Summary
يتم توفير بروتوكول لإعداد مجهر مسح ليزر كونفوكوكال قياسي لقياسات نقل الطاقة بالرنين في الجسم الحي Förster ، يليه تقييم البيانات.
Abstract
تتم بسهولة تجارب نقل الطاقة بالرنين الرنيني (FRET) القائمة على الانبعاثات ولكن تعتمد على الإعداد المجهري. أصبحت مجاهر المسح بالليزر Confocal العمود الفقري لعلماء الأحياء. توفر الأنظمة التجارية مرونة عالية في ضبط طاقة الليزر وحساسية الكاشف وغالبا ما تجمع بين أجهزة الكشف المختلفة للحصول على الصورة المثالية. ومع ذلك، غالبا ما تكون مقارنة البيانات المستندة إلى الكثافة من التجارب والإعدادات المختلفة مستحيلة بسبب هذه المرونة. تعد الإجراءات الصديقة لعلماء الأحياء ذات فائدة وتسمح بتعديل بسيط وموثوق به لإعدادات الليزر والكاشف.
وعلاوة على ذلك، بما أن تجارب FRET في الخلايا الحية تتأثر بالتباين في التعبير عن البروتين ونسب قبول المانحين، يجب النظر في مستويات التعبير عن البروتين لتقييم البيانات. وصف هنا هو بروتوكول بسيط لقياسات FRET موثوق بها وقابلة للاستنساخ، بما في ذلك إجراءات لتقدير التعبير البروتين وتعديل كثافة الليزر وإعدادات كاشف. سيتم إجراء تقييم البيانات عن طريق المعايرة مع دمج الفلوروفور من كفاءة FRET المعروفة. لتحسين البساطة، تمت مقارنة عوامل التصحيح التي تم الحصول عليها في الخلايا وقياس البروتينات الفلورية المؤتلفة.
Introduction
عادة ما يلاحظ نقل الطاقة بالرنين Förster ((F)RET) عن طريق التحليل الطيفي الفلوري ، على الرغم من أن العملية نفسها لا تقتصر على الحدوث بين الفلوروفوريس. اقتران ثنائي القطب الكامنة ببساطة يتطلب جزيء المانحة الباعثة للضوء ومقبول امتصاص الضوء. وهذا مستمد من التداخل الطيفي المطلوب الذي لا يتجزأ من J من أطياف امتصاص الانبعاثات والمتقبلات العادية للمانحين1. ومع ذلك، ولأن تكنولوجيا الطاقة المتجددة تتنافس مع الفلورسينس، يصبح نقل الطاقة قابلا للقياس من خلال التعديلات في انبعاثات الفلورية: تحفز الطاقة المتجددة على إخماد المانحين وانبعاثات المقبولين الحساسة.
وقد أطلق على تكنولوجيا الطاقة المتجددة القائمة على الفلوروفور (RET) مصطلح نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET) لفصله عن نقل الطاقة بالرنين الإضاءة الحيوية (BRET). تعتمد تكنولوجيا الطاقة المتجددة بقوة على المسافة بين المتبرع والمقبل، والتي تقع على نطاق واسع في نطاق 0.5-10 نانومتر مربع ، وبالتالي، في نفس نطاق أبعاد البروتينات ومجمعاتها. ثانيا، يعتمد RET على ثنائي القطب التوجه كابا التربيعية. جنبا إلى جنب مع حقيقة أن حرية الدوران من الفلوروفوريس المرتبطة بالبروتين يمكن إهمالها بسبب الوزن الجزيئي والاسترخاء الدوراني البطيء ، تسمح RET بتحليل التعديلات التوافقية3.
ويستند ما يسمى دائرة نصف قطرها فورستر على التداخل الطيفي لا يتجزأ ونطاق الطول الموجي للتداخل، بحيث الكروموفوريس امتصاص الضوء الأحمر يؤدي إلى أطول Förster radii من الأصباغ الزرقاء امتصاص الضوء. نظرا لأن النطاق الديناميكي لقياسات FRET محدود بنسبة 0.5 × R0 و 1.5 × R0 ، فإن زوج FRET ECFP-EYFP لديه نطاق ديناميكي يتراوح بين 2.5-7.3 نانومتر بسبب R0 من 4.9 نانومتر4.
