Förster Resonanz-Energietransfermessungen in lebenden Pflanzenzellen

Summary

Es wird ein Protokoll für die Einrichtung eines konfokalen Standard-Laser-Scanning-Mikroskops für in vivo Förster-Resonanzenergieübertragungsmessungen mit anschließender Datenauswertung bereitgestellt.

Abstract

Experimente mit sensibilisierter Emissionsbasis des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) sind einfach durchzuführen, hängen jedoch vom mikroskopischen Aufbau ab. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskope sind zu einem Arbeitstier für Biologen geworden. Kommerzielle Systeme bieten eine hohe Flexibilität bei der Laserleistungsanpassung und Detektorempfindlichkeit und kombinieren oft verschiedene Detektoren, um das perfekte Bild zu erhalten. Der Vergleich von intensitätsbasierten Daten aus verschiedenen Experimenten und Aufbauten ist aufgrund dieser Flexibilität jedoch oft unmöglich. Biologenfreundliche Verfahren sind von Vorteil und ermöglichen eine einfache und zuverlässige Anpassung der Laser- und Detektoreinstellungen.

Da FRET-Experimente in lebenden Zellen von der Variabilität der Proteinexpression und des Spender-Akzeptor-Verhältnisses beeinflusst werden, müssen Proteinexpressionsniveaus für die Datenauswertung berücksichtigt werden. Beschrieben wird hier ein einfaches Protokoll für zuverlässige und reproduzierbare FRET-Messungen, einschließlich Routinen zur Abschätzung der Proteinexpression und Anpassung der Laserintensität und der Detektoreinstellungen. Die Datenauswertung erfolgt durch Kalibrierung mit einer Fluorophorfusion bekannter FRET-Effizienz. Um die Einfachheit zu verbessern, wurden Korrekturfaktoren verglichen, die in Zellen und durch Messung rekombinanter fluoreszierender Proteine erhalten wurden.

Introduction

Der Förster-Resonanzenergietransfer ((F)RET) wird typischerweise durch Fluoreszenzspektroskopie beobachtet, obwohl der Prozess selbst nicht auf die Durchführung zwischen Fluorophoren beschränkt ist. Die zugrunde liegende Dipol-Dipol-Kopplung erfordert lediglich ein lichtemittierendes Donormolekül und einen lichtabsorbierenden Akzeptor. Dies leitet sich aus dem erforderlichen spektralen Überlappungsintegrat J der normierten Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren1 ab. Da RET jedoch mit der Fluoreszenz konkurriert, wird der Energietransfer durch Änderungen der Fluoreszenzemission messbar: RET induziert Donorabschreckung und sensibilisierte Akzeptoremission.

Fluorophor-basierte RET wurde als Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) bezeichnet, um sie von der Biolumineszenz-Resonanz-Energieübertragung (BRET) zu trennen. Die RET hängt stark vom Abstand zwischen Donor und Akzeptor ab, der weit im Bereich von 0,5-10 ^nm2 liegt und damit im gleichen Bereich wie die Abmessungen von Proteinen und ihren Komplexen liegt. Zweitens hängt die RET von der Dipol-Dipol-Orientierung kappa im Quadrat ab. In Kombination mit der Tatsache, dass die Rotationsfreiheit von proteingebundenen Fluorophoren aufgrund des Molekulargewichts und der langsamen Rotationsrelaxation vernachlässigt werden kann, ermöglicht RET die Analyse von Konformationsveränderungen3.

Der sogenannte Försterradius basiert auf dem spektralen Überlappungsintegral und dem Wellenlängenbereich der Überlappung, so dass rotlichtabsorbierende Chromophore zu längeren Försterradien führen als blaulichtabsorbierende Farbstoffe. Da der Dynamikbereich der FRET-Messungen durch 0,5 × _R0 und 1,5 × _R0 begrenzt ist, hat das FRET-Paar ECFP-EYFP aufgrund seines _R0 von 4,9 ^nm4 einen Dynamikbereich von 2,5-7,3 nm.

Die Helligkeit eines Fluorophors ist durch das Produkt seines molaren Extinktionskoeffizienten und seiner Quantenausbeute gegeben. Für FRET-Messungen ist es vorteilhaft, Fluorophore mit nahezu ähnlicher Helligkeit zu wählen. Dies verbessert den Nachweis von Donorabschreckung und sensibilisierter Akzeptoremission. Es begünstigt auch die Kalibrierung des Mikroskopiesystems. Betrachtet man die häufig verwendeten FRET-Paare von Cyan- und fluoreszierenden Proteinen, wird die geringere Helligkeit der cyanfluoreszierenden Proteine deutlich (Abbildung 1A).

