Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dural stimulering og periorbital von Frey test hos mus som en præklinisk model af hovedpine

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

Det mest bemærkelsesværdige symptom på migræne er alvorlige hovedsmerter, og det antages, at dette formidles af sensoriske neuroner, der innerverer meninges. Her præsenterer vi en metode til lokalt at anvende stoffer på dura på en minimalt invasiv måde, mens vi bruger ansigtsoverfølsomhed som output.

Abstract

De kraniale meninges, der består af dura mater, arachnoid og pia mater, menes primært at tjene strukturelle funktioner for nervesystemet. For eksempel beskytter de hjernen mod kraniet og forankrer / organiserer den vaskulære og neuronale forsyning af cortex. Meninges er imidlertid også impliceret i nervesystemforstyrrelser som migræne, hvor smerten oplevet under migræne tilskrives lokal steril inflammation og efterfølgende aktivering af lokale nociceptive afferenter. Af lagene i meninges er dura mater af særlig interesse for migrænes patofysiologi. Det er stærkt vaskulariseret, har lokale nociceptive neuroner og er hjemsted for en bred vifte af hjemmehørende celler såsom immunceller. Subtile ændringer i det lokale meningeale mikromiljø kan føre til aktivering og sensibilisering af dural perivaskulære nociceptorer, hvilket fører til migrænesmerter. Undersøgelser har forsøgt at adressere, hvordan durale afferenter bliver aktiveret / sensibiliseret ved hjælp af enten in vivo elektrofysiologi, billeddannelsesteknikker eller adfærdsmodeller, men disse kræver ofte meget invasive operationer. Denne protokol præsenterer en metode til forholdsvis ikke-invasiv anvendelse af forbindelser på dura mater i mus og en egnet metode til måling af hovedpinelignende taktil følsomhed ved hjælp af periorbital von Frey-test efter dural stimulering. Denne metode opretholder integriteten af dura og kraniet og reducerer forvirrende virkninger fra invasive teknikker ved at injicere stoffer gennem en 0,65 mm modificeret kanyle ved krydset mellem usmeltede sagittale og lambdoid suturer. Denne prækliniske model vil gøre det muligt for forskere at undersøge en bred vifte af dural stimuli og deres rolle i den patologiske progression af migræne, såsom nociceptoraktivering, immuncelleaktivering, vaskulære ændringer og smerteadfærd, samtidig med at der opretholdes skadefrie tilstande til kraniet og meninges.

Introduction

Migrænesmerter er fortsat et stort folkesundhedsproblem over hele verden. Verdenssundhedsorganisationen rangerer den som den sjette mest udbredte sygdom i verden, der rammer knap 15% af Jordens befolkning1 og forårsager en betydelig socioøkonomisk byrde for samfundet 2,3. Behandlingsmuligheder og deres virkning har været suboptimale og giver kun symptomatisk lindring og ændrer ikke signifikant patofysiologiske hændelser, der under migræneforekomst 4,5. Manglen på behandlingssucces skyldes sandsynligvis, at migræne er en multifaktoriel lidelse, hvis patologi er dårligt forstået, hvilket fører til et begrænset antal terapeutiske mål. Migræne er også udfordrende at fange fuldt ud i dyremodeller, især i betragtning af at migrænediagnosen stilles på baggrund af verbal kommunikation med patienter, der beskriver deres oplevelse med migrænekendetegn som aura, hovedpine, fotofobi og allodyni. Ikke desto mindre er det vigtigt at bemærke, at de seneste fremskridt inden for migrænebehandlinger i øjeblikket overgår behandlinger for mange neurologiske tilstande, der er blevet godt valideret af prækliniske modeller. For eksempel har monoklonale antistoffer og små molekyler, der er målrettet mod calcitonin genrelateret peptid eller dets receptor, haft stor succes med at forbedre livskvaliteten for migrænepatienter og kan potentielt transformere den kliniske styring af migræne. Mens der har været fremskridt i forståelsen af denne lidelse, er der fortsat meget, der endnu ikke er belyst.

Baseret på prækliniske dyremodeller og humane undersøgelser er det almindeligt accepteret, at migrænehovedpine initieres ved afvigende aktivering af nociceptive fibre inden for meninges, der signalerer gennem trigeminus- og øvre cervikal dorsal-root ganglier 6,7,8,9,10. På trods af denne teori bruger mange undersøgelser stadig systemisk administration af lægemidler til at forstå underliggende bidragende mekanismer i migræne. Mens systemisk dosering af lægemidler har styrket vores forståelse væsentligt, vurderer disse resultater ikke direkte, om lokale handlinger inden for målvævet af interesse spiller en rolle i migræne. Omvendt har flere undersøgelser taget en tilgang til at stimulere duraen; Disse eksperimenter kræver imidlertid kanyleimplantation via en invasiv kraniotomi og forlængede restitutionstider11,12. På grund af disse begrænsninger udviklede vi en minimalt invasiv tilgang til lokalt at stimulere duraen, hvor manglen på en kraniotomi eliminerer postkirurgisk genopretning og giver mulighed for øjeblikkelig testning i vågne dyr 12,13,14. Disse injektioner udføres under let isofluranbedøvelse og administreres ved krydset mellem sagittale og lambdoid suturer i mus.

