужденном состоянии, когда донор снова возбуждается. Усовершенствованные голубые флуоресцентные белки, такие как mTurquoise, показывают увеличенное время жизни и, таким образом, способствуют увеличению вероятности FRET (рисунок 1B). Вероятность FRET также зависит от коэффициента молярного вымирания акцептора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующего протокола была выполнена транзиторная трансфекция протопластов, как описано ранее12. Краткое описание приведено ниже.
1. Транзиторная трансфекция протопластов
- Нарежьте ~4 г здоровых листьев Arabidopsis thaliana экотипа Columbia на ломтики по 1 мм и перенесите их в 20 мл раствора фермента (1,5% целлюлазы; 0,4% мацероцима; 0,1% бычьего сывороточного альбумина фракции V; 0,4 мМ маннитола; 20 мМ KCl; 20 мМ 2-(N-морфолино)этанесульфоновой кислоты (MES), рН 5,7; 10 мМ CaCl2).
- Вакуумно-инфильтрируют ломтики листьев с последующей инкубацией с перемешиванием в течение 2 ч при комнатной температуре. Собирают клетки методом центрифугирования в течение 3 мин при 100 × г.
- Промыть протопласты W5-раствором (154 мМ NaCl; 125 мМ CaCl2; 5 мМ ККл; 2 мМ MES, рН 5,7) и повторно суспендировать их в растворе ММГ (0,4 М маннитола; 15 мМ МгКл2; 4 мМ MES, рН 5,7).
- Выполняют трансфекцию в 8-луночном скольжении осмотическим ударом в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ) 4000. Смешайте 20 мкл суспензии протопласта с 5 мкл плазмидной ДНК (5 мкг/мкл) и 25 мкл раствора ПЭГ (0,2 М маннитола, 0,1 М CaCl2, 40% ПЭГ 4000).
- Обратите вспять осмотический шок путем мягкой корректировки осмотических состояний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо интересующей выборки, для определения спектрального кровотечения донора и акцептора, соответственно, требуется выражение только донора и акцептора. Слияние белка донора и акцептора также должно быть выражено для целей калибровки. Экспрессия флуоресцентного белка находилась под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S (pCaMV35S). Для всех измерений использовались два конфокальных лазерных сканирующих микроскопа (LSM1 и LSM2). LSM1 имеет два типа детекторов: для измерений FRET донорский сигнал был обнаружен GaAsP-детектором, в то время как FRET и акцепторное излучение регистрировались фотоумножителем. LSM2 имеет два фотоумножителя, которые использовались для обнаружения донорского, FRET и акцепторного излучения.
2. Лазерная регулировка
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь 458 нм и 514 нм линии аргоно-ионного лазера были применены для анализа FRET между улучшенным голубым флуоресцентным белком (ECFP) и улучшенным желтым флуоресцентным белком (EYFP), меченым белками. Для воспроизводимого сбора данных обе линии были скорректированы на одинаковую интенсивность. Это было достигнуто либо с помощью фотоумножителя передачи, либо с помощью режима отражения.
- Лазерная регулировка с помощью пропускающего фотоумножителя
- Используйте пустой колодец для регулировки.
- Выберите режим линейного сканирования и режим гистограммы.
- Уменьшите интенсивность лазера до минимума и отрегулируйте усиление детектора до обнаруживаемого фонового шума.
- Увеличьте интенсивность лазера с шагом 0,5% и запишите соответствующий сигнал.
- Примените процедуру для обеих лазерных линий.
- Лазерная регулировка с режимом отражения
- Используйте пустой колодец для регулировки.
- Примените фильтр отражения, включите режим отражения, если таковой имеется.
- Убедитесь, что диапазон длин волн детектора покрывает длину волны лазера.
- Выберите режим линейного сканирования и режим гистограммы.
- Уменьшите интенсивность лазера до минимума и отрегулируйте усиление детектора до обнаруживаемого фонового шума.
- Переместите объект в самое низкое положение.
- Перемещайте цель вверх до тех пор, пока не будет видно отражение крышки.
- Увеличьте интенсивность лазера с шагом 0,5% и запишите соответствующий сигнал.