Die Lebensdauer des Akzeptors muss jedoch niedriger sein als die Lebensdauer des Spenders, um die Verfügbarkeit des Akzeptors für die Energieübertragung sicherzustellen. Wenn die Lebensdauer des Akzeptors die Lebensdauer des Spenders überschreitet, befindet sich der Akzeptor möglicherweise noch im angeregten Zustand, wenn der Spender erneut angeregt wird. Fortschrittliche cyan fluoreszierende Proteine wie mTurquoise zeigen eine verlängerte Lebensdauer und tragen somit zu einer erhöhten WAHRSCHEINLICHKEIT von FRET bei (Abbildung 1B). Die Wahrscheinlichkeit einer FRET hängt auch vom molaren Extinktionskoeffizienten des Akzeptors ab.

Protocol

HINWEIS: Für das folgende Protokoll wurde eine transiente Transfektion von Protoplasten durchgeführt, wie zuvor ^{beschrieben12}. Im Folgenden finden Sie eine kurze Beschreibung.

1. Transiente Transfektion von Protoplasten

1. Schneiden Sie ~4 g gesunde Blätter von Arabidopsis thaliana ecotype Columbia in 1 mm dicke Scheiben und übertragen Sie sie auf 20 ml Enzymlösung (1,5% Cellulase; 0,4% Macerozym; 0,1% RinderserumalbuminFraktion V; 0,4 M Mannitol; 20 mM KCl; 20 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), pH 5,7; 10 mM _CaCl2).
2. Vakuuminfiltrieren Sie die Blattscheiben, gefolgt von einer Inkubation mit Rührung für 2 h bei Raumtemperatur. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation für 3 min bei 100 × g.
3. Die Protoplasten werden mit W5-Lösung (154 mM NaCl; 125 mM _CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5,7) gewaschen und in MMG-Lösung (0,4 M Mannitol; 15 mM _MgCl2; 4 mM MES, pH 5,7) resuspendiert.
4. Führen Sie die Transfektion in einem 8-Well-Objektträger durch osmotischen Schock in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG) 4000 durch. Mischen Sie 20 μL der Protoplastensuspension mit 5 μL Plasmid-DNA (5 μg/μL) und 25 μL PEG-Lösung (0,2 M Mannitol, 0,1 M _CaCl2, 40% PEG 4000).
5. Kehren Sie den osmotischen Schock durch sanftes Nachjustieren der osmotischen Bedingungen um.
   ANMERKUNG: Neben der interessierenden Stichprobe ist die Expression des Donors allein und des Akzeptors allein erforderlich, um das spektrale Durchbluten des Donors bzw. des Akzeptors zu bestimmen. Ein Fusionsprotein des Donors und des Akzeptors muss ebenfalls zu Kalibrierzwecken exprimiert werden. Die fluoreszierende Proteinexpression stand unter der Kontrolle eines Blumenkohlmosaikvirus 35S Promotors (pCaMV35S). Für alle Messungen wurden zwei konfokale Laser-Scanning-Mikroskope (LSM1 und LSM2) verwendet. LSM1 verfügt über zwei Arten von Detektoren: Für FRET-Messungen wurde das Donorsignal von einem GaAsP-Detektor detektiert, während FRET- und Akzeptoremission mit einem Photomultiplier aufgezeichnet wurden. LSM2 verfügt über zwei Photomultiplier, die zum Nachweis von Donor-, FRET- und Akzeptoremissionen verwendet wurden.

2. Laser-Einstellung

HINWEIS: Hier wurden 458 nm und 514 nm Linien eines Argon-Ionen-Lasers für die FRET-Analyse zwischen Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP)- und Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP)-markierten Proteinen angewendet. Zur reproduzierbaren Datenerfassung wurden beide Linien auf eine ähnliche Intensität eingestellt. Dies wurde entweder durch einen Transmissionsphotomultiplier oder den Reflexionsmodus erreicht.