يتم إعطاء سطوع الفلوروفور من خلال نتاج معامل انقراض الضرس وغلته الكمية. بالنسبة لقياسات FRET ، من المفيد اختيار الفلوروفورات ذات السطوع المماثل تقريبا. وهذا يعزز الكشف عن إخماد المانحين وتوعية الانبعاثات المقبولة. كما أنه يفضل معايرة نظام المجهر. بالنظر إلى أزواج FRET المستخدمة بشكل متكرر من البروتينات السماوي والفلورسنت ، يصبح السطوع السفلي للبروتينات الفلورية السماوي واضحا (الشكل 1A).
ومع ذلك، يجب أن يكون عمر المقبول أقل من عمر المتبرع، مما يضمن توافر المقبول لنقل الطاقة. إذا تجاوزت مدة حياة المقبول عمر المتبرع ، فقد يكون المقبول لا يزال في حالة متحمسة عندما يكون المتبرع متحمسا مرة أخرى. تظهر البروتينات الفلورية السيان المتقدمة مثل mTurquoise عمرا ممتدا وبالتالي تساهم في زيادة احتمالية FRET (Figure1B). يعتمد احتمال FRET أيضا على معامل انقراض الضرس للمقبول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول التالي، تم تنفيذ عملية نقل عابرة للبلاستيدات الأولية، كما هو موضح سابقا12. ويرد أدناه وصف موجز.
1. عابر transfection من بروتوبلاستس
- قطع ~ 4 غرام من أوراق صحية من أربيدوبسيس تاليانا ecotype كولومبيا إلى شرائح 1 ملم ونقلها إلى 20 مل من محلول الانزيم (1.5٪ cellulase; 0.4٪ macerozyme؛ 0.1٪ ألبوم مصل البقري كسر الخامس؛ 0.4 M مانيتول؛ 20 mM KCl؛ 20 mM 2-(N-morpholino)حمض الإيثانسولفوني (MES)، درجة الحموضة 5.7؛ 10 mM CaCl2).
- فراغ التسلل شرائح ورقة تليها حضانة مع التحريض لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 100 × غرام.
- غسل البروتوبلاستات مع W5-الحل (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5.7) وإعادة إنفاقها في محلول MMG (0.4 M مانيتول; 15 mM MgCl2; 4 MM MES, pH 5.7).
- تنفيذ العدوى في شريحة 8-جيدا عن طريق صدمة التناضح في وجود البولي إيثيلينغليكول (PEG) 4000. مزيج 20 ميكرولتر من تعليق بروتوبلاست مع 5 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (5 ميكروغرام / ميكرولتر) و 25 ميكرولتر من محلول PEG (0.2 M مانيتول، 0.1 M CaCl2، 40٪ PEG 4000).
- عكس الصدمة التناضحية عن طريق إعادة التكيف لطيف من الظروف التناضحية.
ملاحظة: إلى جانب عينة الاهتمام، يلزم التعبير عن المانح وحده والمقبل وحده لتحديد النزيف الطيفي للمتبرع والمقبل، على التوالي. يجب التعبير عن بروتين الانصهار للمتبرع والمقبل أيضا لأغراض المعايرة. كان تعبير البروتين الفلوري تحت سيطرة مروج فيروس فسيفساء القرنبيط 35S (pCaMV35S). وبالنسبة لجميع القياسات، استخدم مجاهر مسح بالليزر الكونفوج (LSM1 وLSM2). LSM1 نوعين من أجهزة الكشف: لقياسات FRET، تم الكشف عن إشارة المانحة من قبل كاشف GaAsP، في حين تم تسجيل FRET وانبعاثات المقبول مع فوتومولتيلير. LSM2 اثنين من photomultipliers، والتي استخدمت للكشف عن المانحة، FRET، وانبعاثات المقبول.
2. الليزر التكيف
ملاحظة: هنا، تم تطبيق 458 نانومتر و 514 نانومتر من ليزر الأرجون أيون لتحليل FRET بين بروتين فلوري سماوي معزز (ECFP) - وبروتينات فلورية صفراء محسنة (EYFP) تحمل علامة البروتينات. وبالنسبة لاكتساب البيانات القابلة للاستنساخ، تم تعديل الخطين على نحو مماثل. وقد تحقق ذلك إما عن طريق فوتوموليبلييه الإرسال أو وضع الانعكاس.
- تعديل الليزر باستخدام جهاز تحويل ضوئي ناقل الحركة
- استخدام بئر فارغة للتعديل.
- اختر وضع مسح الخط وعرض الرسم البياني.
- خفض كثافة الليزر إلى أدنى حد ممكن، وضبط كسب كاشف للضوضاء الخلفية للكشف.
- زيادة كثافة الليزر في خطوات 0.5٪ وتسجيل إشارة المقابلة.
- تطبيق الروتين لكلا خطوط الليزر.
- تعديل الليزر مع وضع الانعكاس
- استخدام بئر فارغة للتعديل.
- تطبيق عامل تصفية انعكاس، قم بتشغيل وضع الانعكاس، إذا كان متوفرا.
- تأكد من أن نطاق الطول الموجي للكاشف يغطي الطول الموجي لليزر.
- اختر وضع مسح الخط وعرض الرسم البياني.
- خفض كثافة الليزر إلى أدنى حد ممكن، وضبط كسب كاشف للضوضاء الخلفية للكشف.
- نقل الهدف إلى الموضع الأدنى.
- نقل الهدف لأعلى حتى انعكاس coverslip مرئيا.
- زيادة كثافة الليزر في خطوات 0.5٪ وتسجيل إشارة المقابلة.
- تطبيق الروتين لكلا خطوط الليزر.
- تقييم البيانات
- جدولة البيانات وفرز البيانات حسب كثافة الإشارة.
- رسم كثافة الإشارة ضد قوة الليزر النسبية.
- اختر كثافة الليزر التي تؤدي إلى كثافة إشارة مماثلة.
3. تعديل المولات الضوئية
ملاحظة: بعد تعديل الليزر، تم ضبط المولات الضوئية على المكاسب الفردية للحصول على حساسية مماثلة. وقد تم إجراء هذه المعايرة مع خط الليزر 514 نانومتر، الذي هو في وسط نطاق الطول الموجي للاهتمام.
- استخدام بئر فارغة للتعديل.
- تطبيق عامل تصفية انعكاس، والتبديل إلى وضع الانعكاس إذا كان متوفرا.
- تأكد من أن نطاق الطول الموجي للكاشف يغطي الطول الموجي لليزر (514 نانومتر).
- اختر وضع مسح الخط وعرض الرسم البياني.
- خفض كسب كاشف إلى نصف الحد الأقصى، وضبط كثافة الليزر للضوضاء الخلفية للكشف.
- نقل الهدف إلى الموضع الأدنى.
- نقل الهدف لأعلى حتى انعكاس coverslip مرئيا.
- زيادة كسب كاشف في خطوات من 50 إلى 100 V وتسجيل إشارة المقابلة.
- تطبيق الخطوات 3.1 إلى 3.8 لكلا الكاشفين.
- تقييم البيانات
- رسم كثافة ضد كسب كاشف لكل كاشف.
- اختيار مكاسب كاشف الفردية للحصول على حساسية مماثلة.
4. FRET اقتناء الصور
ملاحظة: ابدأ بعينة الاهتمام لإعداد الحصول على الصورة.
- اختر المرشحات المناسبة/ المرايا ال dichroic، على سبيل المثال، مرآة مزدوجة ثنائية الديكرويك MBS 458/514 لEFP/EYFP زوج FRET. استخدم نفس المرآة الديكهروبية لكافة القنوات لتمكين المسح الضوئي سطرا سطرا. حدد هدف الغمر بالماء لتصوير الخلايا الحية. اختر المسح الضوئي 12 بت أو 16 بت وسرعة المسح الضوئي المعتدلة.
- تحديد نطاق الكشف، ويفضل 470-510 نانومتر للكشف عن المانحين و 530-600 نانومتر للكشف عن المقبول / FRET في حالة ECFP / EYFP. عند استخدام ليزر ثنائي 445 نانومتر أو 440 نانومتر، استخدم 450 إلى 510 نانومتر كمد كشف. في حالة مقسم شعاع acousto-optic (AOBS)، حدد كشف المتبرع في نطاق 450 إلى 500 نانومتر لمنع الكشف عن المقبول غير المرغوب فيه.
- تطبيق إعداد كاشف وفقا ل3.10.2.
- تطبيق الإعداد الليزر وفقا ل2.3.2. راجع كثافة الليزر استنادا إلى جدول طاقة الليزر الذي تم الحصول عليه، إذا لزم الأمر. تأكد من أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء تغطي النطاق الديناميكي الكامل للكاشفات (تتراوح الكثافة من 0 إلى 4095 للمسح الضوئي 12 بت).
- الحفاظ على كثافة الليزر والمكاسب كاشف ثابت. استخدام قطر الثقب لضبط.
ملاحظة: ضع في اعتبارك أن التغييرات في قطر الثقب تؤثر على الدقة المكانية. - إجراء القياسات (التقاط صور ل 20 خلية على الأقل).
