Summary
Se proporciona un protocolo para configurar un microscopio de barrido láser confocal estándar para mediciones de transferencia de energía de resonancia Förster in vivo , seguido de una evaluación de datos.
Abstract
Los experimentos de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) basados en emisiones sensibilizadas se realizan fácilmente, pero dependen de la configuración microscópica. Los microscopios de barrido láser confocal se han convertido en un caballo de batalla para los biólogos. Los sistemas comerciales ofrecen una alta flexibilidad en el ajuste de potencia láser y la sensibilidad del detector y, a menudo, combinan diferentes detectores para obtener la imagen perfecta. Sin embargo, la comparación de datos basados en la intensidad de diferentes experimentos y configuraciones a menudo es imposible debido a esta flexibilidad. Los procedimientos amigables para los biólogos son una ventaja y permiten un ajuste simple y confiable de la configuración del láser y el detector.
Además, como los experimentos FRET en células vivas se ven afectados por la variabilidad en la expresión de proteínas y las relaciones donante-aceptor, los niveles de expresión de proteínas deben considerarse para la evaluación de datos. Aquí se describe un protocolo simple para mediciones FRET confiables y reproducibles, que incluye rutinas para la estimación de la expresión de proteínas y el ajuste de la intensidad del láser y la configuración del detector. La evaluación de los datos se realizará mediante calibración con una fusión de fluoróforos de eficiencia FRET conocida. Para mejorar la simplicidad, se han comparado los factores de corrección que se han obtenido en las células y mediante la medición de proteínas fluorescentes recombinantes.
Introduction
La transferencia de energía de resonancia de Förster ((F)RET) se observa típicamente mediante espectroscopia de fluorescencia, aunque el proceso en sí no se limita a ocurrir entre fluoróforos. El acoplamiento dipolo-dipolo subyacente simplemente requiere una molécula donante emisora de luz y un aceptor que absorba la luz. Esto se deriva de la superposición espectral requerida integral J de los espectros normalizados de emisión y absorbancia aceptora del donante1. Sin embargo, debido a que RET compite con la fluorescencia, la transferencia de energía se vuelve medible por alteraciones en la emisión de fluorescencia: RET induce el enfriamiento del donante y la emisión del aceptor sensibilizado.
El RET basado en fluoróforos se ha denominado transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) para separarla de la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET). RET depende en gran medida de la distancia entre el donante y el aceptor, que está ampliamente en el rango de 0.5-10 nm2 y, por lo tanto, en el mismo rango que las dimensiones de las proteínas y sus complejos. En segundo lugar, RET depende de la orientación dipolo-dipolo kappa al cuadrado. Combinado con el hecho de que la libertad rotacional de los fluoróforos unidos a proteínas puede ser descuidada debido al peso molecular y la lenta relajación rotacional, RET permite el análisis de alteraciones conformacionales3.
El llamado radio de Förster se basa en la integral de superposición espectral y el rango de longitud de onda de la superposición, de modo que los cromóforos que absorben la luz roja dan como resultado radios de Förster más largos que los tintes que absorben la luz azul. Como el rango dinámico de las mediciones FRET está limitado por 0.5 × R0 y 1.5 × R0, el par FRET ECFP-EYFP tiene un rango dinámico de 2.5-7.3 nm debido a su R0 de 4.9 nm4.
El brillo de un fluoróforo viene dado por el producto de su coeficiente de extinción molar y su rendimiento cuántico. Para las mediciones FRET, es ventajoso elegir fluoróforos de brillo casi similar. Esto mejora la detección del enfriamiento del donante y la emisión sensibilizada del aceptor. También favorece la calibración del sistema de microscopía. Al observar los pares FRET de proteínas cian y fluorescentes de uso frecuente, el menor brillo de las proteínas fluorescentes cian se vuelve obvio (Figura 1A).
Sin embargo, la vida útil del aceptor debe ser inferior a la vida útil del donante, lo que garantiza la disponibilidad del aceptor para la transferencia de energía. Si la vida del aceptante excede la vida del donante, el aceptor aún podría estar en el estado excitado cuando el donante se excita nuevamente. Las proteínas fluorescentes cian avanzadas como mTurquoise muestran una vida útil prolongada y, por lo tanto, contribuyen a una mayor probabilidad de FRET (Figura 1B). La probabilidad de FRET también depende del coeficiente de extinción molar del aceptor.
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Protocol
NOTA: Para el siguiente protocolo, se realizó la transfección transitoria de protoplastos, como se describió anteriormente12. A continuación se ofrece una breve descripción.
1. Transfección transitoria de protoplastos
- Cortar ~4 g de hojas sanas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia en rodajas de 1 mm y transferirlas a 20 mL de solución enzimática (1,5% celulasa; 0,4% macerozima; 0,1% de albúmina sérica bovina Fracción V; 0,4 M de manitol; 20 mM KCl; 20 mM de ácido 2-(N-morpholino)etanosulfónico (MES), pH 5,7; 10 mM CaCl2).
- Infiltrar al vacío las rodajas de hoja seguido de una incubación con agitación durante 2 h a temperatura ambiente. Cosechar las células por centrifugación durante 3 min a 100 × g.
- Lavar los protoplastos con solución W5 (154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5.7) y resuspendirlos en solución MMG (0.4 M manitol; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5.7).
- Realizar la transfección en un deslizamiento de 8 pocillos por choque osmótico en presencia de polietilenglicol (PEG) 4000. Mezclar 20 μL de la suspensión de protoplastos con 5 μL de ADN plásmido (5 μg/μL) y 25 μL de solución de PEG (0,2 M de manitol, 0,1 M de CaCl2, 40% de PEG 4000).
- Revertir el choque osmótico mediante un reajuste suave de las condiciones osmóticas.
NOTA: Además de la muestra de interés, se requiere la expresión de donante solo y aceptor solo para determinar el sangrado espectral del donante y el aceptor, respectivamente. Una proteína de fusión del donante y el aceptor también debe expresarse para fines de calibración. La expresión de la proteína fluorescente estuvo bajo el control de un promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (pCaMV35S). Para todas las mediciones, se utilizaron dos microscopios de barrido láser confocales (LSM1 y LSM2). LSM1 tiene dos tipos de detectores: para las mediciones FRET, la señal del donante fue detectada por un detector GaAsP, mientras que la emisión fret y del aceptor se registraron con un fotomultiplicador. LSM2 tiene dos fotomultiplicadores, que se utilizaron para la detección de emisión de donantes, FRET y aceptores.
2. Ajuste láser
NOTA: Aquí, se han aplicado líneas de 458 nm y 514 nm de un láser de iones de argón para el análisis FRET entre proteínas fluorescentes cian mejoradas (ECFP) y proteínas fluorescentes amarillas mejoradas (EYFP). Para la adquisición de datos reproducibles, ambas líneas se ajustaron a una intensidad similar. Esto se logró mediante un fotomultiplicador de transmisión o el modo de reflexión.
- Ajuste láser con un fotomultiplicador de transmisión
- Use un pozo vacío para el ajuste.
- Elija el modo de escaneo de línea y la vista de histograma.
- Disminuya la intensidad del láser al mínimo y ajuste la ganancia del detector al ruido de fondo detectable.
- Aumente la intensidad del láser en pasos del 0,5% y registre la señal correspondiente.
- Aplique la rutina para ambas líneas láser.
- Ajuste láser con modo de reflexión
- Use un pozo vacío para el ajuste.
- Aplique un filtro de reflexión, active el modo de reflexión, si está disponible.
- Asegúrese de que el rango de longitud de onda del detector cubra la longitud de onda del láser.
- Elija el modo de escaneo de línea y la vista de histograma.
- Disminuya la intensidad del láser al mínimo y ajuste la ganancia del detector al ruido de fondo detectable.
- Mueva el objetivo a la posición más baja.
- Mueva el objetivo hacia arriba hasta que el reflejo del deslizamiento sea visible.
- Aumente la intensidad del láser en pasos del 0,5% y registre la señal correspondiente.
- Aplique la rutina para ambas líneas láser.
- Evaluación de datos
- Tabular los datos y ordenarlos por intensidades de señal.
- Traza las intensidades de la señal contra la potencia relativa del láser.
- Elija intensidades láser que resulten en una intensidad de señal similar.
3. Ajuste de fotomultiplicadores
NOTA: Después del ajuste con láser, los fotomultiplicadores se ajustaron a las ganancias individuales para obtener una sensibilidad similar. Esta calibración se realizó con la línea láser de 514 nm, que se encuentra en el centro del rango de longitud de onda de interés.
- Use un pozo vacío para el ajuste.
- Aplique un filtro de reflexión y cambie al modo de reflexión si está disponible.
- Asegúrese de que el rango de longitud de onda del detector cubra la longitud de onda del láser (514 nm).
- Elija el modo de escaneo de línea y la vista de histograma.
- Disminuya la ganancia del detector a la mitad del máximo y ajuste la intensidad del láser al ruido de fondo detectable.
- Mueva el objetivo a la posición más baja.
- Mueva el objetivo hacia arriba hasta que el reflejo del deslizamiento sea visible.
- Aumente la ganancia del detector en pasos de 50 a 100 V y registre la señal correspondiente.
- Aplique los pasos 3.1 a 3.8 para ambos detectores.
- Evaluación de datos
- Grafique la intensidad contra la ganancia del detector para cada detector.
- Elija las ganancias individuales del detector para obtener una sensibilidad similar.
4. Adquisición de imágenes FRET
NOTA: Comience con la muestra de interés para configurar la adquisición de imágenes.
- Elija los filtros/espejos dicroicos apropiados, por ejemplo, un espejo dicroico doble MBS 458/514 para el par FRET ECFP/EYFP. Utilice el mismo espejo dicroico para todos los canales para permitir el escaneo línea por línea. Seleccione un objetivo de inmersión en agua para la obtención de imágenes de células vivas. Elija escaneo de 12 bits o 16 bits y velocidad de escaneo moderada.
- Definir el rango de detección, preferiblemente 470-510 nm para la detección del donante y 530-600 nm para la detección del aceptor/FRET en el caso de ECFP/EYFP. Cuando utilice un láser de diodo de 445 nm o 440 nm, utilice de 450 a 510 nm como rango de detección. En el caso de un divisor de haz acústico-óptico (AOBS), defina la detección del donante en el rango de 450 a 500 nm para evitar la detección de aceptores no deseados.
- Aplique la configuración del detector de acuerdo con 3.10.2.
- Aplique la configuración del láser de acuerdo con 2.3.2. Revise la intensidad del láser en función de la tabla de potencia láser obtenida, si es necesario. Asegúrese de que la relación señal-ruido cubra todo el rango dinámico de los detectores (intensidad que oscila entre 0 y 4095 para el escaneo de 12 bits).
- Mantenga constantes las intensidades del láser y las ganancias del detector. Utilice el diámetro estenopeico para el ajuste fino.
NOTA: Tenga en cuenta que los cambios en el diámetro estenopeico afectan la resolución espacial. - Realice las mediciones (tome imágenes de al menos 20 células).
5. Determinación de las correcciones de diafonía
NOTA: Las células que expresan solo el donante o el aceptor deben determinar el sangrado espectral del donante (DSBT) y el sangrado espectral del aceptor (ASBT), respectivamente. Mantenga la misma configuración descrita en la sección 4.
- Realizar mediciones FRET con células que expresan el fluoróforo del donante.
- Realice mediciones FRET con células que expresan el fluoróforo aceptor.
6. Calibración de las mediciones según Beemiller et al.13
NOTA: Se requieren células que expresen una fusión donante-aceptor de la eficiencia FRET conocida. Aquí, se ha utilizado una fusión ECFP-5 aa-EYFP con una eficiencia FRET de 0,464. Mantenga la misma configuración descrita en la sección 4.
- Realizar mediciones FRET con células que expresan la fusión donante-aceptor
7. Evaluación de datos
- Obtenga perfiles de línea de las celdas, asegurando que cada perfil no contenga más de una celda. Guarde los perfiles como archivos de texto.
- Importe los archivos de texto a una hoja de cálculo mediante la opción de importación de archivos de texto de la sección Datos .
- Lea los valores máximos aplicando la función Max .
- Enumere los valores obtenidos en una tabla, tenga una columna cada uno para la identificación de emisión del donante, la IF de emisión de FRET, la emisión de IA del aceptor y al menos cuatro conjuntos de datos: solo donante, solo aceptor, fusión donante-aceptor y medición.
NOTA: La excitación del donante también resulta en la excitación directa del aceptor y causa ASBT que se describe por el valor α. - Calcule los valores de α ASBT con el conjunto de datos de solo aceptor utilizando la ecuación (1).
(1)
NOTA: Utilice la mediana de todos los valores α en las ecuaciones siguientes. El donante muestra un amplio espectro de emisión que da como resultado la diafonía de emisión con la emisión sensibilizada del aceptor. Este DSBT viene dado por el valor β. - Calcule los valores de β de sangrado espectral del donante con el conjunto de datos solo para donantes utilizando la ecuación (2).
(2)
NOTA: Utilice la mediana de todos los valores de β en las siguientes ecuaciones. El factor de calibración ξ describe la relación lineal del enfriamiento del donante derivado de FRET y la emisión sensibilizada del aceptor. Utilice las medianas de 7,5 y 7,6 en las siguientes ecuaciones. - Calcule los factores de calibración ξ con el conjunto de datos de fusión donante-aceptor y su eficiencia FRET E (0.46) utilizando la ecuación (3).
(3)
NOTA: Utilice la mediana de todos los valores ξ en las siguientes ecuaciones. - Calcular las eficiencias FRET del par de proteínas de interés utilizando las ecuaciones (4) y (5).
(4)
(5) - Estimar los efectos de la fuerza de expresión y/o la relación donante-aceptor: graficar la suma de ID, IF e IA contra las eficiencias de FRET. Realizar una regresión lineal; tenga en cuenta que cuanto más pronunciado es el gráfico y más alto es R2 , mayor es el impacto del nivel de expresión o mayor es la diferencia de abundancia de donante y aceptor.
(1)
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Representative Results
Ajuste del microscopio de barrido láser confocal
El ajuste láser reveló un aumento lineal de la emisión con el aumento de la intensidad del láser (Figura 2 y Tabla 1). Como era de esperar para los láseres de iones de argón, la emisión de la línea de 514 nm fue mucho mayor que la emisión de la línea de 458 nm, como lo demuestra una pendiente más pronunciada. Para experimentos posteriores, se eligió una potencia láser de 4,5% y 6,5% para la línea de 514 nm y la línea de 458 nm, respectivamente. Esto resultó en una intensidad de emisión casi igual de 1123 (514 nm) y 1141 (458 nm).
Variar las ganancias del detector a una potencia láser constante reveló un comportamiento exponencial para ambos detectores analizados. Se obtuvieron intensidades de emisión similares para una ganancia de 700 V (Figura 3). Aunque el ajuste de las líneas láser se benefició del comportamiento lineal, el ajuste de los detectores probablemente se vea afectado por el comportamiento exponencial, lo que resulta en marcadas diferencias con cambios menores en la ganancia a voltajes más altos. Desafortunadamente, este rango más alto es de interés para mediciones en células vivas, ya que el aumento de la potencia del láser es citotóxico y promueve el fotoblanqueo.
Determinación del sangrado espectral
En un primer momento, se analizó el sangrado espectral del donante y del aceptor con ECFP purificado recombinante y EYFP; DSBT β = 0,498 y ASBT α = 0,100. Lo mismo se hizo con las células que expresan ECFP o EYFP. Con LSM 2, el DSBT estimado fue de β = 1,602 ± 0,207 (promedio ± DE) y ASBT fue α = 0,119 ± 0,018. Los valores medios fueron β = 1,506 y α = 0,120. Esta discrepancia entre los datos obtenidos en células vivas y los datos obtenidos con proteína recombinante demuestra que es imposible omitir la determinación del sangrado espectral en células vivas. Esto es probablemente causado por pigmentos celulares.
Las imágenes revelan el mayor brillo de EYFP en comparación con ECFP (Figura 4 y Tabla 2). Compensar las diferencias de brillo mediante diferentes ajustes láser mejora el rango dinámico del donante y el canal FRET. Proporcionar la salida relativa midiendo las intensidades del láser, como se hace para el ajuste, aún aumenta la reproducibilidad de las mediciones.
Para LSM 1, β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 con medianas de α = 0,084 y β = 0,180. La determinación del ASBT depende del ajuste del láser y de un solo detector, y por lo tanto, la determinación del ASBT funcionó bien. El DBST involucra dos detectores, lo que resulta en resultados muy diferentes para ambos microscopios. Cabe recordar que LSM 2 está equipado con dos fotomultiplicadores, mientras que LSM 1 utiliza un detector GaAsP y un fotomultiplicador, dos tipos diferentes de detectores con diferentes propiedades espectrales y sensibilidad. En consecuencia, el ajuste funciona mejor con dos detectores idénticos.
Calibración de la medición
Para la calibración, se aplicaron los valores medios de α y β, y se utilizó una fusión de ECFP y EYFP como estándar de eficiencia FRET conocida (E = 0,46). La calibración de ECFP-EYFP recombinante y purificado dio como resultado un valor de ξ de 13,44, mientras que las mediciones in vivo revelaron un valor de ξ de 1,525 ± 1,844. La mediana fue de 0,798, revelando valores atípicos extremos junto con la desviación estándar alta. Para LSM 1, los valores fueron ξ = 1,978 ± 0,807 con una mediana de ξ = 1,883. Para LSM 2 y LSM 1, los conjuntos de datos obtenidos para el cálculo de ξ (Tabla 3) fueron estadísticamente idénticos, como lo demuestra la prueba t de Student (p > 0.2).
Medición FRET
Como prueba de concepto, la medición FRET se repitió con la fusión donante-aceptor. La eficiencia FRET medida fue de 0,47 ± 0,07 para la proteína purificada y 0,47 ± 0,06 en células vivas con LSM 2 (Tabla 4). La mediana de las mediciones en células vivas fue E = 0,45. Para LSM 1, la eficiencia FRET fue de 0,46 ± 0,09 con una mediana de E = 0,45 (Tabla 4). Estos datos demuestran la calibración efectiva con una construcción FRET de la eficiencia FRET conocida.
Efectos del nivel de expresión y la relación donante-aceptor
Para el conjunto de datos analizado, las eficiencias fret no fueron influenciadas por el nivel de expresión. Debido a la fusión del donante y el aceptor, la proporción también fue constante. La inclusión de conjuntos de datos anteriores reveló una dependencia del nivel de expresión en un caso (Figura 5). La eficiencia FRET entre las subunidades de ATPasa vacuolar (V-ATPasa) marcadas, VHA-A-ECFP y VHA-a-EYFP, disminuyó con el aumento de la intensidad de la señal. Por el contrario, la interacción entre VHA-E1-ECFP y VHA-C-EYFP fue independiente de la intensidad de la señal. En el caso de VHA-A y VHA-a, las tres copias de VHA-A son reemplazadas cada vez más por VHA-A-ECFP, lo que resulta en un exceso de donantes en comparación con la copia única de VHA-a en el complejo. Aunque VHA-E1 podría estar presente en forma de tres copias, la alta solubilidad de VHA-C podría abolir este efecto en este ejemplo. Aquí, las eficiencias de FRET han sido comparativamente bajas. Este enfoque simple permite probar artefactos de expresión y proporción.
Figura 1: Descripción general de los pares freT de proteínas fluorescentes con donantes emisores de cian. (A) Los radios de Förster de los pares y el brillo del donante y el aceptor se dan para los pares FRET bien caracterizados. B) Comparación de la vida del donante y del aceptador. Los asteriscos grises indican una desintegración multiexponencial. Abreviaturas: FRET = transferencia de energía de resonancia de Förster; CFP = proteína fluorescente cian; GFP = proteína fluorescente verde; YFP = proteína fluorescente amarilla; mX = X monomérico; EX = X mejorada; SX = super X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ajuste láser. La emisión de los láseres se registró por la reflexión del coverslip y se graficó contra la intensidad relativa del láser modulada por el filtro sintonizable acústico-óptico del LSM. Se muestra la emisión de la línea de 458 nm (A) y la línea de 514 nm (B) de un láser de iones de argón. Abreviaturas: LSM = microscopio de barrido láser; r.u. = unidades relativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Intensidad de ganancia y emisión del detector. Las intensidades de emisión resultantes se registraron en el modo de reflexión para ganancias del detector que oscilaron entre 300 y 750 V y de 300 a 750 V para el detector 1 (A) y el detector 2 (B), respectivamente. Abreviatura = r.u. = unidades relativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Sangrado espectral. Las imágenes se obtuvieron en los canales donante, fret y aceptor. (A) Imágenes obtenidas con proteínas fluorescentes purificadas; barras de escala = 100 μm; (B) imágenes correspondientes para las células que expresan las proteínas fluorescentes; barras de escala = 10 μm. (C) Gráficos de los valores SBT obtenidos; se da la media ± SD. Abreviaturas: FRET = transferencia de energía de resonancia de Förster; SBT = sangrado espectral; ECFP = proteína fluorescente cian mejorada; EYFP = proteína fluorescente amarilla mejorada; LSM = microscopio de barrido láser; ASBT = aceptor SBT; DSBT = donante SBT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efectos del nivel de expresión y/o de la relación donante-aceptor. La suma de las emisiones en los canales donante, FRET y aceptor se ha trazado contra la eficiencia de FRET. Esto se ha hecho para VHA-E1-ECFP y VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP y VHA-a-EYFP (B), y la fusión ECFP-EYFP (C). Se realizó regresión lineal; se dan la ecuación y R2 . Abreviaturas: FRET = transferencia de energía de resonancia de Förster; ECFP = proteína fluorescente cian mejorada; EYFP = proteína fluorescente amarilla mejorada; VHA = subunidad atPasa vacuolar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Sangrado del donante y del aceptor de ECFP y EYFP. Los espectros de las proteínas fluorescentes se obtuvieron de la base de datos FP14. (A) Durante los experimentos de emisión sensibilizada, las vastas porciones del donante y el aceptor son detectadas por fotomultiplicadores individuales, llamados PMT1 y PMT2, respectivamente. La emisión de ECFP también es detectable por el detector aceptor tras la excitación con 458 nm. El sangrado espectral del donante calculado en PMT2 es del 40,6% de la emisión detectada por PMT1. (B) El espectro de emisión de EYFP demuestra que EYFP muestra excitación directa a 458 nm, que se aplica con frecuencia para la excitación de donantes cian. La eficiencia de excitación esperada es del 9,6% de la excitación a 514 nm. Abreviaturas: FP = proteína fluorescente; ECFP = proteína fluorescente cian mejorada; EYFP = proteína fluorescente amarilla mejorada; PMT = fotomultiplicador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Potencia del láser e intensidad de la señal. Las intensidades de señal de la línea de 458 nm se dan en azul, las intensidades de señal de la línea de 514 nm en verde. Las intensidades aplicadas para el experimento están resaltadas en gris. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Intensidades de señal para la determinación de SBT. Se dan los máximos registrados y los valores α y β calculados. Abreviaturas: SBT = sangrado espectral; LSM = microscopio de barrido láser; FRET = Transferencia de energía de resonancia de Förster; ASBT = aceptor SBT; DSBT = donante SBT. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Intensidades de señal para calibración. Se dan los máximos registrados y los valores ξ calculados. Los valores corregidos corresponden a las intensidades de la señal FRET menos SBT. Abreviaturas: SBT = sangrado espectral; LSM = microscopio de barrido láser; FRET = Transferencia de energía de resonancia de Förster. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4: Intensidades de señal para mediciones FRET. Se dan los valores máximos y E registrados. Los valores corregidos corresponden a las intensidades de la señal FRET menos SBT. Los valores E calibrados se calcularon con calibración por ξ. Abreviaturas: SBT = sangrado espectral; LSM = microscopio de barrido láser; FRET = Transferencia de energía de resonancia de Förster; cal. = calibrado. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
El enfriamiento del donante y la emisión sensibilizada del aceptor se caracterizan por una relación lineal que permite el cálculo del FRET basado en el donante o el aceptor. Los factores correspondientes de linealidad se denominan factor G (donante a aceptor) o xi (aceptor a donante), que son valores recíprocos4. La medición de FRET entre proteínas fluorescentes por microscopía de fluorescencia a menudo requiere correcciones para DSBT y ASBT debido a los amplios espectros de absorción y emisión de las proteínas fluorescentes. Sin embargo, muchas correcciones dependen de un ASBT medible, que es un factor en el denominador de las ecuaciones en la sección 7 del protocolo, y un α = 0 da como resultado ecuaciones indefinidas5,6.
Se recomienda un ajuste de las intensidades del láser para evitar tales efectos. Esto permite el uso de cálculos basados en el aceptor y la fácil detección de proporciones inapropiadas donante-aceptor. En este protocolo, se ha aplicado la ecuación de Beemiller y colaboradores, que tiene la ventaja de una calibración simple mediante una única construcción de referencia de la eficiencia FRET conocida. El ajuste de los detectores es crítico, especialmente cuando se aplican dos tipos diferentes de detectores. Los datos anteriores obtenidos con dos fotomultiplicadores idénticos y ganancias idénticas dieron como resultado una β constante = 0,61 para múltiples experimentos durante años7,8,9 y demuestran que el ajuste del detector es ventajoso para la reproducibilidad. Si los detectores no permiten un ajuste confiable, un escaneo secuencial con un solo detector en modo fotograma a fotograma podría ser una opción para evitar el sesgo de las propiedades del detector.
Las mediciones en las células vegetales se ven afectadas por muchos pigmentos, que resultan en la absorción de luz de excitación y la autofluorescencia de fondo. Los pigmentos celulares son excitados principalmente por la luz en el rango UV a azul4,10. Esto explica la discrepancia entre las mediciones en las células y aquellas con proteínas purificadas. Las proteínas purificadas podrían servir como prueba de ajuste porque los valores esperados para asbt α y DSBT β pueden derivarse del espectro de absorción del aceptor y del espectro de emisión del donante, respectivamente (Figura 6). Los valores de ASBT son similares en células (α = 0,094) y con fluoróforos purificados (α = 0,114) y cercanos al valor esperado de 0,096 debido a la baja absorción celular a 514 nm. El DSBT de β = 0.498 con proteínas purificadas también está cerca del valor esperado de 0.406. El sangrado espectral depende además de la configuración; Los láseres de diodo de 445 o 440 nm reducen la excitación directa de EYFP y, por lo tanto, reducen el ASBT. Los AOBS se caracterizan por una brecha de transmisión más pequeña que los espejos dicroicos. Por lo tanto, la detección de EYFP se mejora en el rango de 500 a 510 nm y podría resultar en ASBT adicional en el canal donante. Sin embargo, las propiedades espectrales de EYFP apuntan a menos del 1% de emisión del pico máximo, considerando tanto una excitación menos efectiva como una baja intensidad de emisión. El espacio del filtro es mucho más amplio con espejos dicroicos, lo que resulta en una supresión adicional de dicha diafonía aceptora.
El uso de los valores de las proteínas purificadas no refleja la situación en la célula. Lo mismo es cierto para la calibración por el factor ξ. Aunque el factor de calibración ha sido similar para ambos LSM, fue mucho mayor en las mediciones con la proteína recombinante, revelando el impacto de los pigmentos celulares. Cabe mencionar que en estas mediciones, el ruido de fondo era insignificante pero detectable y no afectaba a las intensidades observadas. A diferencia de las mediciones de la vida útil del donante, los experimentos de emisión sensibilizada son sensibles a la relación donante-aceptor, de modo que un exceso de donante resulta en una disminución de la eficiencia de FRET.
Sin embargo, la expresión de la proteína ha estado bajo el control del promotor CaMV35S en los presentes experimentos. Este promotor se utiliza con frecuencia para la sobreexpresión de proteínas en las plantas y puede dar lugar a cantidades infisiológicamente altas de proteínas13. En tales condiciones, la probabilidad de interacción aumenta, y los resultados falsos positivos pueden ocurrir con concentraciones más altas de proteínas. El trazado de las intensidades de emisión contra la eficiencia fret da como resultado un aumento de la eficiencia FRET con una intensidad de emisión creciente y permite la evaluación de los datos FRET con respecto al nivel de expresión.
Se recomienda separar los experimentos de colocalización de alta resolución de las mediciones FRET. Para la colocalización, se eligen ajustes óptimos para cada fluoróforo, mientras que para el registro FRET, las intensidades de emisión y el ajuste fino por el diámetro estenopeico interfieren con las condiciones óptimas de la imagen. Sin embargo, la separación de orgánulos y la información sobre las estructuras subcelulares todavía se incluyen en las mediciones de FRET.
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Disclosures
Nos aseguramos de que todos los autores hayan revelado todos y cada uno de los conflictos de intereses y no tengan intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los experimentos se realizaron en la Plataforma de Tecnología de Microscopía de Luz (LiMiTec) de la Facultad de Biología de la Universidad de Bielefeld. Este trabajo ha sido financiado por la Universidad de Bielefeld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
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