Flere tilgange er blevet udviklet til at evaluere nociceptive adfærdsmæssige reaktioner hos gnavere15. Kutan allodyni er blevet rapporteret hos ca. 80% af migrænepatienter16,17 og repræsenterer et potentielt translationelt endepunkt til brug hos gnavere. I prækliniske modeller er anvendelsen af von Frey-filamenter på plantarområdet i gnaverpoten blevet brugt til at vurdere smerteadfærd i prækliniske migrænemodeller. Den primære begrænsning ved denne tilgang er, at den ikke tester den cephaliske region. Ansigtsgrimasse scoring er blevet brugt til at fange smerteadfærd hos gnavere ved at analysere ansigtsudtryk efter induktion af smertestimuli18,19. Imidlertid omfatter dens begrænsninger kun at fange reaktioner på akutte stimuli og ikke kroniske orofaciale smertetilstande. Ansigtspleje og nedsat opdræt betragtes også som output af adfærdsmæssige reaktioner i prækliniske modeller af migræne20,21. Begrænsninger af førstnævnte omfatter vanskeligheder med at skelne smerteresponser fra normal rutinemæssig pleje og andre fornemmelser såsom kløe. I tilfælde af sidstnævnte falder opdrætsadfærd typisk hurtigt efter introduktionen af gnavere til nye miljøer. Selvom hvert af disse adfærdsmæssige endepunkter er værdifulde i forståelsen af forskellige mekanismer, der bidrager til smertetilstande, er der et kritisk behov for prækliniske modeller af smertelidelser som migræne for at inkludere endepunkter, der specifikt fanger cephalic overfølsomhedsresponser. Vurdering af den periorbitale huds taktile overfølsomhed efter dural stimulering er en metode, der kan give bedre indsigt i mekanismer, der bidrager til migræne, hvor sensoriske symptomer overvejende er cephaliske. Her beskriver vi en metode til at administrere stoffer på musen dura som en præklinisk model af migræne. Efter dural anvendelse præsenterer vi også en detaljeret metode til test af periorbital taktil overfølsomhed ved hjælp af kalibrerede von Frey-filamenter anvendt i Dixon-op-ned-metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev udført med forudgående godkendelse af det institutionelle Animal Care and Use Committee ved University of Texas i Dallas. ICR (CD-1) (30-35 g) og C57/BL6 (25-30 g) mus i alderen 6-8 uger blev anvendt i dette studie.

1. Dural infuser

  1. Opret museinfusere/injektorer ved at ændre en kommercielt tilgængelig intern kanyle og infusionsstof til ensidige injektioner med en ikke-metallisk smeltet silicaplasthætte, der er justerbar og indsættes i/strækker sig under en 28 G styrekanula med indvendig diameter (I.D.) på 0,18 mm og en ydre diameter (O.D.) på 0,35 mm (figur 1A).
  2. Brug en tykkelse eller anden måleenhed til at justere den smeltede silicaplasthætte på infusionsenheden til en længde på 0,6 mm; målt fra spidsen af infusionsenheden til kanten af silicaplasthætten.
    1. Vær forsigtig med ikke at bøje eller sløve infusionsenheden, når du justerer plastikhætten.
    2. For andre musestammer, der ikke tidligere har været anvendt til duralinjektioner, bestemmes den optimale infusionslængde ved at indstille længden til 0,6 mm og udføre pilotinjektioner med blæk eller farvestof, justere infusionslængden, indtil det observeres, at farvestoffet kun er i dura mater og ikke på hjernen eller kraniet.
  3. Fastgør den lange ende (eller den ende, der ikke blev målt til at være 0,6 mm) af den justerede infusionsenheden til plastrør (pumperør, 2-stop, I.D. 0,19 mm, længde 406 mm).
    1. Skær slangen til en minimumslængde på 8 in for at sikre, at der er tilstrækkelig linje til at holde et volumen på 5 μL.
    2. Sørg for, at slangen dækker metaldelen og toppen af plastproppen placeret på infusionsenheden. Dette vil medvirke til at forhindre luftbobler i at akkumulere i linjen.
  4. Fastgør den anden ende af slangen til en 10 μL glasmikrosprøjte (gastæt; cementnål; 21 G med en 10 mm fremspring), igen, og sørg for at have en tæt tætning over metaldelen af sprøjten (figur 1A).
  5. Når linjen er tilsluttet, fyldes sprøjten op med 5 μL fosfatbufret saltvand (PBS), syntetisk interstitiel væske (SIF) eller andre valgte køretøjer for at forhindre dannelse af luftbobler.
    1. Hvis der observeres luftbobler i linjen, skal du oversvømme linjen med køretøjet, indtil boblerne er spredt.
      BEMÆRK: Det kan hjælpe at fylde sprøjten med køretøjet, inden den fastgøres til linjen, og derefter skubbe væsken gennem ledningen, når den er tilsluttet.
  6. Når linjen er fyldt op igen med 5 μL af køretøjet og fungerer effektivt, skal du lægge 5 μL af lægemidlet/opløsningen i Hamilton-sprøjten (blæk eller farvestof kan anvendes som et alternativ til lægemidlet/opløsningen, hvis du lærer eller praktiserer denne teknik).
    1. Sørg for, at alle køretøjsopløsninger, der administreres på duraen, opretholdes ved pH 7,4 og måles til en osmolalitet på 310. Dette reducerer den potentielle aktivering af syrefølende ionkanaler og andre osmosensitive kanaler i duraen.
  7. Det maksimale volumen, der er testet i mus, der ikke forårsagede lækage i hjernen, er ca. 10 μL. De adfærdsmæssige virkninger efter injektioner med dette volumen er ikke blevet testet. Af denne grund administreres kun 5 μL af opløsningen på duraen.
    BEMÆRK: Disse observationer er baseret på musestammer/aldre/vægte hos 6-8 uger gamle CD1/ICR-mus.

