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Neuroscience

Stimolazione durale e test di von Frey periorbitale nei topi come modello preclinico di cefalea

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

Il sintomo più notevole dell'emicrania è il forte dolore alla testa, e si ipotizza che questo sia mediato dai neuroni sensoriali che innervano le meningi. Qui, presentiamo un metodo per applicare localmente sostanze alla dura in modo minimamente invasivo mentre si utilizza l'ipersensibilità facciale come output.

Abstract

Si ritiene che le meningi craniche, composte da dura madre, aracnoide e pia madre, servano principalmente funzioni strutturali per il sistema nervoso. Ad esempio, proteggono il cervello dal cranio e ancorano / organizzano l'apporto vascolare e neuronale della corteccia. Tuttavia, le meningi sono anche implicate in disturbi del sistema nervoso come l'emicrania, dove il dolore sperimentato durante un'emicrania è attribuito all'infiammazione sterile locale e alla successiva attivazione di afferenze nocicettive locali. Tra gli strati nelle meningi, la dura madre è di particolare interesse nella fisiopatologia dell'emicrania. È altamente vascolarizzato, ospita neuroni nocicettivi locali ed è sede di una vasta gamma di cellule residenti come le cellule immunitarie. Sottili cambiamenti nel microambiente meningeo locale possono portare all'attivazione e alla sensibilizzazione dei nocicettori perivascolari durali, portando così al dolore emicranico. Gli studi hanno cercato di affrontare il modo in cui le afferenze durali vengono attivate / sensibilizzate utilizzando elettrofisiologia in vivo, tecniche di imaging o modelli comportamentali, ma questi comunemente richiedono interventi chirurgici molto invasivi. Questo protocollo presenta un metodo per l'applicazione relativamente non invasiva di composti sulla dura madre nei topi e un metodo adatto per misurare la sensibilità tattile simile alla cefalea utilizzando il test periorbitale di von Frey dopo stimolazione durale. Questo metodo mantiene l'integrità della dura e del cranio e riduce gli effetti confondenti delle tecniche invasive iniettando sostanze attraverso una cannula modificata di 0,65 mm alla giunzione di suture sagittali e lambdoidi non fuse. Questo modello preclinico consentirà ai ricercatori di studiare una vasta gamma di stimoli durali e il loro ruolo nella progressione patologica dell'emicrania, come l'attivazione dei nocicettori, l'attivazione delle cellule immunitarie, i cambiamenti vascolari e i comportamenti del dolore, il tutto mantenendo condizioni prive di lesioni al cranio e alle meningi.

Introduction

Il dolore emicranico rimane un importante problema di salute pubblica in tutto il mondo. L'Organizzazione Mondiale della Sanità la classifica come la sesta malattia più diffusa al mondo, che affligge poco meno del 15% della popolazione della Terra1 e causa un notevole onere socioeconomico sulla società 2,3. Le opzioni di trattamento e la loro efficacia sono state non ottimali e forniscono solo sollievo sintomatico e non modificano significativamente gli eventi fisiopatologici che sono alla base dell'insorgenza di emicrania 4,5. La mancanza di successo del trattamento è probabilmente dovuta al fatto che l'emicrania è un disturbo multifattoriale la cui patologia è poco conosciuta, portando a un numero limitato di bersagli terapeutici. L'emicrania è anche difficile da catturare completamente nei modelli animali, soprattutto dato che la diagnosi di emicrania è fatta sulla base della comunicazione verbale con i pazienti che descrivono la loro esperienza con segni distintivi di emicrania come aura, mal di testa, fotofobia e allodinia. Ciononostante, è importante notare che i recenti progressi nei trattamenti per l'emicrania stanno attualmente superando i trattamenti per molte condizioni neurologiche che sono state ben convalidate dai modelli preclinici. Ad esempio, gli anticorpi monoclonali e le piccole molecole che colpiscono il peptide correlato al gene della calcitonina o il suo recettore hanno avuto molto successo nel migliorare la qualità della vita di chi soffre di emicrania e possono potenzialmente trasformare la gestione clinica dell'emicrania. Mentre c'è stato un progresso nella comprensione di questo disturbo, continua ad esserci molto ancora da chiarire.