- Примените процедуру для обеих лазерных линий.
- Оценка данных
- Сведите данные в таблицу и отсортируйте их по интенсивности сигнала.
- Постройте интенсивность сигнала по отношению к относительной мощности лазера.
- Выберите интенсивность лазера, которая приводит к аналогичной интенсивности сигнала.
3. Регулировка фотоумножителей
ПРИМЕЧАНИЕ: После лазерной регулировки фотоумножители были настроены на индивидуальные усиления для получения аналогичной чувствительности. Эта калибровка была выполнена с помощью лазерной линии 514 нм, которая находится в центре интересующего диапазона длин волн.
- Используйте пустой колодец для регулировки.
- Примените фильтр отражения и переключитесь в режим отражения, если таковой имеется.
- Убедитесь, что диапазон длин волн детектора покрывает длину волны лазера (514 нм).
- Выберите режим сканирования строки и вид гистограммы.
- Уменьшите коэффициент усиления детектора до половины максимального и отрегулируйте интенсивность лазера в соответствии с обнаруживаемым фоновым шумом.
- Переместите объект в самое низкое положение.
- Перемещайте цель вверх до тех пор, пока не будет видно отражение крышки.
- Увеличьте коэффициент усиления детектора с шагом от 50 до 100 В и запишите соответствующий сигнал.
- Примените шаги 3.1-3.8 для обоих детекторов.
- Оценка данных
- Постройте диаграмму интенсивности по отношению к коэффициенту усиления детектора для каждого детектора.
- Выберите отдельный детектор усиления для получения аналогичной чувствительности.
4. Получение изображения FRET
ПРИМЕЧАНИЕ: Начните с примера, представляющего интерес для настройки получения изображений.
- Выберите подходящие фильтры/дихроичные зеркала, например, двойное дихроичное зеркало MBS 458/514 для FRET-пары ECFP/EYFP. Используйте одно и то же дихроичное зеркало для всех каналов, чтобы включить построчное сканирование. Выберите цель погружения в воду для визуализации живых клеток. Выберите 12-битное или 16-битное сканирование и умеренную скорость сканирования.
- Определите диапазон обнаружения, предпочтительно 470-510 нм для обнаружения доноров и 530-600 нм для детектирования акцептора/FRET в случае ECFP/EYFP. При использовании диодного лазера 445 нм или 440 нм используйте диапазон обнаружения от 450 до 510 нм. В случае акустооптического светоделителя (AOBS) определите обнаружение донора в диапазоне от 450 до 500 нм для предотвращения обнаружения нежелательных акцепторов.
- Примените настройку детектора в соответствии с пунктом 3.10.2.
- Примените настройку лазера в соответствии с пунктом 2.3.2. При необходимости пересмотрите интенсивность лазера на основе полученной таблицы мощности лазера. Убедитесь, что отношение сигнал/шум охватывает весь динамический диапазон детекторов (интенсивность от 0 до 4095 для 12-битного сканирования).
- Держите интенсивность лазера и прирост детектора постоянными. Используйте диаметр точечного отверстия для тонкой настройки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что изменения диаметра точечного отверстия влияют на пространственное разрешение. - Выполните измерения (сделайте снимки не менее 20 клеток).
5. Определение перекрестных коллизионных исправлений
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, экспрессирующие только донора или акцептор, должны определять спектральное кровотечение донора (DSBT) и акцепторное спектральное кровотечение (ASBT), соответственно. Сохраните те же параметры, которые описаны в разделе 4.
- Выполните измерения FRET с клетками, экспрессирующими донорский флуорофор.
- Выполняйте измерения FRET с клетками, экспрессирующими акцепторный флуорофор.
6. Калибровка измерений по Beemiller et al.13
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуются клетки, экспрессирующие донорско-акцепторное слияние известной эффективности FRET. Здесь использован ECFP-5 aa-EYFP-fusion с КПД FRET 0,464. Сохраните те же параметры, которые описаны в разделе 4.
- Выполнение измерений FRET с клетками, экспрессирующими слияние донор-акцептор
7. Оценка данных
- Получите линейные профили ячеек, убедившись, что каждый профиль содержит не более одной ячейки. Сохраните профили в виде текстовых файлов.