2. Dural injektioner

  1. Når sprøjten er forberedt, og lægemidlet er indlæst, skal du placere en mus fladt på maven og bedøve den under korte 3% isofluran med en iltstrømningshastighed på 0,5-1 l / min via næsecone.
    1. Når musen ikke længere viser en knivrefleks, skal du justere anæstesien og opretholde den ved en 1,5% isofluran.
  2. Når du er bedøvet, skal du anvende steril optalmisk salve på øjnene og barbere dyrets hoved og derefter desinficere huden med povidon-jod og ethanol. Efter dette skal du komme i en position, der fremmer en vellykket injektion.
  3. Brug den ene hånd til at stabilisere dyrets hoved og hold infusionsenheden med den anden hånd.
  4. Undersøg forsigtigt og find krydset mellem sagittale og lambdoidale suturer på musens kranium (figur 1B, C).
    1. For at lokalisere dette diskrete kryds gennem huden skal du bruge kraniets topografiske egenskaber og forsigtigt undersøge den generelle placering af krydset med infusionsenheden.
    2. Bekræft placeringen af krydset ved at ompositionere infusionsenheden langs kraniet og føle efter den nøjagtige placering.
  5. Når suturen er placeret, og infusionsenheden er på plads, skal du meget langsomt og forsigtigt vrikke infusionsenheden frem og tilbage, indtil den gennemborer huden og falder ned i krydset helt op til plastproppen.
    BEMÆRK: Sørg for at indsætte hele 0,6 mm spidsen af infusionsenheden i krydset.
  6. For at kontrollere nøjagtigheden skal du bruge blæk eller farvestof som injektionsopløsning og aflive og halshugge musen.
    1. Fjern kraniehætten for at visualisere farvestoffet i dura mater (figur 1C).
      BEMÆRK: Farvestof bør ikke observeres på hjernen eller ydersiden af kraniet. Ligeledes bør mus i ethvert forsøg kontrolleres post mortem for at verificere nøjagtigheden af injektionen samt for at sikre, at integriteten af dura mater var ubeskadiget.
  7. Efter injektionen skal du fjerne musen fra anæstesi, vente på, at den genvinder bevidstheden og derefter vende tilbage til sit bur eller placere den i et testkammer for at starte de ønskede assays.
    BEMÆRK: Lad musen komme sig efter anæstesi i mindst 30 minutter, før du udfører adfærdsmæssige eksperimenter.