Sulla base di modelli animali preclinici e studi sull'uomo, è ampiamente accettato che l'emicrania è iniziata dall'attivazione aberrante delle fibre nocicettive all'interno delle meningi che segnalano attraverso i gangli della radice dorsale del trigemino e della cervicale superiore 6,7,8,9,10. Nonostante questa teoria, molti studi usano ancora la somministrazione sistemica di farmaci per comprendere i meccanismi sottostanti che contribuiscono all'emicrania. Mentre il dosaggio sistemico dei farmaci ha sostanzialmente rafforzato la nostra comprensione, questi risultati non valutano direttamente se le azioni locali all'interno del tessuto bersaglio di interesse svolgono un ruolo nell'emicrania. Al contrario, diversi studi hanno adottato un approccio per stimolare la dura; tuttavia, questi esperimenti richiedono l'impianto di cannula tramite una craniotomia invasiva e tempi di recupero prolungati11,12. A causa di queste limitazioni, abbiamo sviluppato un approccio minimamente invasivo per stimolare localmente la dura in cui la mancanza di una craniotomia elimina il recupero post-chirurgico e consente test immediati in animali svegli 12,13,14. Queste iniezioni vengono eseguite in anestesia con isoflurano leggero e somministrate alla giunzione delle suture sagittale e lambdoide nei topi.

Sono stati sviluppati diversi approcci per valutare le risposte comportamentali nocicettive nei roditori15. L'allodinia cutanea è stata riportata in circa l'80% dei malati di emicrania16,17 e rappresenta un potenziale endpoint traslazionale per l'uso nei roditori. Nei modelli preclinici, l'applicazione di filamenti di von Frey alla regione plantare della zampa del roditore è stata utilizzata per valutare i comportamenti del dolore nei modelli preclinici di emicrania. Il limite principale di questo approccio è che non testa la regione cefalica. Il punteggio della smorfia facciale è stato utilizzato per catturare i comportamenti del dolore nei roditori analizzando le espressioni facciali dopo l'induzione di stimoli dolorosi18,19. Tuttavia, i suoi limiti includono solo la cattura di risposte a stimoli acuti e non condizioni di dolore orofacciale cronico. La toelettatura facciale e la diminuzione dell'allevamento sono anche considerate output di risposte comportamentali in modelli preclinici di emicrania20,21. I limiti del primo includono difficoltà nel differenziare le risposte al dolore dalla normale toelettatura di routine e altre sensazioni come il prurito. Nel caso di quest'ultimo, i comportamenti di allevamento in genere diminuiscono rapidamente dopo l'introduzione dei roditori in nuovi ambienti. Sebbene ciascuno di questi endpoint comportamentali sia prezioso nella comprensione di vari meccanismi che contribuiscono alle condizioni del dolore, vi è un bisogno critico di modelli preclinici di disturbi del dolore come l'emicrania per includere endpoint che catturano specificamente le risposte di ipersensibilità cefalica. Valutare l'ipersensibilità tattile della pelle periorbitale dopo stimolazione durale è un metodo che può fornire una migliore comprensione dei meccanismi che contribuiscono all'emicrania in cui i sintomi sensoriali sono prevalentemente di natura cefalica. Qui, descriviamo un metodo per somministrare sostanze sulla dura del topo come modello preclinico di emicrania. Dopo l'applicazione durale, presentiamo anche un metodo dettagliato per testare l'ipersensibilità tattile periorbitale utilizzando filamenti di von Frey calibrati applicati nel metodo Up-down di Dixon.

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Protocol

Tutte le procedure sono state condotte previa approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Texas a Dallas. In questo studio sono stati utilizzati topi ICR (CD-1) (30-35 g) e C57/BL6 (25-30 g) di età compresa tra 6-8 settimane.

1. Infusore durale

  1. Creare gli infusori/iniettori del mouse modificando una cannula interna e un infusore disponibili in commercio per iniezioni unilaterali con un cappuccio in plastica silice fusa non metallica regolabile e che si inserisce/si estende al di sotto di una cannula guida da 28 G con diametro interno (I.D.) di 0,18 mm e diametro esterno (O.D.) di 0,35 mm (Figura 1A).
  2. Utilizzare una pinza o un altro dispositivo di misurazione per regolare il cappuccio in plastica silicea fusa sull'infusore a una lunghezza di 0,6 mm; misurato dalla punta dell'infusore al bordo del cappuccio di plastica di silice.
    1. Prestare attenzione a non piegare o opacizzare l'infusore quando si regola il tappo di plastica.
    2. Per altri ceppi di topo che non sono stati precedentemente utilizzati per iniezioni durali, determinare la lunghezza ottimale dell'infusore impostando la lunghezza a 0,6 mm e conducendo iniezioni pilota con inchiostro o colorante, regolando la lunghezza dell'infusore fino a quando non si osserva che il colorante è solo nella dura madre e non sul cervello o sul cranio.
  3. Fissare l'estremità lunga (o l'estremità che non è stata misurata come 0,6 mm) dell'infusore regolato al tubo di plastica (tubo della pompa, 2 stop, ID 0,19 mm, lunghezza 406 mm).
    1. Tagliare il tubo a una lunghezza minima di 8 pollici per garantire che vi sia una linea sufficiente per contenere un volume di 5 μL.
    2. Assicurarsi che il tubo copra la parte metallica e la parte superiore del tappo di plastica situato sull'infusore. Ciò contribuirà a prevenire l'accumulo di bolle d'aria nella linea.
  4. Attaccare l'altra estremità del tubo a una microsiringa di vetro da 10 μL (a tenuta di gas; ago cementato; 21 G con una proiezione di 10 mm), assicurandosi di avere una tenuta ermetica sulla parte metallica della siringa (Figura 1A).
  5. Una volta collegata la linea, riempire la siringa con 5 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), liquido interstiziale sintetico (SIF) o altri veicoli di scelta per evitare la formazione di bolle d'aria.
    1. Se si osservano bolle d'aria nella linea, inondare la linea con il veicolo fino a quando le bolle non si sono dissipate.
      NOTA: può essere utile riempire la siringa con il veicolo prima di collegarla alla linea e quindi spingere il fluido attraverso la linea una volta collegato.
  6. Dopo che la linea è stata riempita con 5 μL del veicolo e sta funzionando in modo efficiente, caricare 5 μL del farmaco / soluzione nella siringa Hamilton (inchiostro o colorante possono essere utilizzati come alternativa al farmaco / soluzione se si impara o si pratica questa tecnica).
    1. Assicurarsi che tutte le soluzioni per veicoli somministrate sulla dura siano mantenute a pH 7,4 e misurate ad un'osmolalità di 310. Ciò riduce la potenziale attivazione dei canali ionici sensibili all'acido e di altri canali osmosensibili all'interno della dura.
  7. Il volume massimo testato nei topi che non hanno causato perdite nel cervello è di circa 10 μL. Gli effetti comportamentali dopo iniezioni con questo volume non sono stati testati. Per questo motivo, somministrare solo 5 μL della soluzione sulla dura.
    NOTA: Queste osservazioni si basano sui ceppi di topo/ età / peso di topi CD1 / ICR di 6-8 settimane.

2. Iniezioni di durale

  1. Una volta preparata la siringa e caricato il farmaco, posizionare un topo piatto sull'addome e anestetizzarlo sotto un breve isoflurano al 3% con una portata di ossigeno di 0,5-1 L / min tramite naso.
    1. Dopo che il mouse non mostra più un riflesso di pizzico, regolare l'anestesia e sostenerla a un isoflurano dell'1,5%.
  2. Una volta anestetizzato, applicare un unguento oftalmico sterile sugli occhi e radersi la testa dell'animale, quindi disinfettare la pelle con povidone-iodio ed etanolo. Successivamente, mettiti in una posizione favorevole a un'iniezione di successo.
  3. Usa una mano per fissare la testa dell'animale e tieni l'infusore con l'altra mano.
  4. Sondare attentamente e localizzare la giunzione delle suture sagittale e lambdoidale sul cranio del topo (Figura 1B, C).
    1. Per individuare questa giunzione discreta attraverso la pelle, utilizzare le caratteristiche topografiche del cranio e sondare delicatamente la posizione generale della giunzione con l'infusore.
    2. Verificare la posizione della giunzione riposizionando l'infusore lungo il cranio e sentendo la posizione esatta.
  5. Una volta che la sutura è posizionata e l'infusore è in posizione, molto lentamente e delicatamente muovere l'infusore avanti e indietro fino a quando non perfora la pelle e scende nella giunzione fino al tappo di plastica.
    NOTA: assicurarsi di inserire l'intera punta da 0,6 mm dell'infusore nella giunzione.
  6. Per verificare l'accuratezza, utilizzare inchiostro o colorante come soluzione per iniezione ed eutanasizzare e decapitare il mouse.
    1. Rimuovere la calotta cranica per visualizzare il colorante all'interno della dura madre (Figura 1C).
      NOTA: La tintura non deve essere osservata sul cervello o all'esterno del cranio. Allo stesso modo, i topi in qualsiasi esperimento dovrebbero essere controllati post-mortem per verificare l'accuratezza dell'iniezione e per garantire che l'integrità della dura madre non sia stata danneggiata.
  7. Dopo l'iniezione, rimuovere il topo dall'anestesia, attendere che riprenda conoscenza e quindi tornare alla sua gabbia o metterlo in una camera di prova per iniziare i test desiderati.
    NOTA: consentire al mouse di recuperare dall'anestesia per un minimo di 30 minuti prima di eseguire qualsiasi esperimento comportamentale.

3. Periorbitale von Frey

  1. Inizia lo studio con una coorte di circa 16-20 topi.
  2. Uno il giorno prima dell'assuefazione, maneggia ogni mouse per almeno 5 minuti.
  3. Circa 24 ore dopo la manipolazione, abituare i topi alle condizioni della sala prove e all'apparato di prova di von Frey (Figura 2A).
    NOTA: L'apparecchio di prova acrilico è costituito da singoli scomparti con coperchi che sono circa 3 in x 3,5 in x 5 in (L x A x P) e sono supportati da supporti in alluminio collegati tramite filo di rete in acciaio zincato quadrato 0,25 in 19 G.
    1. Posiziona i topi all'interno di un bicchiere di carta bianca da 4 once posizionato orizzontalmente che è inodore e non contiene polietilene o cera di paraffina.
      NOTA: Questi tipi di tazze sono preferiti perché riducono i disturbi gastrointestinali nei topi se ingeriti (Figura 2B).
  4. Mentre gli animali sono nelle rispettive camere, posizionare un pellet della normale dieta chow nella camera individuale di ciascun topo per calmare gli animali ed evitare qualsiasi stress inutile per gli animali. Fallo per 3 giorni prima di qualsiasi test comportamentale di von Frey.
    1. Assicurarsi che ogni volta che i topi sono nella camera che ci sia accesso al cibo.
    2. Numerare e assegnare ogni animale allo stesso spazio nel rack di prova. Metti il mouse nella stessa tazza ogni giorno del periodo di prova per assicurarti che ogni animale si acclimati al suo ambiente di test.
      NOTA: i topi rosicchieranno le tazze e successivamente distruggeranno le tazze. Se ciò dovesse accadere, sostituisci la tazza ed etichettala con il numero del mouse corrispondente.
  5. Dopo i primi 3 giorni di assuefazione, posizionare i topi nelle loro camere individuali.
    1. Lasciare che gli animali si acclimatino alla sala di prova e alle camere per almeno 1 ora prima di qualsiasi test di von Frey per consentire ai topi di calmarsi e successivamente sono più facili da testare.
  6. Dopo l'acclimatazione alla stanza il giorno del test, rimuovere un mouse mentre è ancora nella sua tazza dalla rispettiva camera.
    1. Mantenere la tazza in posizione orizzontale in modo che il mouse sia su entrambe le zampe anteriori e posteriori per aiutare a mantenere il loro peso uniformemente distribuito.
      NOTA: la distribuzione ineguale del peso può alterare le risposte degli animali e persino impedire agli animali di rispondere.
  7. Posizionare la tazza con il mouse all'interno sul tavolo sotto il rack di prova sul pad assorbente.
  8. Per il test di von Frey periorbitale, posizionare il filamento di von Frey da 0,07 g direttamente al centro del viso e tra gli occhi.
  9. Applicare una pressione sufficiente sul filamento per far piegare i capelli di von Frey in una formazione a forma di "C".
    1. Mantenere il contatto con la regione almeno 3 s ma non più di 5 s o fino a quando il mouse ritira la testa e striscia sul filamento con la zampa.
      NOTA: se il filamento scivola o più della punta del filamento tocca l'animale durante il test, le eventuali risposte non devono essere conteggiate. Queste risposte possono essere in risposta al pennello che sono attivate da diversi meccanorecettori e quindi potrebbero non riflettere risultati accurati.
    2. Applicare i filamenti di von Frey secondo il metodo "up-down" di Dixon22,23.
      1. Inizialmente, applicare il filamento di von Frey che ha un peso di 0,07 g. Il filamento più basso possibile e il filamento più testato in questo studio sono filamenti con pesi di 0,008 g e 0,6 g, rispettivamente.
      2. Utilizzare i filamenti di peso 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g e 0,6 g per eseguire questo test.
      3. In questo metodo, se un animale non mostra una risposta al filamento, applicare il filamento del prossimo peso in grammi più alto.
      4. Se il mouse risponde a un filamento, considera che il mouse risponde a quel filamento. In tal caso, applicare il filamento del prossimo peso in grammi inferiore.
      5. Ripetere questo schema fino a quando l'animale non viene testato 4 volte dopo la risposta iniziale o si determina che l'animale non risponde a qualsiasi filamento testato nel test.
        NOTA: Astenersi dall'applicare qualsiasi pressione aggiuntiva derivante dal braccio o dal polso. Una scala può essere utilizzata per praticare l'applicazione del filamento.

4. Test per le soglie di prelievo di base

  1. Prima di essere inclusi in un esperimento, assicurarsi che i topi raggiungano una soglia di astinenza al basale compresa tra 0,5-0,6 g.
    1. Un topo raggiunge la linea di base se non risponde a qualsiasi filamento testato nella serie menzionata al punto 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g e 0,6 g).
  2. Testare i topi ogni giorno quando si stabiliscono le soglie di astinenza al basale.
    1. I test consentono agli animali di acclimatarsi alle condizioni di prova e alla pressione dei filamenti di von Frey.
    2. Se i topi sono ancora estremamente ipersensibili dopo il terzo giorno di test, provare ad aspettare 1 o 2 giorni prima di testare di nuovo.
      NOTA: troppo tempo tra i giorni di prova può comportare che l'animale non riesca ad adattarsi al peso del filamento sulla regione periorbitale, non raggiungendo così la soglia di sospensione mirata.
  3. Testare i topi per circa 7 giorni prima di determinare quali animali non soddisfano i criteri di inclusione per un esperimento.
    NOTA: Circa il 70% dei topi raggiungerà il livello basale target.
    1. Prima della stimolazione durale, analizzare i dati basali per escludere qualsiasi topo che non abbia raggiunto un valore basale di 0,5-0,6 grammi o superiore.
    2. Dopo l'esclusione, allocare in modo casuale ogni mouse rimanente a un gruppo di test. Raggiungi questo obiettivo disegnando da una tazza o scrivendo uno script su un foglio di calcolo per randomizzare i numeri in un gruppo.

5. Analisi dei risultati di von Frey

  1. Una volta ottenuta la serie di risposte, determinare il delta, il valore k, la soglia del 50% e la soglia di prelievo in grammi secondo i metodi precedentemente pubblicati24.
  2. Calcola la soglia di prelievo usando questa formula WT = 10 (x * F + B), dove WT = soglia di prelievo, F = soglia di prelievo della zampa calcolata tramite il metodo Chaplan e B = regressione lineare del log (forza di flessione) = x * Numero di filamento + B.
  3. Traccia i dati come soglia di prelievo del 50% o soglia media di prelievo in grammi.

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Representative Results

Questo metodo di iniezione viene utilizzato per somministrare stimoli sulla dura dei topi in modo che possano verificarsi successivi test comportamentali. L'output comportamentale più comune misurato con questo modello è l'ipersensibilità facciale cutanea valutata tramite von Frey 12,13,14. Qui mostriamo come questo modello può essere utilizzato per valutare i potenziali contributi specifici del sesso alla patologia dell'emicrania (Figura 3).

Questa procedura è stata utilizzata per esaminare gli effetti della prolattina durale (PRL) sull'ipersensibilità facciale evocata meccanicamente14 (Figura 3). I risultati di questo studio hanno dimostrato che i topi ICR femmina mostrano soglie di astinenza facciale significativamente ridotte in risposta a 5 μg di prolattina durale (Figura 3A). Una dose dieci volte inferiore di 0,5 μg di prolattina (PRL) ha anche mostrato risposte simili ad alte dosi di PRL (Figura 3B).

Queste iniezioni hanno anche dimostrato di produrre comportamenti spontanei legati al dolore valutati tramite smorfia. Dural 0,5 μg di PRL ha causato una smorfia significativa nei topi femmina (Figura 3C), dimostrando ulteriormente un chiaro ruolo per la PRL durale nei comportamenti femminili simili all'emicrania. Abbiamo eseguito saggi di smorfia prima di tutti i test con filamenti di von Frey.

Figure 1
Figura 1: Infusore durale e posizionamento per iniezione. (A) Gli iniettori/infusori sono costituiti da una cannula modificata regolata alla lunghezza di ~0,5 mm- 0,65 mm e fissata ad un ago cementato su una siringa a tenuta di gas da 10 μL tramite tubo tintgonale. (B) Vista aerea della posizione marcata del sito di iniezione sulla testa del mouse. (C) (Pannello di sinistra) Schema della posizione dell'iniezione di durale. Il posizionamento dell'iniezione è sulla giunzione delle suture lambdoide e sagittale a circa 4,8 mm posteriori al bregma. (Pannello centrale) Vista aerea post-mortem di un cranio di topo dopo iniezione durale di 5 μL di colorante per iniezione blu. (Pannello di destra) Separazione della calotta cranica del topo dal cervello. Non c'era alcuna perdita osservabile di colorante per iniezione blu sul cervello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Camere di prova di von Frey. (A) Camera di prova di von Frey composta da 3,5 pollici x 3,5 in singole camere acriliche con coperchi posti su una griglia di rete metallica. Questi sono collegati tramite colonne di 10 camere organizzate in 2 righe. (B) Esempio di topi nelle loro singole tazze alloggiate all'interno delle camere di prova di von Frey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: L'applicazione durale di prolattina induce risposte comportamentali nei topi. Le soglie di prelievo meccanico sono state valutate in seguito all'applicazione durale di PRL (5 μg o 0,5 μg) in topi femmina. (A) Applicazione di 5 μg di PRL (n = 7 PRL, n = 6 veicolo) ipersensibilità facciale indotta rispetto al veicolo. (B) L'applicazione di 0,5 μg di PRL (n = 5 PRL, n = 4 veicoli) ha indotto un'ipersensibilità facciale di lunga durata. (C) La smorfia è stata valutata anche negli stessi topi trattati con 0,5 μg di PRL in ogni punto temporale. Questi topi hanno mostrato punteggi di smorfia significativamente più alti rispetto ai topi trattati con il veicolo. Statistiche: ANOVA bidirezionale seguita da Bonferroni a confronto multiplo analisi post-hoc. I dati sono rappresentati come mezzi ± SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I cambiamenti disadattivi nel sistema nocicettivo locale nella dura sono considerati un contributo chiave alla fase di mal di testa degli attacchi di emicrania nonostante la mancanza di lesioni tissutali25,26. Qui lo studio presenta un metodo in base al quale la stimolazione minimamente invasiva della dura può indurre ipersensibilità tattile facciale. Chiarire i meccanismi e gli eventi coinvolti nell'attivazione del nocicettore durale senza causare danni al cranio e ai tessuti può riflettere più accuratamente i meccanismi dell'emicrania in un modello preclinico.

La craniotomia e l'impianto di cannule sono stati a lungo utilizzati per valutare funzioni e meccanismi che contribuiscono al dolore emicranico11,12. Tuttavia, è stato riportato che una craniotomia può indurre l'attivazione dei mastociti durali e aumentare la permeabilità vascolare piale nei roditori27. Dato che l'attivazione dei mastociti nella dura è altamente implicata nell'emicrania 7,8,28,29, questa tecnica ha importanti avvertimenti che possono distorcere l'interpretazione. La somministrazione di sostanze attraverso la giunzione delle suture sagittale e lambdoidale diminuisce efficacemente l'attivazione dei nocicettori mediata dall'attivazione dei mastociti indotta dalla craniotomia. Inoltre, la stimolazione durale non invasiva non richiede il recupero post-chirurgico e la somministrazione di analgesici che possono alterare l'interpretazione dei risultati. L'applicazione locale di sostanze sulla dura consente ai ricercatori di concentrarsi su questo specifico tessuto bersaglio, al contrario della somministrazione sistemica di farmaci in cui il sito di azione non è facilmentedeterminabile 12,13,14. Mentre la somministrazione sistemica di sostanze come la nitroglicerina e il peptide correlato al gene della calcitonina innescano attacchi sperimentali nell'uomo simili all'emicrania, non consentono la valutazione della posizione dell'azione nei modelli di roditori; modelli più mirati specifici per i tessuti offrono un approccio alternativo.

Questa tecnica qui descritta prevede l'iniezione di un farmaco o di un'altra soluzione direttamente sulla dura madre delle meningi attraverso la giunzione in cui si incontrano le suture sagittale e lambdoidale del cranio. Per ottenere i migliori risultati, per questi esperimenti devono essere utilizzati topi ICR (CD-1) o C57/BL6 di età compresa tra 6 e 8 settimane. Possono essere usati topi più giovani; tuttavia, l'uso di topi ICR (CD-1) di età superiore a 8 settimane non è raccomandato in quanto le loro suture di piastre craniche sono in genere completamente fuse da questa età, rendendo impossibile l'iniezione senza danneggiare il cranio. È anche fondamentale considerare il peso / dimensione di ciascun mouse che subirà questa procedura. Si raccomanda che queste iniezioni vengano eseguite su animali che hanno un peso superiore a 19 g poiché il cranio è in genere molto sottile a pesi inferiori e potrebbe non sopportare la pressione applicata durante l'iniezione. Di importanza, ci sono anche probabili fattori che contribuiscono all'età / peso a cui si verifica la fusione della piastra cranica (ad esempio, la composizione del chow di laboratorio utilizzato nelle strutture per animali). Pertanto, gli sperimentatori potrebbero aver bisogno di determinare l'intervallo di età / peso adatto alle proprie condizioni. Diverse fasce di età e pesi degli animali possono essere richieste per altri ceppi di topi o genotipi, a seconda di quando le placche craniche si fondono in quegli animali, e possono anche richiedere l'ottimizzazione dell'iniezione stessa.

Quando si impara o si pratica questa tecnica, si raccomanda vivamente di ottenere un livello di comfort con la localizzazione della giunzione di sutura nei topi eutanasizzati. Potrebbe essere meglio esercitarsi prima con il cuoio capelluto asportato o sbucciato in questi topi e avanzare lentamente per localizzare la giunzione attraverso la pelle. Una volta stabilita la posizione precisa, inchiostri e coloranti possono essere iniettati nella dura per verificare l'accuratezza della posizione e la profondità dell'iniezione. Questa tecnica è stata sviluppata e ottimizzata utilizzando topi ICR (CD-1) (30-35 g) e topi C57/BL6 (25-30 g). Una lunghezza dell'infusore di 0,5-0,6 mm è sufficiente per iniettare un mouse di peso compreso tra 25-35 g. Tuttavia, potrebbe essere necessario calibrare la lunghezza dell'infusore se si iniettano topi che differiscono significativamente dai topi utilizzati per ottimizzare questa tecnica. Ad esempio, un mouse più piccolo di 25 g comporterebbe probabilmente l'uso di un infusore con una lunghezza inferiore a 0,5 mm. Dopo aver padroneggiato questa tecnica e se eseguita in topi adatti all'età, il tasso di successo di questa iniezione può essere vicino al 100%; tuttavia, le complicazioni con l'iniezione possono derivare da problemi come la rottura del cranio a causa dell'applicazione di troppa forza per inserire l'infusore e sanguinamento anormale causato da danni ai vasi sanguigni meningei.

Le alterazioni della sensibilità tattile sono una misura importante quando si valutano i comportamenti del dolore nei roditori. Qui dimostriamo l'uso del test di von Frey periorbitale per valutare questi comportamenti in un modello di emicrania preclinica. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di questa tecnica nei modelli di emicrania è che possiamo valutare l'ipersensibilità della testa, che ha più rilevanza rispetto ad altre posizioni non craniche come le zampe. Il passo fondamentale per garantire risultati riproducibili è assicurarsi che i topi siano completamente basali. Ciò richiederà uno sperimentatore ben addestrato in grado di applicare con precisione i filamenti di von Frey. È probabile che ci vorranno circa 7 giorni prima che un animale raggiunga la linea di base. Tuttavia, è possibile che non tutti gli animali raggiungano la linea di base mirata. Nella nostra esperienza, dopo circa 7 giorni di lavoro con i topi, solo il 60% -70% degli animali raggiungerà una linea di base di 0,6 g nella regione periorbitale, ma questo dipende dalla coorte di animali. Questa tempistica dovrebbe essere considerata prima di iniziare un esperimento per garantire che vengano utilizzati numeri sufficienti per tenere conto dell'abbandono scolastico e che gli animali abbiano l'età corretta dopo il basale per l'utilizzo di questo metodo non invasivo per stimolare la dura. I passaggi per determinare una linea di base sono descritti nella sezione 4 del protocollo.

Una limitazione al test di von Frey è che può essere difficile distinguere tra risposte al dolore e toelettatura / prurito di routine. Per aiutare a distinguere il dolore dalla toelettatura, è importante notare il periodo di tempo in cui si verifica questo comportamento. Di solito, una risposta al dolore è un colpo dopo l'applicazione del filamento, mentre i comportamenti di toelettatura tendono ad essere prolungati e possono durare per diversi secondi o minuti. Se il comportamento di toelettatura / prurito non può essere distinto da una risposta ipersensibile, è meglio non registrarlo come risposta. Inoltre, il posizionamento improprio del filamento (ad esempio, lo scivolamento del filamento) può comportare una cura prolungata dell'animale, rendendo difficile il test corretto. Se ciò accade, lo sperimentatore dovrebbe attendere fino a quando la toelettatura non si è fermata e il mouse è abbastanza calmo da testare. Continuare dallo stesso filamento utilizzato prima dell'inizio del comportamento di toelettatura. Se il mouse continua per periodi di tempo molto lunghi, riposizionare il mouse nella camera di prova per circa 5 minuti. Una volta trascorsi i 5 minuti, prova a testare di nuovo il mouse. Se questo comportamento continua senza alcuna risoluzione, i topi devono essere rimossi dallo studio. Di importanza, non è consigliabile radersi la pelliccia sul viso in quanto non è chiaro se la pelle del topo mantenga la stessa sensibilità dopo la rimozione dei peli e il processo di depilazione (rasatura, creme depilatorie) può anche influenzare la sensibilità della pelle.

Nella maggior parte delle situazioni, è ideale per somministrare sostanze sulla dura non più di 24 ore dopo che il topo ha raggiunto la linea di base. Si raccomanda che i topi siano sottoposti a test del filamento di von Frey una volta all'ora. Se possibile, il test a ore alterne dà abbastanza tempo agli animali per calmarsi dopo il test. Inoltre, gli esperimenti dovrebbero essere programmati in modo da non interferire con i loro modelli circadiani. Le alterazioni del ritmo circadiano nei topi possono alterare i fenotipi comportamentali e alla fine portare a risultati irriproducibili.

Il test periorbitale di von Frey può essere utilizzato in combinazione con altri saggi comportamentali per rafforzare le conclusioni sperimentali. La scala della smorfia si basa su espressioni facciali spontanee nei roditori piuttosto che su risposte evocate18,19. Questo metodo ha un'elevata accuratezza e affidabilità nella valutazione e quantificazione dei comportamenti del dolore acuto ed è stato utilizzato in molti modelli preclinici di emicrania12,30. Quando si utilizzano sia i saggi di von Frey smorfici che quelli periorbitali, lo sperimentatore dovrebbe prendere in considerazione il punteggio per la smorfia prima dell'applicazione dei filamenti di von Frey nella regione periorbitale del topo. Ciò garantisce che il comportamento di smorfia sia spontaneo e non evocato dall'applicazione del filamento. L'ipersensibilità meccanica hindpaw può essere utilizzata anche in combinazione con il test di von Frey periorbitale. Contrariamente al punteggio della smorfia, è meglio testare l'ipersensibilità facciale prima di valutare l'ipersensibilità della zampa posteriore. Il test Hindpaw richiede che il topo venga riposizionato nella camera senza la tazza dopo il completamento del test periorbitale di von Frey.

In conclusione, il test periorbitale di von Frey e la stimolazione durale non invasiva nei topi aggiungono opzioni preziose all'attuale gamma di modelli preclinici di emicrania. Se eseguita correttamente, questa tecnica presenta un approccio raffinato per generare un fenotipo simile al mal di testa nei roditori, in quanto non richiede l'impianto chirurgico di una cannula. Nei ratti, le cannule sono soggette a infezioni batteriche, possono ostruirsi, possono cadere e richiedono che ogni animale sia alloggiato singolarmente, creando uno stress inutile sull'animale. Inoltre, il protocollo di stimolazione durale può essere facilmente modificato per l'uso con diverse applicazioni farmacologiche. I paradigmi di test periorbital von Frey possono anche essere modificati per adattarsi al meglio alle specifiche sperimentali. Inoltre, il test periorbitale di von Frey può essere utilizzato in altri disturbi del dolore orofacciale. Queste tecniche sono uno strumento importante per aiutare a comprendere ulteriormente i complessi meccanismi alla base del dolore emicranico.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (NS104200 e NS072204 a GD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 oz Hot Paper Cups Choice Paper Company 5004W https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads Fisherbrand 14-206-65 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula P1 Technologies (formerly Plastics One) 8IC313ISPCXC I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes Hamilton 80008 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm Cole-Palmer EW-96460-10 https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire Custom The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers Custom Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments Touch test/Stoelting 58011 https://www.stoeltingco.com/touch-test.html

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Stimolazione durale e test di von Frey periorbitale nei topi come modello preclinico di cefalea
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Mason, B. N., Avona, A., Lackovic, J., Dussor, G. Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache. J. Vis. Exp. (173), e62867, doi:10.3791/62867 (2021).

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