1. Lasereinstellung mit einem Transmissionsphotomultiplier
   1. Verwenden Sie einen leeren Brunnen zur Anpassung.
   2. Wählen Sie den Zeilenscanmodus und die Histogrammansicht.
   3. Verringern Sie die Laserintensität auf ein Minimum und passen Sie die Detektorverstärkung an erkennbare Hintergrundgeräusche an.
   4. Erhöhen Sie die Laserintensität in Schritten von 0,5% und zeichnen Sie das entsprechende Signal auf.
   5. Wenden Sie die Routine für beide Laserlinien an.
2. Lasereinstellung mit Reflexionsmodus
   1. Verwenden Sie einen leeren Brunnen zur Anpassung.
   2. Wenden Sie einen Reflexionsfilter an und schalten Sie den Reflexionsmodus ein, falls verfügbar.
   3. Stellen Sie sicher, dass der Wellenlängenbereich des Detektors die Wellenlänge des Lasers abdeckt.
   4. Wählen Sie den Zeilenscanmodus und die Histogrammansicht.
   5. Verringern Sie die Laserintensität auf ein Minimum und passen Sie die Detektorverstärkung an erkennbare Hintergrundgeräusche an.
   6. Verschieben Sie das Ziel an die niedrigste Position.
   7. Bewegen Sie das Ziel nach oben, bis die Reflexion des Deckglases sichtbar ist.
   8. Erhöhen Sie die Laserintensität in Schritten von 0,5% und zeichnen Sie das entsprechende Signal auf.
   9. Wenden Sie die Routine für beide Laserlinien an.
3. Datenauswertung
   1. Tabellieren Sie die Daten und sortieren Sie die Daten nach Signalintensitäten.
   2. Zeichnen Sie die Signalintensitäten gegen die relative Laserleistung auf.
   3. Wählen Sie Laserintensitäten, die zu einer ähnlichen Signalintensität führen.

3. Einstellung von Photomultipliern

HINWEIS: Nach der Laseranpassung wurden die Photomultiplier an einzelne Gewinne angepasst, um eine ähnliche Empfindlichkeit zu erhalten. Diese Kalibrierung wurde mit der 514 nm Laserlinie durchgeführt, die sich im Zentrum des interessierenden Wellenlängenbereichs befindet.

1. Verwenden Sie einen leeren Brunnen zur Anpassung.
2. Wenden Sie einen Reflexionsfilter an, und wechseln Sie in den Reflexionsmodus, falls verfügbar.
3. Stellen Sie sicher, dass der Wellenlängenbereich des Detektors die Wellenlänge des Lasers (514 nm) abdeckt.
4. Wählen Sie den Zeilenscanmodus und die Histogrammansicht.
5. Verringern Sie die Detektorverstärkung auf die Hälfte des Maximums und passen Sie die Laserintensität an erkennbare Hintergrundgeräusche an.
6. Verschieben Sie das Ziel an die niedrigste Position.
7. Bewegen Sie das Ziel nach oben, bis die Reflexion des Deckglases sichtbar ist.
8. Erhöhen Sie die Detektorverstärkung in Schritten von 50 bis 100 V und zeichnen Sie das entsprechende Signal auf.
9. Wenden Sie die Schritte 3.1 bis 3.8 für beide Detektoren an.
10. Datenauswertung
    1. Zeichnen Sie die Intensität gegen die Detektorverstärkung für jeden Detektor auf.
    2. Wählen Sie die einzelnen Detektorgewinne, um eine ähnliche Empfindlichkeit zu erhalten.

4. FRET-Bilderfassung

HINWEIS: Beginnen Sie mit der interessanten Stichprobe für die Einrichtung der Bilderfassung.

1. Wählen Sie die geeigneten Filter/dichroiten Spiegel, z.B. einen doppelten dichroitischen Spiegel MBS 458/514 für das FRET-Paar ECFP/EYFP. Verwenden Sie für alle Kanäle denselben dichroitischen Spiegel, um zeilenweises Scannen zu ermöglichen. Wählen Sie ein Wasserimmersionsobjektiv für die Bildgebung lebender Zellen. Wählen Sie 12-Bit- oder 16-Bit-Scanning und moderate Scangeschwindigkeit.
2. Definieren Sie den Nachweisbereich, vorzugsweise 470-510 nm für den Spenderdetektion und 530-600 nm für den Akzeptor-/FRET-Nachweis im Fall von ECFP/EYFP. Wenn Sie einen 445 nm oder 440 nm Diodenlaser verwenden, verwenden Sie 450 bis 510 nm als Erfassungsbereich. Definieren Sie im Falle eines akusto-optischen Strahlteilers (AOBS) die Donordetektion im Bereich von 450 bis 500 nm, um eine Erkennung unerwünschter Akzeptoren zu verhindern.
3. Wenden Sie die Detektoreinstellung gemäß 3.10.2 an.
4. Wenden Sie die Lasereinstellung gemäß 2.3.2 an. Überarbeiten Sie bei Bedarf die Laserintensität basierend auf der erhaltenen Laserleistungstabelle. Stellen Sie sicher, dass das Signal-Rausch-Verhältnis den gesamten Dynamikbereich der Detektoren abdeckt (Intensität von 0 bis 4095 für 12-Bit-Scanning).
5. Halten Sie die Laserintensitäten und Detektorgewinne konstant. Verwenden Sie den Lochdurchmesser für die Feinabstimmung.
   HINWEIS: Beachten Sie, dass Änderungen des Lochdurchmessers die räumliche Auflösung beeinflussen.
6. Führen Sie die Messungen durch (nehmen Sie Bilder von mindestens 20 Zellen auf).