3. Periorbital von Frey

  1. Begynd undersøgelsen med en kohorte på ca. 16-20 mus.
  2. En dag før tilvænning skal du håndtere hver mus i mindst 5 minutter.
  3. Ca. 24 timer efter håndtering skal musene vænnes til testrumsforholdene og von Frey-testapparatet (figur 2A).
    BEMÆRK: Akryltestapparatet består af individuelle rum med låg, der er ca. 3 i x 3,5 i x 5 tommer (B x H x D) og understøttes af aluminiumsstativer forbundet via 0,25 i 19 G firkantet galvaniseret stålnettråd.
    1. Placer musene inde i en vandret placeret 4 oz hvid papirkop, der er lugtfri og ikke indeholder polythen eller paraffinvoks.
      BEMÆRK: Disse typer kopper foretrækkes, fordi det reducerer gastrointestinal forstyrrelse hos musene, hvis de indtages (figur 2B).
  4. Mens dyrene er i deres respektive kamre, skal du placere en pellet af den normale chow-diæt i hver muses individuelle kammer for at berolige dyrene og undgå unødig stress for dyrene. Gør dette i 3 dage før enhver von Frey adfærdstest.
    1. Sørg for, at hver gang musene er i kammeret, at der er adgang til mad.
    2. Nummerer og tildel hvert dyr til det samme rum i teststativet. Musen anbringes i den samme kop hver dag i testperioden for at sikre, at hvert dyr vænner sig til sit testmiljø.
      BEMÆRK: Mus vil gnave på kopperne og efterfølgende ødelægge kopperne. Hvis dette skulle ske, skal du udskifte koppen og mærke den med det tilsvarende musenummer.
  5. Efter de første 3 dages tilvænning skal musene placeres i deres individuelle kamre.
    1. Lad dyrene akklimatisere sig til testrummet og kamrene i mindst 1 time før en von Frey-test, så musene kan falde til ro og efterfølgende er lettere at teste.
  6. Efter akklimatisering til rummet på testdagen skal du fjerne en mus, mens den stadig er i koppen fra sit respektive kammer.
    1. Hold koppen i vandret position, så musen er på både forpoter og bagpoter for at hjælpe med at holde deres vægt jævnt fordelt.
      BEMÆRK: Ulige vægtfordeling kan ændre dyrets reaktioner og endda forhindre dyr i at reagere.
  7. Placer koppen med musen indeni på bordet under teststativet på den absorberende pude.
  8. Til periorbital von Frey-test skal du placere 0,07 g von Frey-filamentet direkte i midten af ansigtet og mellem øjnene.
  9. Påfør tilstrækkeligt pres på glødetråden til at få von Frey-håret til at bøje sig i en "C" -formet formation.
    1. Oprethold kontakten med regionen mindst 3 s, men ikke mere end 5 s, eller indtil musen trækker hovedet tilbage og stryger mod glødetråden med sin pote.
      BEMÆRK: Hvis glødetråden glider eller mere end spidsen af glødetråden rører ved dyret under testen, bør eventuelle reaktioner ikke tælles med. Disse reaktioner kan være som reaktion på børsten, som aktiveres af forskellige mekanoreceptorer og derfor muligvis ikke afspejler nøjagtige resultater.
    2. Påfør von Frey filamenter i henhold til Dixon "op-ned" metoden22,23.
      1. Indledningsvis skal du anvende von Frey-filamentet, som har en vægt på 0,07 g. Den lavest mulige filament og den højest testede filament i denne undersøgelse er filamenter med vægte på henholdsvis 0,008 g og 0,6 g.
      2. Brug filamenter med vægt 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g og 0,6 g til at udføre dette assay.
      3. I denne metode, hvis et dyr ikke udviser et svar på glødetråden, skal du anvende glødetråden af den næste højere gramvægt.
      4. Hvis musen reagerer på en filament, skal du overveje, at musen reagerer på den filament. Hvis dette er tilfældet, skal du anvende glødetråden med den næste lavere gramvægt.
      5. Gentag dette mønster, indtil dyret er testet 4 gange efter den første respons, eller dyret er fastslået ikke at reagere på eventuelle filamenter, der er testet i analysen.
        BEMÆRK: Afstå fra at anvende yderligere tryk, der stammer fra armen eller håndleddet. En skala kan anvendes til at øve påføring af glødetråden.

4. Test af baseline-tilbagetrækningstærskler

  1. Før du inkluderer i et forsøg, skal du sikre dig, at musene når en baseline tilbagetrækningstærskel mellem 0,5-0,6 g.
    1. En mus når baseline, hvis den ikke reagerer på en filament, der er testet i den serie, der er nævnt i trin 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g og 0,6 g).
  2. Test mus dagligt, når der fastsættes baseline tilbagetrækningstærskler.
    1. Testning gør det muligt for dyr at vænne sig til testbetingelserne og trykket fra von Frey-filamenterne.
    2. Hvis musene stadig er ekstremt overfølsomme efter den tredje testdag, kan du prøve at vente 1 eller 2 dage, før de testes igen.
      BEMÆRK: For lang tid mellem testdagene kan resultere i, at dyret ikke tilpasser sig glødetrådens vægt i deres periorbitale region og dermed ikke når den målrettede tilbagetrækningstærskel.
  3. Forsøg mus i ca. 7 dage, før det bestemmes, hvilke dyr der ikke opfylder inklusionskriterierne for et forsøg.
    BEMÆRK: Ca. 70% af musene vil nå det målrettede baseline-niveau.
    1. Før dural stimulering skal du analysere basisdataene for at udelukke enhver mus, der ikke har nået en baseline-værdi på 0,5-0,6 gram eller højere.
    2. Efter udelukkelse skal du tilfældigt tildele hver resterende mus til en testgruppe. Opnå dette ved at tegne ud af en kop eller skrive et script på et regneark for at randomisere tal til en gruppe.