- Импортируйте текстовые файлы в электронную таблицу с помощью параметра импорта текстовых файлов в разделе Данные .
- Считывание максимальных значений путем применения функции Max .
- Перечислите полученные значения в таблице, укажите столбец для идентификатора выбросов донора, МФ излучения FRET, акцепторного излучения IA и по крайней мере четырех наборов данных: только донор, только акцептор, слияние донор-акцептор и измерение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возбуждение донора также приводит к прямому возбуждению акцептора и вызывает ASBT, который описывается значением α. - Вычислите значения ASBT α с помощью набора данных только для акцептора с помощью уравнения (1).
(1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте медиану всех значений α в следующих уравнениях. Донор демонстрирует широкий спектр излучения, что приводит к перекрестным помехам излучения с сенсибилизированным излучением акцептора. Этот DSBT задается значением β. - Рассчитайте спектральные значения β донора с помощью набора данных, предназначенного только для донора, используя уравнение (2).
(2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте медиану всех значений β в следующих уравнениях. Калибровочный коэффициент ξ описывает линейную зависимость закалки донора, полученного из ФРЕТ, и сенсибилизированного излучения акцептора. Используйте медианы 7,5 и 7,6 в следующих уравнениях. - Рассчитайте калибровочные коэффициенты ξ с набором данных о слиянии донор-акцептор и его эффективность FRET E (0,46) с использованием уравнения (3).
(3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте медиану всех значений ξ в следующих уравнениях. - Рассчитайте эффективность FRET интересующей белковой пары, используя уравнения (4) и (5).
(4)
(5) - Оцените влияние силы экспрессии и/или соотношения донор-акцептор: постройте сумму ID, IF и IA в сравнении с эффективностью FRET. Выполнить линейную регрессию; Обратите внимание, что чем круче график и чем выше R2 , тем выше влияние уровня выражения или тем больше разница в изобилии донора и акцептора.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Настройка конфокального лазерно-сканирующего микроскопа
Лазерная регулировка выявила линейное увеличение излучения с увеличением интенсивности лазера (рис. 2 и табл. 1). Как и ожидалось для аргон-ионных лазеров, излучение линии 514 нм было намного выше, чем излучение линии 458 нм, о чем свидетельствует более крутой уклон. Для последующих экспериментов была выбрана лазерная мощность 4,5% и 6,5% для линии 514 нм и линии 458 нм соответственно. Это привело к почти равной интенсивности излучения 1123 (514 нм) и 1141 (458 нм).
Изменение коэффициента усиления детектора при постоянной мощности лазера выявило экспоненциальное поведение для обоих анализируемых детекторов. Аналогичная интенсивность выбросов была получена для усиления 700 В (рисунок 3). Хотя корректировка лазерных линий выиграла от линейного поведения, на настройку детекторов, вероятно, влияет экспоненциальное поведение, что приводит к заметным различиям с незначительными изменениями коэффициента усиления при более высоких напряжениях. К сожалению, этот более высокий диапазон представляет интерес для измерений в живых клетках, так как увеличение мощности лазера является цитотоксичным и способствует фотоотбеливанию.
Определение спектрального пропускания
Сначала спектральное кровотечение донора и акцептора анализировали рекомбинантно очищенными ECFP и EYFP; β DSBT = 0,498 и ASBT α = 0,100. То же самое было сделано с клетками, экспрессирующими либо ECFP, либо EYFP. При LSM 2 расчетный DSBT составил β = 1,602 ± 0,207 (среднее ± SD), а ASBT составил α = 0,119 ± 0,018. Медианные значения составили β = 1,506 и α = 0,120. Это несоответствие между данными, полученными в живых клетках, и данными, полученными с рекомбинантным белком, показывает, что невозможно опустить определение спектрального кровотечения в живых клетках. Вероятно, это вызвано клеточными пигментами.
Изображения показывают более высокую яркость EYFP по сравнению с ECFP (рисунок 4 и таблица 2). Компенсация различий в яркости различными настройками лазера усиливает динамический диапазон донора и канала FRET. Обеспечение относительной производительности путем измерения интенсивности лазера, как это делается для регулировки, по-прежнему увеличивает воспроизводимость измерений.