5. Ermittlung von Übersprechkorrekturen

HINWEIS: Zellen, die nur den Donor oder den Akzeptor exprimieren, müssen das Donor Spectral Bleed-Through (DSBT) bzw. das Acceptor Spectral Bleed-Through (ASBT) bestimmen. Behalten Sie die in Abschnitt 4 beschriebenen Einstellungen bei.

1. Führen Sie FRET-Messungen mit Zellen durch, die das Donorfluorophor exprimieren.
2. Führen Sie FRET-Messungen mit Zellen durch, die den Akzeptorfluorophor exprimieren.

6. Kalibrierung der Messungen nach Beemiller et ^al.13

HINWEIS: Es werden Zellen benötigt, die eine Donor-Akzeptor-Fusion mit bekannter FRET-Effizienz exprimieren. Hier kam eine ECFP-5 aa-EYFP-Fusion mit einem FRET Wirkungsgrad von 0,46 zum ^Einsatz4. Behalten Sie die in Abschnitt 4 beschriebenen Einstellungen bei.

1. Führen Sie FRET-Messungen mit Zellen durch, die die Donor-Akzeptor-Fusion exprimieren

7. Datenauswertung

1. Rufen Sie Linienprofile der Zellen ab, und stellen Sie sicher, dass jedes Profil nicht mehr als eine Zelle enthält. Speichern Sie die Profile als Textdateien.
2. Importieren Sie die Textdateien mithilfe der Option zum Importieren von Textdateien im Abschnitt Daten in eine Tabelle.
3. Lesen Sie die Maximalwerte aus, indem Sie die Max-Funktion anwenden.
4. Listen Sie die erhaltenen Werte in einer Tabelle auf, haben Sie jeweils eine Spalte für Donor-Emissions-ID, FRET-Emission _IF, Akzeptor-Emission _IA und mindestens vier Datensätze: nur Donor, Nur Akzeptor, Donor-Akzeptor-Fusion und Messung.
   HINWEIS: Die Anregung des Donors führt auch zu einer direkten Anregung des Akzeptors und verursacht ASBT, das durch den α Wert beschrieben wird.
5. Berechnen Sie die ASBT-α-Werte mit dem reinen Akzeptor-Dataset unter Verwendung von Gleichung (1).
   (1)
   HINWEIS: Verwenden Sie den Median aller α-Werte in den folgenden Gleichungen. Der Donor zeigt ein breites Emissionsspektrum, das zu einem Emissionsübersprechen mit der sensibilisierten Emission des Akzeptors führt. Dieser DSBT wird durch den β-Wert angegeben.
6. Berechnen Sie die Spektraldurchblutungswerte des Spenders β mit dem reinen Spenderdatensatz unter Verwendung von Gleichung (2).
   (2)
   HINWEIS: Verwenden Sie den Median aller β Werte in den folgenden Gleichungen. Der Kalibrierfaktor ξ beschreibt die lineare Beziehung von FRET-abgeleiteter Donorabschreckung und sensibilisierter Emission des Akzeptors. Verwenden Sie in den folgenden Gleichungen die Mediane von 7,5 und 7,6.
7. Berechnen Sie die Kalibrierfaktoren ξ mit dem Donor-Akzeptor-Fusionsdatensatz und seiner FRET-Effizienz E (0,46) unter Verwendung der Gleichung (3).
   (3)
   HINWEIS: Verwenden Sie den Median aller ξ-Werte in den folgenden Gleichungen.
8. Berechnen Sie die FRET-Wirkungsgrade des interessierenden Proteinpaares anhand der Gleichungen (4) und (5).
   (4)
   (5)
9. Schätzen Sie die Auswirkungen der Expressionsstärke und/oder des Donor-Akzeptor-Verhältnisses: Zeichnen Sie die Summe von _ID, _IF und _IA gegen die FRET-Wirkungsgrade auf. Führen Sie eine lineare Regression durch. Beachten Sie, dass je steiler der Graph und je höher ^R2 ist, desto höher ist der Einfluss des Expressionsniveaus oder desto größer ist die Differenz der Donor- und Akzeptorhäufigkeit.

Representative Results

Justierung des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops
Die Lasereinstellung ergab eine lineare Zunahme der Emission mit zunehmender Laserintensität (Abbildung 2 und Tabelle 1). Wie für Argon-Ionen-Laser zu erwarten, war die Emission der 514-nm-Linie viel höher als die Emission der 458-nm-Linie, wie eine steilere Steigung belegt. Für nachfolgende Experimente wurde eine Laserleistung von 4,5% bzw. 6,5% für die 514-nm-Linie bzw. die 458-nm-Linie gewählt. Dies führte zu einer nahezu gleichen Emissionsintensität von 1123 (514 nm) und 1141 (458 nm).

Die Variation der Detektorgewinne bei konstanter Laserleistung ergab ein exponentielles Verhalten für beide analysierten Detektoren. Ähnliche Emissionsintensitäten wurden für eine Verstärkung von 700 V erhalten (Abbildung 3). Obwohl die Anpassung der Laserlinien vom linearen Verhalten profitierte, wird die Anpassung der Detektoren wahrscheinlich durch das exponentielle Verhalten beeinflusst, was zu deutlichen Unterschieden mit geringfügigen Änderungen der Verstärkung bei höheren Spannungen führt. Leider ist dieser höhere Bereich für Messungen in lebenden Zellen von Interesse, da die Erhöhung der Laserleistung zytotoxisch ist und das Photobleichen fördert.

Bestimmen des spektralen Durchblutens
Zunächst wurden die spektrale Durchblutung des Donors und des Akzeptors mit rekombinant gereinigtem ECFP und EYFP analysiert; DSBT β = 0,498 und ASBT α = 0,100. Dasselbe wurde mit Zellen gemacht, die entweder ECFP oder EYFP exprimierten. Mit LSM 2 betrug der geschätzte DSBT β = 1,602 ± 0,207 (mittlere ± SD) und ASBT war α = 0,119 ± 0,018. Die Medianwerte waren β = 1,506 und α = 0,120. Diese Diskrepanz zwischen den in lebenden Zellen gewonnenen Daten und den mit rekombinantem Protein gewonnenen Daten zeigt, dass es unmöglich ist, die Bestimmung des spektralen Durchblutens in lebenden Zellen wegzulassen. Dies wird wahrscheinlich durch zelluläre Pigmente verursacht.

Die Bilder zeigen die höhere Helligkeit von EYFP im Vergleich zu ECFP (Abbildung 4 und Tabelle 2). Die Kompensation der Helligkeitsunterschiede durch unterschiedliche Lasereinstellungen erhöht den Dynamikumfang des Donors und des FRET-Kanals. Die Bereitstellung der relativen Ausgabe durch Messung der Laserintensitäten, wie sie für die Einstellung erfolgt, erhöht immer noch die Reproduzierbarkeit der Messungen.

Für LSM 1 β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 mit Medianen von α = 0,084 und β = 0,180. Die Bestimmung des ASBT hängt von der Lasereinstellung und einem einzelnen Detektor ab, und somit hat die Bestimmung des ASBT gut funktioniert. Der DBST umfasst zwei Detektoren, was zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen für beide Mikroskope führt. Es sollte daran erinnert werden, dass LSM 2 mit zwei Photomultipliern ausgestattet ist, während LSM 1 einen GaAsP-Detektor und einen Photomultiplier verwendet, zwei verschiedene Arten von Detektoren mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften und Empfindlichkeiten. Dementsprechend funktioniert die Einstellung besser mit zwei identischen Detektoren.

Kalibrierung der Messung
Für die Kalibrierung wurden die Medianwerte von α und β angewendet, und eine Fusion von ECFP und EYFP wurde als Standard der bekannten FRET-Effizienz (E = 0,46) verwendet. Die Kalibrierung von rekombinantem und gereinigtem ECFP-EYFP ergab einen ξ-Wert von 13,44, während die In-vivo-Messungen einen ξ-Wert von 1,525 ± 1,844 ergaben. Der Median betrug 0,798 und offenbarte extreme Ausreißer zusammen mit der hohen Standardabweichung. Für LSM 1 waren die Werte ξ = 1,978 ± 0,807 mit einem Median von ξ = 1,883. Für LSM 2 und LSM 1 waren die für die Berechnung von ξ erhaltenen Datensätze statistisch identisch, wie der Student's t-Test (p > 0,2) belegt.

FRET-Messung
Als Proof of Concept wurde die FRET-Messung mit der Donor-Akzeptor-Fusion wiederholt. Die gemessene FRET-Effizienz betrug 0,47 ± 0,07 für das gereinigte Protein und 0,47 ± 0,06 in lebenden Zellen mit LSM 2 (Tabelle 4). Der Median der Messungen in lebenden Zellen betrug E = 0,45. Für LSM 1 betrug der FRET-Wirkungsgrad 0,46 ± 0,09 mit einem Median von E = 0,45 (Tabelle 4). Diese Daten zeigen die effektive Kalibrierung mit einem FRET-Konstrukt bekannter FRET-Effizienz.

Auswirkungen des Expressionsniveaus und des Donor-Akzeptor-Verhältnisses
Für den analysierten Datensatz wurden die FRET-Wirkungsgrade nicht durch das Expressionsniveau beeinflusst. Durch die Verschmelzung von Donor und Akzeptor war auch das Verhältnis konstant. Die Einbeziehung früherer Datensätze ergab in einem Fall eine Abhängigkeit von der Ausdrucksebene (Abbildung 5). Die FRET-Effizienz zwischen den markierten vakuolären ATPase(V-ATPase)-Untereinheiten VHA-A-ECFP und VHA-a-EYFP nahm mit zunehmender Signalintensität ab. Im Gegensatz dazu war die Wechselwirkung zwischen VHA-E1-ECFP und VHA-C-EYFP unabhängig von der Signalintensität. Im Falle von VHA-A und VHA-a werden die drei Kopien von VHA-A zunehmend durch VHA-A-ECFP ersetzt, was zu einem Spenderüberschuss im Vergleich zur Einzelkopie von VHA-a im Komplex führt. Obwohl VHA-E1 in Form von drei Kopien vorliegen kann, könnte die hohe Löslichkeit von VHA-C diesen Effekt in diesem Beispiel aufheben. Hier waren die FRET-Wirkungsgrade vergleichsweise gering. Dieser einfache Ansatz ermöglicht das Testen von Ausdrucks- und Verhältnisartefakten.

Abbildung 1: Überblick über fluoreszierende Protein-FRET-Paare mit Cyan-emittierenden Donatoren. (A) Die Förster-Radien der Paare und die Helligkeit von Donor und Akzeptor sind für gut charakterisierte FRET-Paare angegeben. (B) Vergleich der Lebenszeit des Spenders und des Akzeptors. Graue Sternchen weisen auf einen multiexponentiellen Zerfall hin. Abkürzungen: FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; CFP = cyanfarbenes fluoreszierendes Protein; GFP = grün fluoreszierendes Protein; YFP = gelb fluoreszierendes Protein; mX = monomeres X; EX = erweitertes X; SX = super X. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Lasereinstellung. Die Emission der Laser wurde durch die Reflexion des Deckglases aufgezeichnet und gegen die relative Laserintensität aufgetragen, die durch den akusto-optisch abstimmbaren Filter des LSM moduliert wurde. Die Emission der 458-nm-Linie (A) und der 514-nm-Linie (B) eines Argon-Ionen-Lasers wird dargestellt. Abkürzungen: LSM = Laser-Scanning-Mikroskop; r.u. = relative Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Detektorverstärkung und Emissionsintensität. Die resultierenden Emissionsintensitäten wurden im Reflexionsmodus für Detektorverstärkungen im Bereich von 300 bis 750 V bzw. 300 bis 750 V für Detektor 1 (A) bzw. Detektor 2 (B) aufgezeichnet. Abkürzung = r.u. = relative Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Spektrales Durchbluten. Bilder wurden im Donor-, dem FRET- und dem Akzeptorkanal aufgenommen. (A) Bilder, die mit gereinigten fluoreszierenden Proteinen aufgenommen wurden; Maßstabsbalken = 100 μm; (B) entsprechende Bilder für Zellen, die die fluoreszierenden Proteine exprimieren; Maßstabsbalken = 10 μm. (C) Graphen der erhaltenen SBT-Werte; mittlere ± SD angegeben ist. Abkürzungen: FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; SBT = spektrales Durchbluten; ECFP = enhanced cyan fluorescent protein; EYFP = verstärktes gelb fluoreszierendes Protein; LSM = Laser-Scanning-Mikroskop; ASBT = Akzeptor SBT; DSBT = Spender-SBT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Auswirkungen des Expressionsniveaus und/oder des Spender-Akzeptor-Verhältnisses. Die Summe der Emissionen in den Donor-, FRET- und Akzeptorkanälen wurde gegen die FRET-Effizienz aufgetragen. Dies wurde für VHA-E1-ECFP und VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP und VHA-a-EYFP (B) und die ECFP-EYFP-Fusion (C) durchgeführt. Lineare Regression wurde durchgeführt; die Gleichung und ^R2 sind gegeben. Abkürzungen: FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; ECFP = enhanced cyan fluorescent protein; EYFP = verstärktes gelb fluoreszierendes Protein; VHA = vakuoläre ATPase-Untereinheit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Donor- und Akzeptor-Durchblutung von ECFP und EYFP. Die Spektren der fluoreszierenden Proteine wurden aus der ^{FP-Datenbank14} gewonnen. (A) Während sensibilisierter Emissionsexperimente werden die großen Teile des Donors und des Akzeptors von einzelnen Photomultipliern mit den Namen PMT1 bzw. PMT2 nachgewiesen. Die ECFP-Emission ist auch vom Akzeptordetektor bei Anregung mit 458 nm nachweisbar. Die berechnete spektrale Durchblutung des Donors in PMT2 beträgt 40,6% der von PMT1 nachgewiesenen Emission. (B) Das Emissionsspektrum von EYFP zeigt, dass EYFP eine direkte Anregung bei 458 nm zeigt, die häufig für die Anregung von Cyan-Donatoren angewendet wird. Der erwartete Anregungswirkungsgrad beträgt 9,6% der Anregung bei 514 nm. Abkürzungen: FP = fluoreszierendes Protein; ECFP = enhanced cyan fluorescent protein; EYFP = verstärktes gelb fluoreszierendes Protein; PMT = Photomultiplier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Laserleistung und Signalintensität. Die Signalintensitäten der 458 nm Linie sind blau, die Signalintensitäten der 514 nm Linie grün angegeben. Die für das Experiment verwendeten Intensitäten sind grau hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Signalintensitäten für die SBT-Bestimmung. Aufgezeichnete Maxima und berechnete α und β Werte werden angegeben. Abkürzungen: SBT = spectral bleed-through; LSM = Laser-Scanning-Mikroskop; FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; ASBT = Akzeptor SBT; DSBT = Spender-SBT. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Signalintensitäten für die Kalibrierung. Aufgezeichnete Maxima und berechnete ξ-Werte werden angegeben. Korrigierte Werte entsprechen den FRET-Signalintensitäten minus SBT. Abkürzungen: SBT = spectral bleed-through; LSM = Laser-Scanning-Mikroskop; FRET = Förster Resonanzenergieübertragung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Signalintensitäten für FRET-Messungen. Aufgezeichnete Maxima und E-Werte werden angegeben. Korrigierte Werte entsprechen den FRET-Signalintensitäten minus SBT. Kalibrierte E-Werte wurden mit Kalibrierung mit ξ berechnet. Abkürzungen: SBT = spectral bleed-through; LSM = Laser-Scanning-Mikroskop; FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; cal. = kalibriert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Die Donorabschreckung und die sensibilisierte Akzeptoremission zeichnen sich durch eine lineare Beziehung aus, die eine donor- oder akzeptorbasierte Berechnung der FRET ermöglicht. Die entsprechenden Faktoren der Linearität werden entweder G-Faktor (Donor zu Akzeptor) oder xi (Akzeptor zu Donor) genannt, die reziproke Werte ^sind4. Die Messung des FRET zwischen fluoreszierenden Proteinen mittels Fluoreszenzmikroskopie erfordert aufgrund der breiten Absorptions- und Emissionsspektren der fluoreszierenden Proteine häufig Korrekturen für DSBT und ASBT. Viele Korrekturen hängen jedoch von einem messbaren ASBT ab, der ein Faktor im Nenner der Gleichungen in Protokollabschnitt 7 ist, und ein α = 0 führt zu undefinierten ^{Gleichungen5,6}.

Eine Einstellung der Laserintensitäten wird empfohlen, um solche Effekte zu vermeiden. Dies ermöglicht die Verwendung von akzeptorbasierten Berechnungen und die einfache Erkennung unangemessener Spender-Akzeptor-Verhältnisse. In diesem Protokoll wurde die Gleichung von Beemiller und Mitarbeitern angewendet, die den Vorteil einer einfachen Kalibrierung durch ein einziges Referenzkonstrukt bekannter FRET-Effizienz hat. Die Einstellung der Detektoren ist kritisch, insbesondere wenn zwei verschiedene Arten von Detektoren verwendet werden. Frühere Daten, die mit zwei identischen Photomultipliern und identischen Verstärkungen erhalten wurden, führten zu einer konstanten β = 0,61 für mehrere Experimente über ^Jahre7,8,9 und zeigen, dass die Detektoranpassung für die Reproduzierbarkeit von Vorteil ist. Wenn die Detektoren keine zuverlässige Anpassung zulassen, kann ein sequenzieller Scan mit einem einzelnen Detektor in einem Frame-by-Frame-Modus eine Option sein, um Verzerrungen durch Detektoreigenschaften zu vermeiden.

Messungen in Pflanzenzellen werden von vielen Pigmenten beeinflusst, die zu einer Anregungslichtabsorption und Einer Autofluoreszenz im Hintergrund führen. Die Zellpigmente werden hauptsächlich durch Licht im UV- bis Blaubereich angeregt4,10. Dies erklärt die Diskrepanz zwischen den Messungen in Zellen und denen mit gereinigten Proteinen. Die gereinigten Proteine könnten als Anpassungsnachweis dienen, da die Erwartungswerte für ASBT-α und DSBT-β aus dem Akzeptorabsorptionsspektrum bzw. dem Donoremissionsspektrum abgeleitet werden können (Abbildung 6). Die Werte von ASBT sind in Zellen (α = 0,094) und mit gereinigten Fluorophoren (α = 0,114) ähnlich und aufgrund der geringen zellulären Absorption bei 514 nm nahe am Erwartungswert von 0,096. Der DSBT von β = 0,498 mit gereinigten Proteinen liegt ebenfalls nahe am erwarteten Wert von 0,406. Das spektrale Durchbluten hängt weiter vom Aufbau ab; Diodenlaser von 445 oder 440 nm reduzieren die direkte Anregung von EYFP und damit den ASBT. AOBS zeichnen sich durch einen kleineren Transmissionsspalt als dichroitische Spiegel aus. Somit wird der Nachweis von EYFP im Bereich von 500 bis 510 nm verbessert und könnte zu zusätzlichem ASBT in den Donorkanal führen. Die spektralen Eigenschaften von EYFP deuten jedoch auf eine Emission von weniger als 1% des maximalen Peaks hin, wobei sowohl die weniger effektive Anregung als auch die geringe Emissionsintensität berücksichtigt werden. Der Filterspalt ist bei dichroitischen Spiegeln viel größer, was zu einer zusätzlichen Unterdrückung eines solchen Akzeptorübersprechens führt.

Die Verwendung der Werte aus gereinigten Proteinen spiegelt nicht die Situation in der Zelle wider. Gleiches gilt für die Kalibrierung mit dem Faktor ξ. Obwohl der Kalibrierungsfaktor für beide LSM ähnlich war, war er in Messungen mit dem rekombinanten Protein viel höher, was den Einfluss zellulärer Pigmente aufzeigt. Es sollte erwähnt werden, dass bei diesen Messungen das Hintergrundrauschen vernachlässigbar, aber nachweisbar war und die beobachteten Intensitäten nicht beeinflusste. Im Gegensatz zu Messungen der Spenderlebensdauer sind sensibilisierte Emissionsexperimente empfindlich gegenüber dem Donor-Akzeptor-Verhältnis, so dass ein Überschuss an Donor zu einer verminderten FRET-Effizienz führt.

Die Proteinexpression stand jedoch in den vorliegenden Experimenten unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors. Dieser Promotor wird häufig für die Überexpression von Proteinen in Pflanzen verwendet und kann zu unphysiologisch hohen Proteinmengen ^führen13. Unter solchen Bedingungen steigt die Wahrscheinlichkeit einer Wechselwirkung, und bei höheren Proteinkonzentrationen können falsch-positive Ergebnisse auftreten. Die Darstellung der Emissionsintensitäten gegen den FRET-Wirkungsgrad führt dann zu einem steigenden FRET-Wirkungsgrad mit zunehmender Emissionsintensität und ermöglicht die Auswertung der FRET-Daten in Bezug auf das Expressionsniveau.

Es wird empfohlen, hochauflösende Kolokalisierungsexperimente von FRET-Messungen zu trennen. Für die Kolokalisation werden für jeden Fluorophor optimale Einstellungen gewählt, während für die FRET-Aufnahme Emissionsintensitäten und fein abgestimmte Angaben durch den Lochdurchmesser die optimalen Bildbedingungen beeinträchtigen. Dennoch sind die Trennung von Organellen und Informationen über subzelluläre Strukturen immer noch in FRET-Messungen enthalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-well slides	Ibidi	80821
Immersion oil Immersol  W2010	Zeiss	444969-0000-000	refraction index of water
LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope	Zeiss
LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope	Zeiss