5. Analyse af von Frey resultater

  1. Når rækken af svar er opnået, bestemmes delta-, k-værdien, 50%-tærsklen og tilbagetrækningstærsklen i gram i henhold til tidligere offentliggjorte metoder24.
  2. Beregn tilbagetrækningstærsklen ved hjælp af denne formel WT = 10 (x * F + B) , hvor WT = tilbagetrækningstærskel, F = pote tilbagetrækningstærskel beregnet ved hjælp af Chaplan-metoden og B = lineær regression af log (bøjningskraft) = x * Filamenttal + B.
  3. Plot dataene som enten 50% tilbagetrækningstærskel eller gennemsnitlig tilbagetrækningstærskel i gram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne injektionsmetode bruges til at administrere stimuli på musens dura, så efterfølgende adfærdstest kan forekomme. Det mest almindelige adfærdsmæssige output målt med denne model er kutan ansigtsoverfølsomhed vurderet via von Frey 12,13,14. Her viser vi, hvordan denne model kan bruges til at vurdere potentielle kønsspecifikke bidrag til migrænepatologi (figur 3).

Denne procedure er blevet anvendt til at undersøge virkningerne af dural prolactin (PRL) på mekanisk fremkaldt ansigtsoverfølsomhed14 (figur 3). Resultaterne af denne undersøgelse viste, at kvindelige ICR-mus viser signifikant reducerede ansigtsabstinenstærskler som reaktion på 5 μg dural prolactin (figur 3A). En ti gange lavere dosis på 0,5 μg prolaktin (PRL) viste også responser svarende til høj dosis PRL (figur 3B).

Disse injektioner har også vist sig at producere spontan smerterelateret adfærd vurderet via grimasse. Dural 0,5 μg PRL forårsagede signifikant grimassering hos hunmus (figur 3C), hvilket yderligere demonstrerede en klar rolle for dural PRL i kvindelig migrænelignende adfærd. Vi udførte grimasseassays forud for alle test med von Frey-filamenter.

Figure 1
Figur 1: Dural-infusionsvæske og injektionsplacering. (A) Injektorerne/infusionsstofferne består af en modificeret kanyle justeret til en længde på ~0,5 mm-0,65 mm og fastgjort til en nål cementeret på en 10 μL gastæt sprøjte via tygonrør. B) Luftfoto af markeret injektionssteds placering på musens hoved. (C) (Venstre panel) Diagram over placeringen af duralinjektionen. Placeringen af injektionen er på krydset mellem lambdoid og sagittal suturer på ca. 4,8 mm bagud til bregma. (Midterste panel) Post mortem luftfoto af et musekranium efter dural injektion af 5 μL blåt injektionsfarvestof. (Højre panel) Adskillelse af musens kraniet fra hjernen. Der var ingen observerbar lækage af blåt injektionsfarvestof på hjernen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: von Frey Testkamre. (A) von Frey testkammer sammensat af 3,5 i x 3,5 i individuelle akrylkamre med låg anbragt på et trådnetstativ. Disse er forbundet via kolonner på 10 kamre organiseret i 2 rækker. (B) Eksempel på mus i deres individuelle kopper, der er anbragt inde i von Frey-testkamrene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Dural anvendelse af prolactin inducerer adfærdsmæssige reaktioner hos mus. Mekaniske abstinenstærskler blev vurderet efter dural anvendelse af PRL (5 μg eller 0,5 μg) hos hunmus. A) Anvendelse af 5 μg PRL (n = 7 PRL, n = 6 køretøj) induceret ansigtsoverfølsomhed sammenlignet med køretøjet. B) Anvendelse af 0,5 μg PRL (n = 5 PRL, n = 4 køretøj) induceret langvarig overfølsomhed i ansigtet. (C) Grimasse blev også vurderet hos de samme mus, der blev behandlet med 0,5 μg PRL på hvert tidspunkt. Disse mus udviste signifikant højere grimassescore sammenlignet med de mus, der blev behandlet med køretøj. Statistik: Tovejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni multiple sammenligning post-hoc analyse. Data er repræsenteret som midler ± SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Maladaptive ændringer i det lokale nociceptive system i dura betragtes som en vigtig bidragyder til hovedpinefasen af migræneanfald på trods af mangel på vævsskade25,26. Her præsenterer studiet en metode, hvor minimalt invasiv stimulering af dura kan fremkalde ansigt taktil overfølsomhed. Belysning af de mekanismer og hændelser, der er involveret i aktivering af dural nociceptor uden at forårsage skade på kraniet og vævene, kan mere præcist afspejle migrænemekanismer i en præklinisk model.