Для LSM 1 β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 с медианами α = 0,084 и β = 0,180. Определение ASBT зависит от лазерной регулировки и одного детектора, и, таким образом, определение ASBT работает хорошо. DBST включает в себя два детектора, что приводит к совершенно разным результатам для обоих микроскопов. Следует помнить, что LSM 2 оснащен двумя фотоумножителями, тогда как LSM 1 использует детектор GaAsP и фотоумножитель, два разных типа детекторов с разными спектральными свойствами и чувствительностью. Соответственно, регулировка лучше работает с двумя одинаковыми детекторами.
Калибровка измерения
Для калибровки применялись медианные значения α и β, а в качестве эталона известной эффективности FRET использовалось слияние ECFP и EYFP (E = 0,46). Калибровка рекомбинантных и очищенных ECFP-EYFP привела к значению ξ 13,44, в то время как измерения in vivo показали значение ξ 1,525 ± 1,844. Медиана составила 0,798, что выявило экстремальные выбросы вместе с высоким стандартным отклонением. Для LSM 1 значения были ξ = 1,978 ± 0,807 со медианой ξ = 1,883. Для LSM 2 и LSM 1 наборы данных, полученные для расчета ξ (таблица 3), были статистически идентичны, что было доказано t-тестом Стьюдента (p > 0,2).
Измерение ЛАД
В качестве доказательства концепции измерение FRET было повторено с донорско-акцепторным слиянием. Измеренная эффективность FRET составила 0,47 ± 0,07 для очищенного белка и 0,47 ± 0,06 в живых клетках с LSM 2 (таблица 4). Медиана измерений в живых клетках составила E = 0,45. Для LSM 1 эффективность FRET составляла 0,46 ± 0,09 при медиане E = 0,45 (таблица 4). Эти данные демонстрируют эффективную калибровку с помощью конструкции FRET известной эффективности FRET.
Влияние уровня экспрессии и соотношения донор-акцептор
Для анализируемого набора данных эффективность FRET не зависела от уровня выражения. Из-за слияния донора и акцептора соотношение также было постоянным. Включение предыдущих наборов данных выявило зависимость от уровня выражения в одном случае (рисунок 5). Эффективность FRET между мечеными вакуолярными субъединицами АТФазы (V-ATPase), VHA-A-ECFP и VHA-a-EYFP, снижалась с увеличением интенсивности сигнала. Напротив, взаимодействие между VHA-E1-ECFP и VHA-C-EYFP не зависело от интенсивности сигнала. В случае VHA-A и VHA-a три копии VHA-A все чаще заменяются VHA-A-ECFP, что приводит к избытку донора по сравнению с единственной копией VHA-a в комплексе. Хотя VHA-E1 может присутствовать в виде трех копий, высокая растворимость VHA-C может устранить этот эффект в данном примере. Здесь эффективность FRET была сравнительно низкой. Этот простой подход позволяет тестировать артефакты выражения и соотношения.