5. تحديد التصحيحات عبر الحديث
ملاحظة: الخلايا التي تعبر فقط عن المتبرع أو المقبول مطلوبة لتحديد النزيف الطيفي المانح (DSBT) والنزيف الطيفي المقبول (ASBT) على التوالي. احتفظ بنفس الإعدادات الموضحة في القسم 4.
- إجراء قياسات FRET مع الخلايا التي تعبر عن الفلوروفور المانحة.
- إجراء قياسات FRET مع الخلايا التي تعبر عن الفلوروفور المقبول.
6. معايرة القياسات وفقا ل Beemiller وآخرون.13
ملاحظة: الخلايا التي تعبر عن اندماج المانحة المقبولة من كفاءة FRET المعروفة مطلوبة. هنا، تم استخدام ECFP-5 aa-EYFP-fusion بكفاءة FRET تبلغ 0.464. احتفظ بنفس الإعدادات الموضحة في القسم 4.
- إجراء قياسات FRET مع الخلايا التي تعبر عن اندماج المتبرع- المقبول
7. تقييم البيانات
- الحصول على التشكيلات الجانبية للخلايا، تأكد من أن كل ملف تعريف يحتوي على خلية واحدة لا يزيد عن. حفظ ملفات التعريف كملفات نصية.
- استيراد الملفات النصية إلى جدول بيانات باستخدام خيار استيراد الملف النصي في المقطع بيانات .
- قراءة القيم القصوى بتطبيق الدالة Max .
- قم بإدراج القيم التي تم الحصول عليها في جدول، وتحتوي على عمود لكل من معرف الانبعاثات الخاص بالمانحين، و FRET من الانبعاثات IF، و IA لانبعاثات المقبولين، وأربع مجموعات بيانات على الأقل: المانح فقط، والقبول فقط، وانصهار المانحين المقبولين، والقياس.
ملاحظة: الإثارة من المانح يؤدي أيضا إلى الإثارة المباشرة للمقبل ويسبب ASBT التي يتم وصفها من قبل القيمة α. - حساب قيم α ASBT مع مجموعة بيانات المقبول فقط باستخدام المعادلة (1).
(1) الهيئة
ملاحظة: استخدم الوسيط لكافة α-القيم في المعادلات التالية. ويظهر المانح طيفا واسعا من الانبعاثات يؤدي إلى التحدث المتبادل مع الانبعاثات الحساسة للمقبل. يتم إعطاء DSBT هذه بالقيمة β. - حساب قيم β النزف الطيفي للمانحين باستخدام مجموعة البيانات الخاصة بالمانحين فقط باستخدام المعادلة (2).
(2) الهيئة المعنية بالاتصالات
ملاحظة: استخدم الوسيط لكافة القيم β في المعادلات التالية. ويصف عامل المعايرة ξ العلاقة الخطية بين إخماد المانحين المشتق من FRET وانبعاث المقبول. استخدم الوسيطات 7.5 و 7.6 في المعادلات التالية. - احسب عوامل المعايرة ξ مع مجموعة بيانات الاندماج بين المانح والمقبل وكفاءة FRET E (0.46) باستخدام المعادلة (3).
(3) الهيئة
ملاحظة: استخدم الوسيط لكافة القيم ξ في المعادلات التالية. - حساب الكفاءة FRET من زوج البروتين من الفائدة باستخدام المعادلات (4) و (5).
(4) الهيئة
(5) 10- الأصوات التي تم 1 - تقدير تأثيرات قوة التعبير و/أو نسبة المانح إلى المقبول: رسم مجموع معرف، IF، و IA مقابل كفاءة FRET. تنفيذ انحدار خطي; لاحظ أنه كلما كان الرسم البياني أكثر حدة وكلما كان R2 أعلى ، كلما كان تأثير مستوى التعبير أو أكبر هو الفرق بين وفرة المانح والمقببول.
(1) الهيئة
(2) الهيئة المعنية بالاتصالات
(3) الهيئة
(4) الهيئة
(5) 10- الأصوات التي تم 1Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تعديل المجهر الليزر المسح confocal
وكشف تعديل الليزر عن زيادة خطية في الانبعاثات مع زيادة كثافة الليزر (الشكل 2 والجدول 1). وكما هو متوقع بالنسبة لأشعة الليزر الآيونية الأرجونية، كان انبعاث خط 514 نانومتر أعلى بكثير من انبعاث خط 458 نانومتر، كما يتضح من منحدر أكثر انحدارا. بالنسبة للتجارب اللاحقة، تم اختيار طاقة الليزر بنسبة 4.5٪ و 6.5٪ لخط 514 نانومتر وخط 458 نانومتر، على التوالي. وأدى ذلك إلى شدة انبعاثات متساوية تقريبا من 1123 (514 نانومتر) و 1141 (458 نانومتر).
وكشفت متفاوتة مكاسب كاشف في قوة الليزر المستمر سلوك الأسي لكلا كاشفات تحليلها. وتم الحصول على كثافة انبعاثات مماثلة لتحقيق زيادة 700 فولت (الشكل 3). على الرغم من أن تعديل خطوط الليزر استفاد من السلوك الخطي ، إلا أن تعديل أجهزة الكشف يتأثر على الأرجح بالسلوك الأسي ، مما يؤدي إلى اختلافات ملحوظة مع تغييرات طفيفة في الكسب في الفولتية العالية. لسوء الحظ ، فإن هذا النطاق الأعلى مهم للقياسات في الخلايا الحية ، حيث أن زيادة قوة الليزر سامة للخلايا وتعزز photobleaching.
تحديد النزيف الطيفي من خلال
في البداية ، تم تحليل النزيف الطيفي من خلال المتبرع والمقبل مع ECFP النقي المؤتلف وEYFP ؛ DSBT β = 0.498 و ASBT α = 0.100. والشيء نفسه تم مع الخلايا التي تعبر إما ECFP أو EYFP. مع LSM 2، تم β DSBT المقدر = 1.602 ± 0.207 (متوسط ± SD) و ASBT كان α = 0.119 ± 0.018. القيم الوسيطة كانت β = 1.506 و α = 0.120. هذا التناقض بين البيانات التي تم الحصول عليها في الخلايا الحية والبيانات التي تم الحصول عليها مع البروتين المؤتلف يدل على أنه من المستحيل حذف تحديد النزيف الطيفي من خلال في الخلايا الحية. ومن المرجح أن يحدث هذا بسبب الأصباغ الخلوية.
وتكشف الصور عن ارتفاع سطوع EYFP بالمقارنة مع ECFP (الشكل 4 والجدول 2). التعويض عن الاختلافات في السطوع من خلال إعدادات الليزر المختلفة يعزز النطاق الديناميكي للمتبرع وقناة FRET. ولا يزال توفير الناتج النسبي عن طريق قياس كثافة الليزر، كما حدث للتعديل، يزيد من إمكانية استنساخ القياسات.
بالنسبة ل LSM 1، β = 0.171 ± 0.044، α = 0.094 ± 0.031 مع متوسطات α = 0.084 β = 0.180. يعتمد تحديد ASBT على تعديل الليزر وكاشف واحد ، وبالتالي ، كان أداء تحديد ASBT جيدا. يتضمن DBST كاشفين ، مما يؤدي إلى نتائج مختلفة إلى حد كبير لكلا المجاهر. وينبغي أن نتذكر أن LSM 2 مجهزة اثنين من photomultipliers، في حين يستخدم LSM 1 كاشف GaAsP وphotomultiplier، نوعين مختلفين من أجهزة الكشف مع خصائص الطيفية المختلفة والحساسية. وبناء على ذلك، يعمل التعديل بشكل أفضل مع كاشفين متطابقين.
معايرة القياس
للمعايرة، تم تطبيق القيم الوسيطة α β، وتم استخدام دمج ECFP وEYFP كمعيار لكفاءة FRET المعروفة (E = 0.46). وأسفرت معايرة ECFP-EYFP المؤتلفة والمنقية عن قيمة ξ قدرها 13.44، في حين كشفت القياسات في الجسم الحي عن قيمة ξ قدرها 1.525 ± 1.844. وكان المتوسط 0.798، مما كشف عن القيم المتطرفة المتطرفة جنبا إلى جنب مع الانحراف المعياري العالي. بالنسبة ل LSM 1، كانت القيم ξ = 1.978 ± 0.807 بمتوسط ξ = 1.883. بالنسبة ل LSM 2 و LSM 1، كانت مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها لحساب ξ (الجدول 3) متطابقة إحصائيا، كما أثبت اختبار الطالب t (p > 0.2).
قياس FRET
وكدليل على المفهوم، تكرر قياس FRET مع الاندماج بين المانح والمقبل. وكانت كفاءة FRET المقاسة 0.47 ± 0.07 للبروتين النقي و0.47 ± 0.06 في الخلايا الحية مع LSM 2 (الجدول 4). وكان متوسط القياسات في الخلايا الحية E = 0.45. بالنسبة إلى LSM 1، كانت كفاءة FRET 0.46 ± 0.09 بمتوسط E = 0.45 (الجدول 4). هذه البيانات تثبت المعايرة الفعالة مع بناء FRET من كفاءة FRET المعروفة.
آثار مستوى التعبير ونسبة المانحين إلى المقبولين
بالنسبة لمجموعة البيانات التي تم تحليلها، لم تتأثر كفاءات FRET بمستوى التعبير. ونظرا لاصهار المانح والمقبل، كانت النسبة ثابتة أيضا. وكشف إدراج مجموعات البيانات السابقة عن اعتماد على مستوى التعبير في حالة واحدة (الشكل 5). وانخفضت كفاءة FRET بين الوحدات الفرعية المسماة VACUolar ATPase (V-ATPase) وVHA-A-ECFP وVHA-a-EYFP مع زيادة كثافة الإشارة. وعلى النقيض من ذلك، كان التفاعل بين VHA-E1-ECFP وVHA-C-EYFP مستقلا عن كثافة الإشارة. وفي حالة VHA-A و VHA-a، تستبدل النسخ الثلاث من VHA-A بشكل متزايد بنسخ VHA-A-ECFP، مما يؤدي إلى زيادة في عدد المانحين مقارنة بنسخة واحدة من VHA-a في المجمع. على الرغم من أن VHA-E1 قد تكون موجودة في شكل ثلاث نسخ، فإن قابلية الذوبان العالية ل VHA-C قد تلغي هذا التأثير في هذا المثال. هنا، كانت كفاءات FRET منخفضة نسبيا. هذا النهج البسيط يسمح لاختبار التعبير ونسبة القطع الأثرية.
الشكل 1: نظرة عامة على أزواج البروتين الفلوري FRET مع المتبرعين الباعثين للسيان. (أ) يتم إعطاء رادي Förster من أزواج وسطوع المانحة والمقبل لأزواج FRET تتميز بشكل جيد. (ب) مقارنة عمر المتبرع وعمر المقبول. تشير النجمات الرمادية إلى اضمحلال متعدد المهام. الاختصارات: FRET = Förster نقل الطاقة الرنين؛ CFP = بروتين فلوري سماوي. GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر. mX = أحادية الأحرف X; EX = X المحسنة; SX = سوبر X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تعديل الليزر. تم تسجيل انبعاث الليزر من خلال انعكاس الغطاء ورسمها ضد كثافة الليزر النسبية كما تم تعديلها بواسطة مرشح غير قادر على acousto-optic من LSM. يظهر انبعاث خط 458 نانومتر (A) وخط 514 نانومتر (B) من ليزر الأرجون أيون. الاختصارات: LSM = مجهر المسح بالليزر؛ r.u. = الوحدات النسبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: زيادة الكاشف وكثافة الانبعاثات. وسجلت كثافة الانبعاثات الناتجة في وضع الانعكاس لتحقيق مكاسب للكشف تتراوح بين 300 و750 فولت و300 إلى 750 فولت للكشف 1 (أ) وكاشف 2 (ب) على التوالي. اختصار = r.u. = الوحدات النسبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نزيف طيفي من خلال. تم الحصول على الصور في المانح، و FRET، وقنوات القبول. (أ) الصور التي تم الحصول عليها مع البروتينات الفلورية النقية؛ أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر؛ (ب) الصور المقابلة للخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية؛ أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (C) رسوم بيانية لقيم SBT التي تم الحصول عليها؛ يعني ± يتم إعطاء SD. الاختصارات: FRET = Förster نقل الطاقة الرنين؛ SBT = الطيفية النزيف من خلال; ECFP = بروتين فلوري سماوي محسن؛ EYFP = البروتين الفلوري الأصفر المحسن. LSM = مجهر المسح بالليزر؛ ASBT = القبول SBT; DSBT = SBT المانحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: آثار مستوى التعبير و/أو نسبة المانحين إلى المقبولين. مجموع الانبعاثات في المانحة ، FRET ، وقنوات القبول قد تم رسمها ضد كفاءة FRET. وقد تم ذلك لVHA-E1-ECFP وVHA-C-EYFP (A)، VHA-A-ECFP و VHA-a-EYFP (B)، وانصهار ECFP-EYFP (C). تم تنفيذ الانحدار الخطي; المعادلة و R2 تعطى. الاختصارات: FRET = Förster نقل الطاقة الرنين؛ ECFP = بروتين فلوري سماوي محسن؛ EYFP = البروتين الفلوري الأصفر المحسن. VHA = وحدة فرعية من ATPase فاكولار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نزيف المتبرع والمقبل من خلال ECFP وEYFP. تم الحصول على أطياف البروتينات الفلورية من قاعدة بيانات FP14. (أ) خلال تجارب الانبعاثات الحساسة، يتم الكشف عن الأجزاء الكبيرة من المتبرع والمقبل من قبل المولات الضوئية الفردية، المسماة PMT1 و PMT2، على التوالي. كما يمكن الكشف عن انبعاثات ECFP بواسطة كاشف المقبول عند الإثارة مع 458 نانومتر. والنزيف الطيفي المحسوب من جانب المانح إلى PMT2 هو 40.6 في المائة من الانبعاثات التي اكتشفها PMT1. (ب) يبين طيف الانبعاثات في EYFP أن EYFP يظهر إثارة مباشرة عند 458 نانومتر ، والذي يتم تطبيقه بشكل متكرر لإثارة المتبرعين بالسياني. كفاءة الإثارة المتوقعة هي 9.6٪ من الإثارة عند 514 نانومتر. المختصرات: FP = بروتين فلوري. ECFP = بروتين فلوري سماوي محسن؛ EYFP = البروتين الفلوري الأصفر المحسن. PMT = فوتوموليبلير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: قوة الليزر وكثافة الإشارة. يتم إعطاء شدة الإشارة من خط 458 نانومتر باللون الأزرق، وكثافة إشارة خط 514 نانومتر باللون الأخضر. يتم تمييز الكثافات المطبقة على التجربة باللون الرمادي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول 2: كثافة الإشارة لتحديد SBT. يتم إعطاء الحد الأقصى المسجل والقيم α β المحسوبة. الاختصارات: SBT = الطيفية النزيف من خلال; LSM = مجهر المسح بالليزر؛ FRET = Förster نقل الطاقة الرنين; ASBT = القبول SBT; DSBT = SBT المانحة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول 3: كثافة الإشارة للمعايرة. يتم إعطاء الحد الأقصى المسجل وقيم ξ المحسوبة. تتوافق القيم المصححة مع شدة إشارة FRET ناقص SBT. الاختصارات: SBT = الطيفية النزيف من خلال; LSM = مجهر المسح بالليزر؛ FRET = Förster نقل الطاقة الرنين. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول 4: كثافة الإشارة لقياسات FRET. يتم إعطاء القيم القصوى وE المسجلة. تتوافق القيم المصححة مع شدة إشارة FRET ناقص SBT. تم حساب القيم E معايرة مع المعايرة من قبل ξ. الاختصارات: SBT = الطيفية النزيف من خلال; LSM = مجهر المسح بالليزر؛ FRET = Förster نقل الطاقة الرنين; كال= معايرة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتميز إخماد المانحين وانبعاثات المقبولين الحساسين بعلاقة خطية تسمح إما بحساب FRET القائم على المانح أو المقبول. وتسمى العوامل المقابلة للخطية إما عامل G (المانح للمقبل) أو الحادي عشر (المقبول للمتبرع)، وهما قيم متبادلة4. قياس FRET بين البروتينات الفلورية عن طريق المجهر الفلوري غالبا ما يتطلب تصحيحات لDSBT و ASBT بسبب امتصاص واسعة وأطياف الانبعاثات من البروتينات الفلورية. ومع ذلك، تعتمد العديد من التصحيحات على ASBT قابل للقياس، وهو عامل في المقام المعادلات في المقطع البروتوكول 7، α = 0 النتائج في معادلات غير محددة5،6.
ويوصى بتعديل كثافة الليزر لتجنب مثل هذه الآثار. وهذا يمكن من استخدام الحسابات القائمة على القبول وسهولة الكشف عن نسب غير ملائمة بين المانحين والمقبلين. في هذا البروتوكول، تم تطبيق معادلة Beemiller وزملاء العمل، والتي لديها ميزة المعايرة البسيطة من خلال بناء مرجعي واحد من كفاءة FRET المعروفة. ويعد تعديل أجهزة الكشف أمرا بالغ الأهمية، لا سيما عندما يتم تطبيق نوعين مختلفين من أجهزة الكشف. وأسفرت البيانات السابقة التي تم الحصول عليها باستخدام اثنين من المولات الضوئية المتطابقة والمكاسب المتطابقة عن β ثابت = 0.61 للتجارب المتعددة على مدى سنوات7,8,9 وإثبات أن تعديل الكاشف مفيد لإعادة الإنتاج. إذا لم تسمح أجهزة الكشف بإجراء تعديل موثوق به، فقد يكون الفحص التسلسلي باستخدام كاشف واحد في وضع الإطار تلو الإطار خيارا لتجنب التحيز من خصائص الكاشف.
تتأثر القياسات في الخلايا النباتية بالعديد من الأصباغ ، مما يؤدي إلى امتصاص الضوء المثير والفلورة الذاتية الخلفية. الأصباغ الخلوية متحمسة بشكل رئيسي من الضوء في الأشعة فوق البنفسجية إلى النطاق الأزرق4,10. وهذا ما يفسر التناقض بين القياسات في الخلايا وتلك التي تحتوي على بروتينات نقية. وقد تكون البروتينات المنقى بمثابة دليل على التكيف لأن القيم المتوقعة α ASBT وDSBT β يمكن استخلاصها من طيف امتصاص المقبول وطيف الانبعاثات المانحة، على التوالي (الشكل 6). قيم ASBT متشابهة في الخلايا (α = 0.094) ومع الفلوروفوريس المنقى (α = 0.114) وقريبة من القيمة المتوقعة من 0.096 بسبب انخفاض امتصاص الخلوية في 514 نانومتر. وDSBT من β = 0.498 مع البروتينات المنقى هو أيضا قريبة من القيمة المتوقعة من 0.406. النزف الطيفي من خلال مزيد من يعتمد على الإعداد; الليزر الصمام الثنائي من 445 أو 440 نانومتر تقليل الإثارة المباشرة من EYFP وبالتالي تقليل ASBT. تتميز AOBSs بفارق انتقال أصغر من المرايا الديكهروية. وهكذا، فإن الكشف عن EYFP يتعزز في نطاق 500 إلى 510 نانومتر، ويمكن أن يؤدي إلى ASBT إضافية في قناة المانحة. ومع ذلك، تشير الخصائص الطيفية ل EYFP إلى أقل من 1٪ من الانبعاثات من الحد الأقصى للذروة، مع الأخذ في الاعتبار كل من الإثارة الأقل فعالية وكثافة الانبعاثات المنخفضة. الفجوة مرشح أوسع بكثير مع مرايا ديكهروبيك، مما أدى إلى قمع إضافية من هذا القبيل تبادلي مقبول.
استخدام القيم من البروتينات النقية لا يعكس الوضع في الخلية. وينطبق الشيء نفسه على المعايرة من قبل العامل ξ. على الرغم من أن عامل المعايرة كان مشابها لكل من LSM ، إلا أنه كان أعلى بكثير في القياسات مع البروتين المؤتلف ، مما يكشف عن تأثير الأصباغ الخلوية. وتجدر الإشارة إلى أن الضوضاء في الخلفية في هذه القياسات كانت ضئيلة ولكن يمكن اكتشافها ولم تؤثر على الكثافات الملاحظة. وعلى النقيض من قياسات عمر المانح، فإن تجارب الانبعاثات الحساسة حساسة تجاه نسبة المانحين إلى المقبولين بحيث يؤدي فائض المانحين إلى انخفاض كفاءة FRET.
ومع ذلك ، كان التعبير البروتيني تحت سيطرة CaMV35S المروج في التجارب الحالية. وكثيرا ما يستخدم هذا المروج للإفراط في التعبير عن البروتينات في النباتات، ويمكن أن يؤدي إلى كميات عالية من البروتينات غير الفسيولوجية13. في ظل هذه الظروف، يزيد احتمال التفاعل، وقد تحدث نتائج إيجابية كاذبة مع تركيزات بروتين أعلى. رسم كثافة الانبعاثات ضد كفاءة FRET ثم يؤدي إلى زيادة كفاءة FRET مع زيادة كثافة الانبعاثات ويسمح لتقييم البيانات FRET فيما يتعلق بمستوى التعبير.
من المستحسن فصل تجارب الكولوكالات عالية الدقة عن قياسات FRET. بالنسبة للكولوكالات، يتم اختيار الإعدادات المثلى لكل فلوروفور، بينما تتداخل كثافة الانبعاثات والضبط الدقيق من قبل قطر الثقب مع ظروف الصورة المثلى. ومع ذلك، لا يزال فصل العضيات والمعلومات المتعلقة بالهياكل دون الخلوية مشمولا في قياسات FRET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
نحن نضمن أن جميع المؤلفين قد كشفوا عن أي وجميع تضارب المصالح وليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
أجريت التجارب في منصة تكنولوجيا المجهر الخفيف (LiMiTec) التابعة لكلية البيولوجيا، جامعة بيليفيلد. وقد مولت جامعة بيليفيلد هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