Craniotomi og kanyleimplantation har længe været brugt til at vurdere funktioner og mekanismer, der bidrager til migrænesmerter11,12. Det er imidlertid blevet rapporteret, at en kraniotomi kan fremkalde aktivering af dural mastceller og øge pial vaskulær permeabilitet hos gnavere27. I betragtning af at mastcelleaktivering i dura er stærkt impliceret i migræne 7,8,28,29, har denne teknik store forbehold, der kan skævvride fortolkningen. Administration af stoffer gennem krydset mellem sagittale og lambdoidale suturer mindsker effektivt aktiveringen af nociceptorer medieret af kraniotomi-induceret mastcelleaktivering. Desuden kræver ikke-invasiv dural stimulering ikke postkirurgisk genopretning og administration af analgetika, hvilket kan ændre fortolkningen af resultaterne. Lokal anvendelse af stoffer på dura giver forskere mulighed for at fokusere på dette specifikke målvæv i modsætning til systemisk administration af lægemidler, hvor virkningsstedet ikke let bestemmes 12,13,14. Mens systemisk administration af stoffer som nitroglycerin og calcitonin genrelateret peptid udløser eksperimentelle angreb hos mennesker, der ligner migræne, tillader de ikke vurdering af virkningsstedet i gnavermodeller; mere målrettede vævsspecifikke modeller tilbyder en alternativ tilgang.

Denne teknik, der er beskrevet her, involverer injektion af et lægemiddel eller en anden opløsning direkte på dura mater af meninges gennem krydset, hvor kraniets sagittale og lambdoidale suturer mødes. For at få de bedste resultater bør ICR(CD-1) eller C57/BL6-mus i alderen 6-8 uger anvendes til disse forsøg. Yngre mus kan anvendes; Brug af ICR (CD-1) mus, der er ældre end 8 uger, anbefales dog ikke, da deres kraniepladesuturer typisk er fuldstændigt smeltet sammen i denne alder, hvilket gør det umuligt at injicere uden at beskadige kraniet. Det er også vigtigt at overveje vægten / størrelsen af hver mus, der vil gennemgå denne procedure. Det anbefales, at disse injektioner udføres på dyr, der har en vægt større end 19 g, da kraniet typisk er meget tyndt ved lavere vægte og muligvis ikke tåler det tryk, der påføres under injektionen. Af betydning er der også sandsynlige faktorer, der bidrager til den alder / vægt, hvor kraniepladefusion forekommer (f.eks. Sammensætningen af lab chow, der anvendes i dyrefaciliteter). Derfor kan eksperimenter være nødt til at bestemme det alders- / vægtinterval, der er egnet under deres egne forhold. Der kan kræves forskellige aldersgrupper og dyrevægte for andre musestammer eller genotyper, afhængigt af hvornår kraniepladerne smelter sammen i disse dyr, og kan også kræve optimering af selve injektionen.

Når man lærer eller praktiserer denne teknik, anbefales det stærkt, at der opnås et niveau af komfort ved at lokalisere suturkrydset i aflivede mus. Det kan være bedst først at øve sig med hovedbunden udskåret eller skrællet tilbage i disse mus og langsomt gå videre til at lokalisere krydset gennem huden. Når den nøjagtige placering er fastslået, kan blæk og farvestoffer injiceres i dura for at verificere injektionens placeringsnøjagtighed og dybde. Denne teknik blev udviklet og optimeret ved hjælp af ICR (CD-1) mus (30-35 g) og C57/BL6 mus (25-30 g). En infusionslængde på 0,5-0,6 mm er tilstrækkelig til at injicere en mus, der vejer inden for området 25-35 g. Det kan dog være nødvendigt at kalibrere længden af infusionsenheden, hvis der injiceres mus, der adskiller sig væsentligt fra de mus, der bruges til at optimere denne teknik. For eksempel vil en mus, der er mindre end 25 g, sandsynligvis resultere i brugen af en infusionsstof, der har en længde mindre end 0,5 mm. Ved mastering af denne teknik, og når den udføres i alderssvarende mus, kan succesraten for denne injektion være tæt på 100%; Komplikationer med injektionen kan dog stamme fra problemer som at bryde kraniet på grund af at anvende for meget kraft til at indsætte infuseren samt unormal blødning forårsaget af beskadigelse af meningeal blodkar.