Рисунок 1: Обзор пар ФЛУОресцентного белка FRET с донорами, выделяющими циан. (A) Радиусы Förster пар и яркость донора и акцептора приведены для хорошо охарактеризованных пар FRET. B) Сопоставление сроков жизни донора и акцептора. Серые звездочки указывают на мультиэкспоненциальный распад. Сокращения: FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; CFP = голубой флуоресцентный белок; GFP = зеленый флуоресцентный белок; YFP = желтый флуоресцентный белок; mX = мономерный X; EX = улучшенный X; SX = super X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Лазерная регулировка. Излучение лазеров регистрировалось отражением крышки и отображалось против относительной интенсивности лазера, модулированной акустооптическим перестраиваемым фильтром LSM. Показано излучение линии 458 нм (A) и линии 514 нм (B) аргоно-ионного лазера. Сокращения: LSM = лазерный сканирующий микроскоп; r.u. = относительные единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Усиление детектора и интенсивность излучения. Результирующая интенсивность излучения регистрировалась в режиме отражения для усиления детектора в диапазоне от 300 до 750 В и от 300 до 750 В для детектора 1 (А) и детектора 2 (В) соответственно. Аббревиатура = r.u. = относительные единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Спектральное кровотечение. Изображения были получены в каналах донора, FRET и акцептора. (A) Изображения, полученные с очищенными флуоресцентными белками; шкала стержней = 100 мкм; (B) соответствующие изображения для клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки; шкала баров = 10 мкм. (C) Графики полученных значений SBT; приведено среднее ± SD. Сокращения: FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; SBT = спектральное кровотечение; ECFP = усиленный голубой флуоресцентный белок; EYFP = усиленный желтый флуоресцентный белок; LSM = лазерный сканирующий микроскоп; ASBT = акцептор SBT; DSBT = донор SBT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние уровня экспрессии и/или соотношения донор-акцептор. Сумма выбросов в донорском, FRET и акцепторном каналах была построена на основе эффективности FRET. Это было сделано для VHA-E1-ECFP и VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP и VHA-a-EYFP (B), а также слияния ECFP-EYFP (C). Выполнена линейная регрессия; приведены уравнение и R2 . Сокращения: FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; ECFP = усиленный голубой флуоресцентный белок; EYFP = усиленный желтый флуоресцентный белок; VHA = вакуумная субъединица АТФазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Утечка крови донором и акцептором ECFP и EYFP. Спектры флуоресцентных белков были получены из базы данных FP14. А) В ходе экспериментов с сенсибилизированным излучением обширные участки донора и акцептора обнаруживаются отдельными фотоумножителями, называемыми соответственно PMT1 и PMT2. Излучение ECFP также обнаруживается акцепторным детектором при возбуждении с 458 нм. Рассчитанное спектральное просачивание донора в PMT2 составляет 40,6% от выбросов, обнаруженных PMT1. (B) Спектр излучения EYFP показывает, что EYFP демонстрирует прямое возбуждение при 458 нм, которое часто применяется для возбуждения циановых доноров. Ожидаемая эффективность возбуждения составляет 9,6% от возбуждения при 514 нм. Сокращения: FP = флуоресцентный белок; ECFP = усиленный голубой флуоресцентный белок; EYFP = усиленный желтый флуоресцентный белок; PMT = фотоумножитель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Мощность лазера и интенсивность сигнала. Интенсивность сигнала линии 458 нм указана синим цветом, интенсивность сигнала линии 514 нм — зеленым. Интенсивности, примененные для эксперимента, выделены серым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Интенсивность сигнала для определения SBT. Приведены записанные максимумы и расчетные значения α и β. Сокращения: SBT = спектральное кровотечение; LSM = лазерный сканирующий микроскоп; FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; ASBT = акцептор SBT; DSBT = донор SBT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Интенсивность сигнала для калибровки. Приведены записанные максимумы и вычисляемые значения ξ. Скорректированные значения соответствуют интенсивности сигнала FRET минус SBT. Сокращения: SBT = спектральное кровотечение; LSM = лазерный сканирующий микроскоп; FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Интенсивность сигнала для измерений FRET. Приведены записанные максимумы и значения E. Скорректированные значения соответствуют интенсивности сигнала FRET минус SBT. Калиброванные значения E рассчитывались с калибровкой по ξ. Сокращения: SBT = спектральное кровотечение; LSM = лазерный сканирующий микроскоп; FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; cal. = откалиброванный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Закалка донором и сенсибилизированная акцепторная эмиссия характеризуются линейной зависимостью, которая позволяет проводить расчет FRET на основе донора или акцептора. Соответствующие факторы линейности называются либо G-фактором (донор к акцептору), либо xi (акцептор к донору), которые являются взаимными значениями4. Измерение FRET между флуоресцентными белками с помощью флуоресцентной микроскопии часто требует коррекции для DSBT и ASBT из-за широкого спектра поглощения и излучения флуоресцентных белков. Однако многие поправки зависят от измеримого ASBT, который является фактором знаменателя уравнений в разделе 7 протокола, а α = 0 приводит к неопределенным уравнениям5,6.
Рекомендуется регулировка интенсивности лазера, чтобы избежать таких эффектов. Это позволяет использовать расчеты на основе акцепторов и легко обнаруживать неподходящие соотношения донор-акцептор. В этом протоколе было применено уравнение Beemiller и коллег, которое имеет преимущество простой калибровки с помощью единой эталонной конструкции известной эффективности FRET. Регулировка детекторов имеет решающее значение, особенно при применении двух различных типов детекторов. Предыдущие данные, полученные с помощью двух идентичных фотоумножителей и идентичных приростов, привели к постоянному β = 0,61 для нескольких экспериментов в течение многих лет7,8,9 и демонстрируют, что регулировка детектора выгодна для воспроизводимости. Если детекторы не допускают надежной регулировки, последовательное сканирование с помощью одного детектора в покадровом режиме может быть вариантом, позволяющим избежать смещения от свойств детектора.
На измерения в растительных клетках влияет множество пигментов, которые приводят к возбуждению поглощения света и фоновой автофлуоресценции. Клеточные пигменты в основном возбуждаются светом в УФ-синем диапазоне4,10. Это объясняет несоответствие между измерениями в клетках и клетках с очищенными белками. Очищенные белки могут служить доказательством корректировки, поскольку ожидаемые значения asBT α и DSBT β могут быть получены из спектра поглощения акцептора и спектра излучения донора, соответственно (рисунок 6). Значения ASBT аналогичны в клетках (α = 0,094) и у очищенных флуорофоров (α = 0,114) и близки к ожидаемому значению 0,096 из-за низкого клеточного поглощения при 514 нм. DSBT β = 0,498 с очищенными белками также близок к ожидаемому значению 0,406. Спектральное просачивание дополнительно зависит от настроек; диодные лазеры 445 или 440 нм уменьшают прямое возбуждение EYFP и тем самым уменьшают ASBT. AOBS характеризуются меньшим разрывом передачи, чем дихроичные зеркала. Таким образом, обнаружение EYFP усиливается в диапазоне от 500 до 510 нм и может привести к дополнительному ASBT в донорский канал. Однако спектральные свойства EYFP указывают на менее 1% излучения от максимального пика, учитывая как менее эффективное возбуждение, так и низкую интенсивность излучения. Зазор фильтра значительно шире с дихроичными зеркалами, что приводит к дополнительному подавлению таких акцепторных перекрестных помех.
Использование значений из очищенных белков не отражает ситуацию в клетке. То же самое относится и к калибровке по коэффициенту ξ. Хотя калибровочный коэффициент был сходным для обоих LSM, он был намного выше в измерениях с рекомбинантным белком, выявляя влияние клеточных пигментов. Следует отметить, что в этих измерениях фоновый шум был незначительным, но обнаруживаемым и не влиял на наблюдаемые интенсивности. В отличие от измерений срока службы донора, эксперименты с сенсибилизированными выбросами чувствительны к соотношению донор-акцептор, так что избыток донора приводит к снижению эффективности FRET.
Тем не менее, экспрессия белка находилась под контролем CaMV35S-промотора в настоящих экспериментах. Этот промотор часто используется для сверхэкспрессии белков в растениях и может привести к нефизиологически высоким количествам белков13. В таких условиях вероятность взаимодействия увеличивается, и могут возникать ложноположительные результаты при более высоких концентрациях белка. Построение графиков интенсивности выбросов в сопоставлении с эффективностью FRET приводит к повышению эффективности FRET с увеличением интенсивности выбросов и позволяет оценить данные FRET по отношению к уровню выражения.
Рекомендуется отделять эксперименты с колокализацией высокого разрешения от измерений FRET. Для колокализации для каждого флуорофора выбираются оптимальные настройки, в то время как для записи FRET интенсивность излучения и тонкая настройка по диаметру точечного отверстия мешают оптимальным условиям изображения. Тем не менее, разделение органелл и информация о субклеточных структурах по-прежнему включены в измерения FRET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы гарантируем, что все авторы раскрыли все конфликты интересов и не имеют конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эксперименты проводились на технологической платформе световой микроскопии (LiMiTec) биологического факультета Билефельдского университета. Эта работа была профинансирована Билефельдским университетом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