Ændringer i taktil følsomhed er en vigtig måling ved vurdering af smerteadfærd hos gnavere. Her demonstrerer vi brugen af periorbital von Frey-test til at vurdere denne adfærd i en præklinisk migrænemodel. En stor fordel ved at bruge denne teknik i migrænemodeller er, at vi kan vurdere hovedets overfølsomhed, som har større relevans end andre ikke-kraniale placeringer som poter. Det afgørende skridt for at sikre reproducerbare resultater er at sikre, at musene er fuldt baselined. Dette vil kræve en veluddannet eksperimentator, der kan anvende von Frey filamenter præcist. Det er sandsynligt, at det vil tage ca. 7 dage for et dyr at nå baseline. Det er dog muligt, at ikke alle dyr vil nå den målrettede baseline. Efter vores erfaring vil kun 60% -70% af dyrene efter ca. 7 dages arbejde med mus nå en baseline på 0,6 g i periorbitalområdet, men dette afhænger af kohorten af dyr. Denne tidsplan bør overvejes, inden et forsøg påbegyndes, for at sikre, at der anvendes et tilstrækkeligt antal til at tage højde for frafald, og at dyrene har den rette alder efter baseline for anvendelse af denne ikke-invasive metode til at stimulere duraen. Trinnene til bestemmelse af en basislinje er beskrevet i protokolafsnit 4.

En begrænsning for von Frey test er, at det kan være svært at skelne mellem smerteresponser og rutinemæssig pleje / kløe. For at hjælpe med at skelne smerte fra pleje er det vigtigt at bemærke, hvor lang tid denne adfærd opstår. Normalt er et smerterespons et stryg efter filamentapplikationen, mens plejeadfærd har tendens til at blive forlænget og kan vare i flere sekunder til minutter. Hvis pleje / kløe adfærd ikke kan skelnes fra en overfølsom respons, er det bedst ikke at registrere dette som et svar. Derudover kan forkert filamentplacering (f.eks. Glødetrådsglidning) resultere i langvarig pleje af dyret, hvilket gør det vanskeligt at teste korrekt. Hvis dette sker, skal eksperimentatoren vente, indtil plejen er stoppet, og musen er rolig nok til at teste. Fortsæt fra det samme filament, der blev brugt før begyndelsen af plejeadfærden. Hvis musen fortsætter i meget lange perioder, skal musen placeres tilbage i testkammeret i ca. 5 minutter. Når de 5 minutter er gået, kan du prøve at teste musen igen. Hvis denne adfærd fortsætter uden nogen beslutsomhed, skal musene fjernes fra undersøgelsen. Af betydning anbefales det ikke at barbere pelsen i ansigtet, da det er uklart, om musehuden bevarer den samme følsomhed, efter at håret er fjernet, og processen med hårfjerning (barbering, hårfjerningscremer) kan også påvirke hudfølsomheden.

I de fleste situationer er den ideel til administration af stoffer på dura højst 24 timer efter, at musen har nået baseline. Det anbefales, at mus udsættes for von Frey filament test en gang i timen. Hvis det er muligt, giver testning hver anden time tilstrækkelig tid til, at dyrene kan falde til ro efter testning. Derudover bør eksperimenter tidsinddeles for ikke at forstyrre deres cirkadiske mønstre. Ændringer i døgnrytmen hos mus kan ændre adfærdsmæssige fænotyper og i sidste ende resultere i irreproducerbare resultater.

Periorbital von Frey-test kan bruges i kombination med andre adfærdsmæssige assays for at styrke eksperimentelle konklusioner. Grimasseskalaen er afhængig af spontane ansigtsudtryk hos gnavere snarere end fremkaldte svar18,19. Denne metode har høj nøjagtighed og pålidelighed ved vurdering og kvantificering af akut smerteadfærd og er blevet brugt i mange prækliniske modeller af migræne 12,30. Ved brug af både grimasse og periorbitale von Frey-assays bør eksperimentatoren overveje at score for grimasse inden påføring af von Frey-filamenter på musens periorbitale region. Dette sikrer, at grimasseringsadfærden er spontan og ikke fremkaldes af filamentpåføring. Hindpaw mekanisk overfølsomhed kan også bruges i forbindelse med periorbital von Frey test. I modsætning til grimasse scoring er det bedst at teste ansigtsoverfølsomhed, inden man vurderer overfølsomhed over for bagpoten. Hindpaw test kræver, at musen placeres tilbage i kammeret uden koppen, efter at periorbital von Frey test er afsluttet.

Afslutningsvis tilføjer periorbital von Frey-test og ikke-invasiv dural stimulering hos mus værdifulde muligheder for det nuværende udvalg af prækliniske modeller af migræne. Når den udføres korrekt, præsenterer denne teknik en raffineret tilgang til at generere en hovedpinelignende fænotype hos gnavere, da den ikke kræver kirurgisk implantation af en kanyle. Hos rotter er kanyler tilbøjelige til bakteriel infektion, kan blive tilstoppet, kan falde af og kræve, at hvert dyr er enkelthuset, hvilket skaber unødvendig stress på dyret. Desuden kan duralstimuleringsprotokollen let ændres til brug med flere lægemiddelapplikationer. Periorbital von Frey testparadigmer kan også ændres, så de passer bedst til de eksperimentelle specifikationer. Derudover kan periorbital von Frey-test anvendes i andre orofaciale smertelidelser. Disse teknikker er et vigtigt redskab til yderligere at forstå de komplekse underliggende mekanismer for migrænesmerter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (NS104200 og NS072204 til GD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 oz Hot Paper Cups Choice Paper Company 5004W https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads Fisherbrand 14-206-65 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula P1 Technologies (formerly Plastics One) 8IC313ISPCXC I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes Hamilton 80008 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm Cole-Palmer EW-96460-10 https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire Custom The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers Custom Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments Touch test/Stoelting 58011 https://www.stoeltingco.com/touch-test.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Woldeamanuel, Y. W., Cowan, R. P. Migraine affects 1 in 10 people worldwide featuring recent rise: A systematic review and meta-analysis of community-based studies involving 6 million participants. Journal of the Neurological Sciences. 372, 307-315 (2017).
  3. Burch, R. C., Loder, S., Loder, E., Smitherman, T. A. The prevalence and burden of migraine and severe headache in the United States: updated statistics from government health surveillance studies. Headache. 55 (1), 21-34 (2015).
  4. Ashina, M. Migraine. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1866-1876 (2020).
  5. Ashina, M., et al. Migraine: integrated approaches to clinical management and emerging treatments. Lancet. 397 (10283), 1505-1518 (2021).
  6. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: Moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  7. Koyuncu Irmak, D., Kilinc, E., Tore, F. Shared Fate of Meningeal Mast Cells and Sensory Neurons in Migraine. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 136 (2019).
  8. Levy, D. Migraine pain, meningeal inflammation, and mast cells. Current Pain and Headache Reports. 13 (3), 237-240 (2009).
  9. Levy, D., Labastida-Ramirez, A., MaassenVanDenBrink, A. Current understanding of meningeal and cerebral vascular function underlying migraine headache. Cephalalgia. 39 (13), 1606-1622 (2019).
  10. Phebus, L. A., Johnson, K. W. Dural inflammation model of migraine pain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  11. Fried, N. T., Maxwell, C. R., Elliott, M. B., Oshinsky, M. L. Region-specific disruption of the blood-brain barrier following repeated inflammatory dural stimulation in a rat model of chronic trigeminal allodynia. Cephalalgia. 38 (4), 674-689 (2018).
  12. Avona, A., et al. Dural calcitonin gene-related peptide produces female-specific responses in rodent migraine models. The Journal of Neuroscience. 39 (22), 4323-4331 (2019).
  13. Burgos-Vega, C. C., et al. Non-invasive dural stimulation in mice: A novel preclinical model of migraine. Cephalalgia. 39 (1), 123-134 (2019).
  14. Avona, A., et al. Meningeal CGRP-Prolactin interaction evokes female-specific migraine behavior. Annals of Neurology. 89 (6), 1129-1144 (2021).
  15. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  16. Lipton, R. B., et al. Cutaneous allodynia in the migraine population. Annals of Neurology. 63 (2), 148-158 (2008).
  17. Goadsby, P. J. Migraine, allodynia, sensitisation and all of that. European Neurology. 53, Suppl 1 10-16 (2005).
  18. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  19. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  20. Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 11 (2019).
  21. Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central CGRP mechanisms. The journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
  22. Dixon, W. J., Mood, A. M. A method for obtaining and analyzing sensitivity data. The Journal of the American Statistical Association. 43 (241), 109-126 (1948).
  23. Dixon, W. The up-and-down method for small samples. The Journal of the American Statistical Association. 60, (1965).
  24. Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Molecular Pain. 10, 26 (2014).
  25. Ramachandran, R. Neurogenic inflammation and its role in migraine. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 301-314 (2018).
  26. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K. Does inflammation have a role in migraine. Nature Reviews Neurology. 15 (8), 483-490 (2019).
  27. Stokely, M. E., Orr, E. L. Acute effects of calvarial damage on dural mast cells, pial vascular permeability, and cerebral cortical histamine levels in rats and mice. Journal of Neurotrauma. 25 (1), 52-61 (2008).
  28. Theoharides, T. C., Donelan, J., Kandere-Grzybowska, K., Konstantinidou, A. The role of mast cells in migraine pathophysiology. Brain Research Reviews. 49 (1), 65-76 (2005).
  29. Conti, P., et al. Progression in migraine: Role of mast cells and pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. European Journal of Pharmacology. 844, 87-94 (2019).
  30. Rea, B. J., et al. Peripherally administered calcitonin gene-related peptide induces spontaneous pain in mice: implications for migraine. Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).

Tags

Neurovidenskab udgave 173 migræne dura mater ansigtsoverfølsomhed ikke-invasiv stimulering adfærd
Dural stimulering og periorbital von Frey test hos mus som en præklinisk model af hovedpine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mason, B. N., Avona, A., Lackovic,… More

Mason, B. N., Avona, A., Lackovic, J., Dussor, G. Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache. J. Vis. Exp. (173), e62867, doi:10.3791/62867 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter