Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

גירוי דוראלי ובדיקות פריאורביטל פון פריי בעכברים כמודל פרה-קליני של כאב ראש

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

התסמין הבולט ביותר של מיגרנה הוא כאבי ראש חמורים, וההשערה היא כי הדבר מתווך על ידי נוירונים חושיים המחדירים את קרום המוח. כאן אנו מציגים שיטה ליישום מקומי של חומרים על הדורה באופן זעיר פולשני תוך שימוש ברגישות יתר לפנים כפלט.

Abstract

קרום המוח הגולגולתי, המורכב מהדורה מאטר, ארכנואיד ופיה מאטר, נחשבים כמשרתים בעיקר תפקודים מבניים של מערכת העצבים. לדוגמה, הם מגנים על המוח מפני הגולגולת ומעגנים/מארגנים את האספקה הווסקולרית והנוירונית של קליפת המוח. עם זאת, קרום המוח מעורב גם בהפרעות במערכת העצבים כגון מיגרנה, שם הכאב שחווה במהלך מיגרנה מיוחס לדלקת סטרילית מקומית והפעלה לאחר מכן של אפרנטים נוסיספטיים מקומיים. מבין השכבות בהרי קרום המוח, הדורה מאטר מתעניין במיוחד בפתופיזיולוגיה של מיגרנות. הוא בעל כלי דם גבוהים, מכיל תאי עצב מקומיים, והוא ביתם של מגוון רחב של תאים מקומיים כגון תאים חיסוניים. שינויים עדינים במיקרו-סביבה המקומית של קרום המוח עלולים להוביל להפעלה ורגישות של נוציצפטורים פריווסקולריים דוראליים, ובכך להוביל לכאבי מיגרנה. מחקרים ביקשו לטפל באופן שבו אפרנטים דוראליים הופכים להיות מופעלים/רגישים על ידי שימוש באלקטרופיזיולוגיה in vivo, טכניקות הדמיה או מודלים התנהגותיים, אך אלה דורשים בדרך כלל ניתוחים פולשניים מאוד. פרוטוקול זה מציג שיטה ליישום לא פולשני יחסית של תרכובות על דורה מאטר בעכברים ושיטה מתאימה למדידת רגישות מישוש דמוית כאב ראש באמצעות בדיקת פון פריי פריי פריירביטלית לאחר גירוי דוראלי. שיטה זו שומרת על שלמות הדורה והגולגולת ומפחיתה את ההשפעות המבלבלות של טכניקות פולשניות על ידי הזרקת חומרים דרך צינורית שונה בקוטר 0.65 מ"מ בצומת של תפרים סגיטליים ולאמבדואידים לא מאוכלסים. מודל פרה-קליני זה יאפשר לחוקרים לחקור מגוון רחב של גירויים דוראליים ואת תפקידם בהתקדמות הפתולוגית של מיגרנה, כגון הפעלת נוציצפטורים, הפעלת תאי מערכת החיסון, שינויים בכלי הדם והתנהגויות כאב, כל זאת תוך שמירה על מצבים נטולי פציעות בגולגולת ובקרומי קרום המוח.

Introduction

מיגרנה כואבת עדיין בעיה מרכזית בבריאות הציבור ברחבי העולם. ארגון הבריאות העולמי מדרג אותה כמחלה השישית בשכיחותה בעולם, כשהיא סובלת מקצת פחות מ-15% מאוכלוסיית כדור הארץ1 וגורמת לנטל חברתי-כלכלי משמעותי על החברה 2,3. אפשרויות הטיפול ויעילותן היו לא אופטימליות ומספקות רק הקלה סימפטומטית ואינן משנות באופן משמעותי אירועים פתופיזיולוגיים שבבסיסם התרחשות מיגרנה 4,5. חוסר ההצלחה הטיפולית נובע ככל הנראה מכך שמיגרנה היא הפרעה מולטי-פקטוריאלית שהפתולוגיה שלה אינה מובנת היטב, מה שמוביל למספר מוגבל של מטרות טיפוליות. מיגרנה היא גם מאתגרת ללכידה מלאה במודלים של בעלי חיים, במיוחד לאור העובדה שאבחון מיגרנה נעשה על סמך תקשורת מילולית עם מטופלים המתארים את החוויה שלהם עם סימני היכר של מיגרנה כגון הילה, כאבי ראש, פוטופוביה ואלודיניה. עם זאת, חשוב לציין כי ההתקדמות האחרונה בטיפולי מיגרנה עולה כיום על טיפולים במצבים נוירולוגיים רבים שאומתו היטב על ידי מודלים פרה-קליניים. לדוגמה, נוגדנים חד-שבטיים ומולקולות קטנות המכוונות לפפטיד הקשור לגן קלציטונין, או לקולטן שלו, הצליחו מאוד לשפר את איכות חייהם של הסובלים ממיגרנה ועלולים לשנות את הניהול הקליני של מיגרנה. אמנם חלה התקדמות בהבנת ההפרעה הזו, אך עדיין יש הרבה דברים שטרם הובהרו.

בהתבסס על מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ומחקרים בבני אדם, מקובל כי מיגרנות נגרמות על ידי הפעלה חריגה של סיבים נוסיצפטיביים בתוך קרום המוח המאותתים דרך הגרעינים הטריגמינליים והצוואריים העליונים 6,7,8,9,10. למרות תיאוריה זו, מחקרים רבים עדיין משתמשים במתן סיסטמי של תרופות כדי להבין את המנגנונים התורמים הבסיסיים במיגרנה. בעוד שמינון מערכתי של תרופות חיזק באופן משמעותי את הבנתנו, ממצאים אלה אינם מעריכים באופן ישיר אם פעולות מקומיות בתוך רקמת המטרה המעניינת ממלאות תפקיד במיגרנה. לעומת זאת, מספר מחקרים נקטו בגישה כדי לעורר את הדורה; עם זאת, ניסויים אלה דורשים השתלת צינורית באמצעות כריתת גולגולת פולשנית וזמני התאוששות ממושכים11,12. בגלל המגבלות האלה, פיתחנו גישה זעיר פולשנית כדי לעורר את הדורה באופן מקומי, כאשר היעדר כריתת גולגולת מבטל את ההחלמה לאחר הניתוח ומאפשר ניסויים מיידיים בבעלי חיים ערים 12,13,14. זריקות אלה מבוצעות בהרדמה איזופלורנית קלה וניתנות בצומת של תפרים סגיטליים ומבדואידים בעכברים.

מספר גישות פותחו כדי להעריך תגובות התנהגותיות nociceptive במכרסמים15. אלודיניה עורית דווחה בכ-80% מהסובלים ממיגרנה16,17 ומייצגת נקודת קצה תרגומית פוטנציאלית לשימוש במכרסמים. במודלים פרה-קליניים, היישום של חוטי פון פריי על האזור הכפי של כף המכרסמים שימש להערכת התנהגויות כאב במודלים פרה-קליניים של מיגרנה. המגבלה העיקרית של גישה זו היא שהיא אינה בודקת את האזור הצפלי. ניקוד עגמומי פנים שימש ללכידת התנהגויות כאב במכרסמים על ידי ניתוח הבעות פנים לאחר אינדוקציה של גירויי כאב18,19. עם זאת, מגבלותיו כוללות רק לכידת תגובות לגירויים חריפים ולא מצבי כאב כרוניים. טיפוח פנים וגידול מופחת נחשבים גם לתפוקות של תגובות התנהגותיות במודלים פרה-קליניים של מיגרנה20,21. המגבלות של הראשונים כוללות קושי בהבחנה בין תגובות כאב לבין טיפוח שגרתי רגיל ותחושות אחרות כגון גירוד. במקרה של האחרון, התנהגויות גידול בדרך כלל פוחתות במהירות לאחר הכנסת מכרסמים לסביבות חדשות. למרות שכל אחת מנקודות הקצה ההתנהגותיות הללו היא בעלת ערך בהבנת מנגנונים שונים התורמים למצבי כאב, קיים צורך קריטי במודלים פרה-קליניים של הפרעות כאב כגון מיגרנה כדי לכלול נקודות קצה הלוכדות באופן ספציפי תגובות רגישות יתר צפלית. הערכת רגישות יתר למישוש של העור הפריאורביטלי בעקבות גירוי דוראלי היא שיטה שעשויה לספק תובנה טובה יותר לגבי מנגנונים התורמים למיגרנות שבהן הסימפטומים החושיים הם בעיקר צפליים בטבעם. כאן אנו מתארים שיטה למתן חומרים על דורה העכבר כמודל פרה-קליני של מיגרנה. בעקבות היישום הדוראלי, אנו מציגים גם שיטה מפורטת לבדיקת רגישות יתר של מישוש פריאורביטלי באמצעות חוטי פון פריי מכוילים המיושמים בשיטת דיקסון למעלה-מטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים נערכו באישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טקסס בדאלאס. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים מסוג ICR (CD-1) (30-35 גרם) וב-C57/BL6 (25-30 גרם).

1. אינפוזיה דוראלית

  1. צרו את המזרקים/מזרקים לעכבר על-ידי שינוי צינורית פנימית ומזרק הזמינים מסחרית להזרקות חד-צדדיות עם מכסה פלסטיק סיליקה מתמזג שאינו מתכתי, הניתן לכוונון ומכניס/מתרחב מתחת לצינורית מנחה של 28 גרם עם קוטר פנימי (I.D.) של 0.18 מ"מ וקוטר חיצוני (O.D.) של 0.35 מ"מ (איור 1A).
  2. השתמש בקליפר או במכשיר מדידה אחר כדי להתאים את מכסה הפלסטיק סיליקה שהתמזג על האינפיר לאורך של 0.6 מ"מ; נמדד מקצה האינפיר ועד לקצה מכסה הפלסטיק של סיליקה.
    1. יש להיזהר שלא לכופף או להקהות את ההחדרה בעת כוונון מכסה הפלסטיק.
    2. עבור זני עכברים אחרים שלא שימשו בעבר להזרקות דוראליות, קבעו את אורך ההחדרה האופטימלי על ידי הגדרת האורך ל-0.6 מ"מ וביצוע זריקות טייס עם דיו או צבע, התאמת אורך האינפיר עד שיבחין כי הצבע נמצא רק ב-dura mater ולא במוח או בגולגולת.
  3. חברו את הקצה הארוך (או את הקצה שלא נמדד כ-0.6 מ"מ) של החדר המותאם לצינורות פלסטיק (צינורות משאבה, 2 עצירות, תעודת זהות 0.19 מ"מ, אורך 406 מ"מ).
    1. חותכים את הצינורות לאורך מינימלי של 8 אינץ' כדי להבטיח שיש מספיק קו כדי להחזיק נפח של 5 μL.
    2. וודאו שהצינורות מכסים את חלק המתכת ואת החלק העליון של פקק הפלסטיק הממוקם על האינפיר. זה יעזור למנוע מבועות אוויר להצטבר בשורה.
  4. חברו את הקצה השני של הצינור למיקרו-מזרק זכוכית של 10 מיקרו-ליטר (מחט צמנטית אטומה לגז; 21 גרם עם הקרנה של 10 מ"מ), שוב, והקפידו על אטימה הדוקה מעל החלק המתכתי של המזרק (איור 1A).
  5. לאחר חיבור הקו, מלאו את המזרק ב-5 μL של מלוחים עם מאגר פוספט (PBS), נוזל אינטרסטיציאלי סינתטי (SIF) או כלי רכב אחרים לפי בחירתם כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר.
    1. אם בועות אוויר נצפות בקו, הצפת את הקו עם הרכב עד שהבועות יתפוגגו.
      הערה: זה עשוי לעזור למלא את המזרק ברכב לפני חיבורו לקו ולאחר מכן לדחוף את הנוזל דרך הקו לאחר החיבור.
  6. לאחר שהקו מתמלא ב-5 μL של הרכב ופועל ביעילות, העמיסו 5 μL של התרופה/תמיסה לתוך מזרק המילטון (דיו או צבע עשויים לשמש כחלופה לתרופה/תמיסה אם לומדים או מתרגלים טכניקה זו).
    1. ודא שכל פתרונות הרכב הניתנים על הדורה נשמרים ב- pH 7.4 ונמדדים לאוסמולאליות של 310. זה מקטין את ההפעלה הפוטנציאלית של תעלות יונים עם חישה חומצית ותעלות אוסמוזנסיטיביות אחרות בתוך הדורה.
  7. הנפח המרבי שנבדק בעכברים שלא גרם לדליפה לתוך המוח הוא בערך 10 μL. ההשפעות ההתנהגותיות לאחר זריקות עם נפח זה לא נבדקו. מסיבה זו, לנהל רק 5 μL של הפתרון על dura.
    הערה: תצפיות אלה מבוססות על זני/גילאים/משקלים של עכברי CD1/ICR בני 6-8 שבועות.

2. זריקות דוראל

  1. לאחר הכנת המזרק והתרופה טעונה, הניחו עכבר שטוח על בטנו והרדמה אותו תחת איזופלורן קצר של 3% עם קצב זרימת חמצן של 0.5-1 ליטר/דקה באמצעות חרטום האף.
    1. לאחר שהעכבר כבר לא מציג רפלקס צביטה, התאימו את ההרדמה וקיימו אותה באיזופלורן של 1.5%.
  2. לאחר הרדמה, להחיל משחה אופטלמית סטרילית על העיניים ולגלח את ראש החיה, ולאחר מכן לחטא את העור עם povidone-יוד ואתנול. בעקבות זאת, להגיע למצב התורם לזריקה מוצלחת.
  3. השתמש ביד אחת כדי לייצב את ראש החיה ולהחזיק את ההחדרה ביד השנייה.
  4. בדקו היטב ואתרו את הצומת של התפרים הסגיטליים והלמבדואידיים על גולגולת העכבר (איור 1B, C).
    1. כדי לאתר את הצומת הדיסקרטי הזה דרך העור, השתמש בתכונות הטופוגרפיות של הגולגולת ובדוק בעדינות את המיקום הכללי של הצומת עם החדר.
    2. ודא את מיקום הצומת על ידי מיקום מחדש של ההחדרה לאורך הגולגולת ותחושת המיקום המדויק.
  5. ברגע שהתפר ממוקם והתפר נמצא במקומו, לאט מאוד ובעדינות מנגבים את האינפיר קדימה ואחורה עד שהוא חודר דרך העור ויורד אל הצומת עד לפקק הפלסטיק.
    הערה: הקפד להכניס את כל קצה ה- 0.6 מ"מ של ההחדרה לצומת.
  6. כדי לאמת את הדיוק, השתמש בדיו או בצבע כפתרון הזרקה והרדמה ועריפת ראש של העכבר.
    1. הסר את מכסה הגולגולת כדי לדמיין את הצבע בתוך הדורה מאטר (איור 1C).
      הערה: אין לראות צבע על המוח או על החלק החיצוני של הגולגולת. כמו כן, עכברים בכל ניסוי צריכים להיבדק לאחר המוות כדי לוודא את דיוק ההזרקה, כמו גם כדי להבטיח את שלמות הדורה מאטר לא נפגעה.
  7. לאחר ההזרקה, מוציאים את העכבר מהרדמה, ממתינים עד שהוא יחזור להכרה ואז חוזרים לכלוב שלו או מניחים אותו בתא בדיקה כדי להתחיל את הבדיקות הרצויות.
    הערה: אפשר לעכבר להתאושש מהרדמה למשך 30 דקות לפחות לפני ביצוע ניסויים התנהגותיים כלשהם.

3. פריורביטל פון פריי

  1. התחל את המחקר עם קבוצה של כ 16-20 עכברים.
  2. יום אחד לפני ההרגלה, טפלו בכל עכבר במשך 5 דקות לפחות.
  3. כ-24 שעות לאחר הטיפול, התרגלו העכברים לתנאי חדר הבדיקה ולמנגנון הבדיקה של פון פריי (איור 2A).
    הערה: מנגנון הבדיקה האקרילי מורכב מתאים בודדים עם מכסים שהם בערך 3 אינץ ' x 3.5 אינץ ' x 5 אינץ ' (W x H x D) ונתמכים על ידי מעמדי אלומיניום המחוברים באמצעות 0.25 ב 19 G חוט רשת פלדה מגולוון מרובע.
    1. הניחו את העכברים בתוך נייר לבנה באורך 4 אונקיות הממוקמת אופקית, חסרת ריח ואינה מכילה פוליתן או שעוות פרפין.
      הערה: סוגים אלה של כוסות מועדפים מכיוון שהם מפחיתים את ההפרעות במערכת העיכול בעכברים אם הם נבלעים (איור 2B).
  4. בזמן שהחיות נמצאות בחדרים המתאימים להן, מניחות כדור של דיאטת הצ'או הרגילה בחדר הבודד של כל עכבר כדי להרגיע את החיות ולהימנע מכל לחץ מיותר על בעלי החיים. עשו זאת במשך 3 ימים לפני כל בדיקת התנהגות של פון פריי.
    1. ודא שבכל פעם שהעכברים נמצאים בחדר יש גישה למזון.
    2. מספר והקצה כל חיה לאותו שטח במדף הבדיקה. הניחו את העכבר באותה בכל יום של תקופת הבדיקה כדי להבטיח שכל בעל חיים יתאקלם בסביבת הבדיקה שלו.
      הערה: עכברים יכרסמו את הכוסות ולאחר מכן ישמידו את הכוסות. אם זה אמור לקרות, החלף את הכוס ותייג אותה במספר העכבר המתאים.
  5. לאחר 3 הימים הראשונים של ההרגלה, הניחו את העכברים בתאים הבודדים שלהם.
    1. אפשרו לבעלי החיים להתאקלם בחדר הבדיקה ובחדרי הבדיקה למשך שעה לפחות לפני כל ניסוי של פון פריי כדי לאפשר לעכברים להירגע ולאחר מכן קל יותר לבחון אותם.
  6. לאחר ההתאקלמות לחדר ביום הבדיקה, יש להסיר עכבר אחד בעודו בכוס שלו מהתא המתאים.
    1. שמרו על הגביע במצב האופקי כך שהעכבר נמצא גם על המצח וגם על כפות הרגליים האחוריות כדי לסייע בפיזור שווה של משקלם.
      הערה: חלוקת משקל לא שוויונית עשויה לשנות את תגובות בעלי החיים ואף למנוע מבעלי חיים להגיב.
  7. הניחו את הכוס עם העכבר בפנים על השולחן מתחת לארון הבדיקה על משטח הספיגה.
  8. לצורך בדיקת פון פריי פריי, הניחו את נימת פון פריי 0.07 גרם ישירות במרכז הפנים ובין העיניים.
  9. הפעילו מספיק לחץ על החוט כדי לגרום לשיער פון פריי להתכופף לתצורה בצורת "C".
    1. שמור על קשר עם האזור לפחות 3 שניות אבל לא יותר מ 5 שניות או עד שהעכבר מושך את ראשו ומחליק על החוט עם הכפה שלו.
      הערה: אם החוט מחליק או יותר מכפי שקצה החוט נוגע בבעל החיים במהלך הניסויים, אין לספור את כל התגובות. תגובות אלה עשויות להיות בתגובה למברשת המופעלות על ידי מכניורצפטורים שונים ולכן עשויות שלא לשקף תוצאות מדויקות.
    2. החל את חוטי פון פריי על פי שיטת "מעלה-מטה" של דיקסון22,23.
      1. בתחילה, החל את נימה פון פריי אשר יש משקל של 0.07 גרם. החוט הנמוך ביותר האפשרי והנימה הנבדקת הגבוהה ביותר במחקר זה הם חוטים עם משקלים של 0.008 גרם ו -0.6 גרם, בהתאמה.
      2. השתמש בחוטים של משקל 0.008 גרם, 0.02 גרם, 0.04 גרם, 0.07 גרם, 0.16 גרם, 0.4 גרם ו- 0.6 גרם כדי לבצע בדיקה זו.
      3. בשיטה זו, אם בעל חיים אינו מפגין תגובה לחוט, החל את החוט של משקל הגרם הגבוה הבא.
      4. אם העכבר אכן מגיב לחוט, שקול שהעכבר מגיב לחוט זה. אם זה המקרה, החל את החוט של משקל הגרם התחתון הבא.
      5. חזרו על דפוס זה עד שהחיה תיבדק 4 פעמים לאחר התגובה הראשונית או שבעל החיים ייקבע כלא מגיב לחוטים כלשהם שנבדקו בבדיקה.
        הערה: הימנעו מהפעלת לחץ נוסף הנובע מהזרוע או מפרק כף היד. ניתן להשתמש בסולם כדי לתרגל את היישום של החוט.

4. בדיקת ספי נסיגה בסיסיים

  1. לפני ההכללה בניסוי, ודא שהעכברים מגיעים לסף נסיגה בסיסי בין 0.5-0.6 גרם.
    1. עכבר מגיע לנקודת ההתחלה אם הוא לא מגיב לכל נימה שנבדקה בסדרה המוזכרת בשלב 3.9.2.2 (0.07 גרם, 0.16 גרם, 0.4 גרם ו- 0.6 גרם).
  2. בדוק עכברים מדי יום בעת קביעת ספי נסיגה בסיסיים.
    1. ניסויים מאפשרים לבעלי חיים להתאקלם לתנאי הניסוי וללחץ של חוטי פון פריי.
    2. אם העכברים עדיין רגישים מאוד לאחר היום השלישי של הבדיקה, נסו להמתין יום או יומיים לפני הבדיקה שוב.
      הערה: זמן רב מדי בין ימי הניסוי עלול לגרום לכך שבעל החיים לא יסתגל למשקל הנימה באזור הפריאורביטלי שלו, ובכך לא יגיע לסף הנסיגה הממוקד.
  3. בדקו את העכברים במשך כ-7 ימים לפני שקבעו אילו בעלי חיים אינם עומדים בקריטריוני ההכללה לניסוי.
    הערה: כ-70% מהעכברים יגיעו לרמה הבסיסית הממוקדת.
    1. לפני גירוי דוראלי, נתח את הנתונים הבסיסיים כדי לא לכלול כל עכבר שלא הגיע לערך בסיסי של 0.5-0.6 גרם ומעלה.
    2. לאחר ההחרגה, הקצה באופן אקראי כל עכבר שנותר לקבוצת בדיקה. השג זאת על-ידי ציור מתוך או כתיבת סקריפט בגיליון אלקטרוני כדי לחלק מספרים באופן אקראי לקבוצה.

5. ניתוח תוצאות פון פריי

  1. לאחר קבלת סדרת התגובות, קבעו את ערך הדלתא, k, סף ה-50% ואת סף הנסיגה בגרמים על פי שיטות שפורסמו בעבר24.
  2. חשב את סף הנסיגה באמצעות נוסחה זו WT = 10(x*F+B), כאשר WT = סף נסיגה, F = סף נסיגה הכפה המחושב בשיטת Chaplan, ו- B = רגרסיה ליניארית של יומן (כוח כיפוף) = x* מספר נימה + B.
  3. התאם את הנתונים כסף נסיגה של 50% או סף משיכה ממוצע בגרמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת הזרקה זו משמשת למתן גירויים על הדורה של עכברים, כך שבדיקות התנהגותיות עוקבות עשויות להתרחש. התפוקה ההתנהגותית הנפוצה ביותר שנמדדה במודל זה היא רגישות יתר עורית לפנים שהוערכה באמצעות von Frey 12,13,14. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש במודל זה כדי להעריך תרומות פוטנציאליות ספציפיות למין לפתולוגיה של מיגרנה (איור 3).

הליך זה שימש לבחינת ההשפעות של פרולקטין דוראלי (PRL) על רגישות יתר מכנית לפנים14 (איור 3). תוצאות מחקר זה הראו כי נקבות עכברי ICR מראות סף נסיגה מבפנים מופחת באופן משמעותי בתגובה ל-5 מיקרוגרם של פרולקטין דוראלי (איור 3A). מינון נמוך פי עשרה של 0.5 מיקרוגרם פרולקטין (PRL) הראה גם תגובות דומות למינון גבוה של PRL (איור 3B).

הודגם כי זריקות אלה גם מייצרות התנהגויות ספונטניות הקשורות לכאב שהוערכו באמצעות צער. Dural 0.5 μg של PRL גרם להפרעות משמעותיות בעכברים נקבות (איור 3C), מה שמדגים עוד יותר את התפקיד הברור של PRL דוראלי בהתנהגויות דמויות מיגרנה נקבית. ביצענו מבחני קודר לפני כל הבדיקות עם חוטי פון פריי.

Figure 1
איור 1: החדרה דוראלית ומיקום הזרקה. (A) המזרקים/מחדירים מורכבים מצינורית מותאמת המותאמת לאורך של כ-0.5 מ"מ- 0.65 מ"מ ומחוברת למחט המודבקת על מזרק אטום לגז של 10 μL באמצעות צינורות טייגון. (ב) מבט אווירי על מיקום אתר ההזרקה המסומן בראש העכבר. (C) (לוח שמאלי) דיאגרמה של מיקום ההזרקה הדוראלית. מיקום ההזרקה נמצא בצומת של תפרים למבדואידים וסגיטליים בכ-4.8 מ"מ אחוריים לברגמה. (לוח אמצעי) מבט אווירי לאחר המוות על גולגולת עכבר לאחר הזרקה דוראלית של 5 μL של צבע הזרקה כחול. (לוח ימני) הפרדת כיפה של העכבר מהמוח. לא נצפתה דליפה של צבע הזרקה כחול על המוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תאי בדיקה של פון פריי. (A) תא הבדיקה של פון פריי מורכב מ-3.5 אינץ' x 3.5 בתאי אקריליק בודדים עם מכסים המונחים על מתלה רשת תיל. אלה מחוברים באמצעות עמודות של 10 תאים המאורגנים ב -2 שורות. (B) דוגמה לעכברים בכוסות הבודדות שלהם השוכנות בתוך תאי הבדיקה של פון פריי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: יישום דוראלי של פרולקטין משרה תגובות התנהגותיות בעכברים. ספי נסיגה מכניים הוערכו לאחר יישום דוראלי של PRL (5 מיקרוגרם או 0.5 מיקרוגרם) בעכברים נקבות. (A) יישום של 5 מיקרוגרם של PRL (n = 7 PRL, n = 6 רכב) גרם לרגישות יתר של הפנים בהשוואה לרכב. (B) יישום של 0.5 מיקרוגרם של PRL (n = 5 PRL, n = 4 רכב) גרם לרגישות יתר לאורך זמן בפנים. (C) Grimace הוערך גם באותם עכברים שטופלו ב-0.5 מיקרוגרם של PRL בכל נקודת זמן. עכברים אלה הפגינו ציונים גבוהים יותר באופן משמעותי בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב. סטטיסטיקה: ANOVA דו-כיווני ואחריו ניתוח השוואתי מרובה של Bonferroni לאחר הוק. הנתונים מיוצגים כאמצעים ± SEM. *p < 0.05, ****p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שינויים לא מסתגלים במערכת הנוסיקפטיבית המקומית בדורה נחשבים לתורמים מרכזיים לשלב כאבי הראש של התקפי מיגרנה למרות היעדר פגיעהברקמות 25,26. כאן המחקר מציג שיטה לפיה גירוי זעיר פולשני של הדורה יכול לגרום לרגישות יתר של מישוש בפנים. הבהרת המנגנונים והאירועים המעורבים בהפעלת נוסיספטורים דוראליים מבלי לגרום נזק לגולגולת ולרקמות עשויה לשקף בצורה מדויקת יותר את מנגנוני המיגרנה במודל פרה-קליני.

קרניוטומיה והשתלת צינורית שימשו זה מכבר להערכת תפקודים ומנגנונים התורמים לכאבי מיגרנה11,12. עם זאת, דווח כי גולגולת יכולה לגרום להפעלה של תאי פיטום דוראליים ולהגביר את חדירות כלי הדם הפיאליים במכרסמים27. בהתחשב בכך שהפעלת תאי התורן בדורה מעורבת מאוד במיגרנה 7,8,28,29, לטכניקה זו יש אזהרות גדולות שעשויות להטות את הפרשנות. מתן חומרים דרך הצומת של התפרים הסגיטליים והלמבדואידליים מפחית למעשה את הפעלתם של נוסיצפטורים המתווכים על ידי הפעלת תאי פיטום המושרים על ידי קרניוטומיה. יתר על כן, גירוי דוראלי לא פולשני אינו דורש התאוששות לאחר הניתוח ומתן משככי כאבים אשר עשויים לשנות את הפרשנות של התוצאות. יישום מקומי של חומרים על הדורה מאפשר לחוקרים להתמקד ברקמת מטרה ספציפית זו, בניגוד למתן סיסטמי של תרופות שבהן מקום הפעולה אינו נקבע בקלות 12,13,14. בעוד שניהול סיסטמי של חומרים כגון ניטרוגליצרין ופפטידים הקשורים לגנים של קלציטונין מעוררים התקפות ניסיוניות בבני אדם הדומות למיגרנות, הם אינם מאפשרים הערכה של מיקום הפעולה במודלים של מכרסמים; מודלים ממוקדים יותר הספציפיים לרקמות מציעים גישה חלופית.

טכניקה זו המתוארת כאן כוללת הזרקת סם או תמיסה אחרת ישירות על הדורה מאטר של קרום המוח דרך הצומת שבו תפרים sagittal ו lambdoidal של הגולגולת נפגשים. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להשתמש בעכברי ICR (CD-1) או C57/BL6 בגילאי 6-8 שבועות לניסויים אלה. ניתן להשתמש בעכברים צעירים יותר; עם זאת, השימוש בעכברי ICR (CD-1) שגילם עולה על 8 שבועות אינו מומלץ מכיוון שתפרי צלחת הגולגולת שלהם מתמזגים בדרך כלל לחלוטין בגיל זה, מה שהופך את זה לבלתי אפשרי להזריק מבלי לפגוע בגולגולת. חשוב גם לקחת בחשבון את המשקל/הגודל של כל עכבר שיעבור הליך זה. מומלץ לבצע זריקות אלה על בעלי חיים בעלי משקל העולה על 19 גרם מכיוון שהגולגולת בדרך כלל דקה מאוד במשקלים נמוכים יותר ועשויה שלא לעמוד בלחץ המופעל במהלך ההזרקה. חשוב מחשיבותם, ישנם גם גורמים אפשריים התורמים לגיל/משקל שבו מתרחש היתוך לוחות הגולגולת (למשל, הרכב צ'או המעבדה המשמש במתקני בעלי חיים). לכן, ייתכן שהנסיינים יצטרכו לקבוע את טווח הגיל/משקל המתאים בתנאים שלהם. טווחי גיל שונים ומשקולות בעלי חיים שונים עשויים להידרש עבור זנים או גנוטיפים אחרים של עכברים, בהתאם למועד שבו לוחות הגולגולת מתמזגים באותם בעלי חיים, ועשויים גם לדרוש אופטימיזציה של ההזרקה עצמה.

כאשר לומדים או מתרגלים טכניקה זו, מומלץ מאוד לקבל רמה של נוחות עם איתור צומת התפר בעכברים המתים. ייתכן שעדיף לתרגל תחילה עם הקרקפת שנכרתה או התקלפה בחזרה בעכברים אלה ולהתקדם באיטיות לאיתור הצומת דרך העור. לאחר קביעת המיקום המדויק, ניתן להזריק דיו וצבעים לתוך הדורה כדי לוודא את דיוק המיקום והעומק של ההזרקה. טכניקה זו פותחה ומוטבה באמצעות עכברי ICR (CD-1) (30-35 גרם) ועכברי C57/BL6 (25-30 גרם). אורך החדרה של 0.5-0.6 מ"מ מספיק כדי להזריק עכבר במשקל בטווח של 25-35 גרם. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך לכייל את אורך האינפיר אם מזריקים עכברים השונים באופן משמעותי מהעכברים המשמשים לאופטימיזציה של טכניקה זו. לדוגמה, עכבר קטן מ-25 גרם יגרום ככל הנראה לשימוש במחדיר שאורכו פחות מ-0.5 מ"מ. עם שליטה בטכניקה זו וכאשר היא מבוצעת בעכברים המתאימים לגיל, שיעור ההצלחה של הזרקה זו יכול להיות קרוב ל -100%; עם זאת, סיבוכים עם הזריקה עשויים לנבוע מבעיות כגון שבירת הגולגולת עקב הפעלת כוח רב מדי כדי להחדיר את ההחדרה, כמו גם דימום חריג הנגרם על ידי פגיעה בכלי הדם של קרום המוח.

שינויים ברגישות למישוש הם מדד חשוב בעת הערכת התנהגויות כאב במכרסמים. כאן אנו מדגימים את השימוש בבדיקות פריאורביטליות של פון פריי כדי להעריך התנהגויות אלה במודל מיגרנה פרה-קלינית. יתרון מרכזי של שימוש בטכניקה זו במודלים של מיגרנה הוא שאנו יכולים להעריך רגישות יתר של הראש, שיש לה יותר רלוונטיות מאשר מיקומים אחרים שאינם גולגולתיים כגון כפות. הצעד הקריטי כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור הוא לוודא שהעכברים נמצאים בבסיס מלא. זה ידרוש נסיין מיומן היטב שיכול ליישם את חוטי פון פריי במדויק. סביר להניח שייקח כ-7 ימים עד שבעל חיים יגיע לנקודת ההתחלה. עם זאת, ייתכן שלא כל בעל חיים יגיע לבסיס היעד. מניסיוננו, לאחר כ-7 ימי עבודה עם עכברים, רק 60%-70% מבעלי החיים יגיעו לנקודת בסיס של 0.6 גרם באזור הפריאורביטלי, אך הדבר תלוי בקבוצת בעלי החיים. יש לקחת בחשבון את התזמון הזה לפני תחילת הניסוי כדי להבטיח שמספרים מספיקים משמשים כדי להסביר את הנשירה ושבעלי החיים הם הגיל המתאים לאחר הבסיס לשימוש בשיטה לא פולשנית זו כדי לעורר את הדורה. השלבים לקביעת קו בסיס מתוארים בסעיף 4 של הפרוטוקול.

מגבלה בבדיקת פון פריי היא שקשה להבחין בין תגובות כאב לבין טיפוח/גירוד שגרתיים. כדי לעזור להבחין בין כאב לטיפוח, חשוב להבחין במשך הזמן שבו התנהגות זו מתרחשת. בדרך כלל, תגובת כאב היא החלקה אחת לאחר מריחת החוטים, בעוד שהתנהגויות הטיפוח נוטות להיות ממושכות ויכולות להימשך מספר שניות עד דקות. אם לא ניתן להבחין בין התנהגות הטיפוח/גירוד לבין תגובה רגישה יתר על המידה, עדיף לא לרשום זאת כתגובה. בנוסף, מיקום נימה לא תקין (למשל, החלקת נימה) עלול לגרום לטיפוח ממושך של החיה, מה שמקשה על הבדיקה כראוי. אם זה קורה, הנסיין צריך לחכות עד שהטיפוח ייפסק והעכבר יהיה רגוע מספיק כדי לבדוק. המשך מאותו נימה ששימשה לפני תחילת התנהגות הטיפוח. אם העכבר ממשיך במשך התקפי זמן ארוכים מאוד, החזירו את העכבר לתא הבדיקה למשך כ-5 דקות. לאחר שחלפו 5 דקות, נסה לבדוק את העכבר שוב. אם התנהגות זו נמשכת ללא נחישות, יש להוציא את העכברים מהמחקר. חשוב לציין כי לא מומלץ לגלח את הפרווה על הפנים, שכן לא ברור אם עור העכבר שומר על אותה רגישות לאחר הסרת השיער, ותהליך הסרת השיער (גילוח, קרמים דקפילטוריים) עשוי גם הוא להשפיע על רגישות העור.

ברוב המצבים, הוא אידיאלי למתן חומרים על הדורה לא יותר מ 24 שעות לאחר שהעכבר הגיע לנקודת ההתחלה. מומלץ לעכברים לעבור בדיקות נימה של פון פריי פעם בשעה. במידת האפשר, בדיקה כל שעה אחרת נותנת מספיק זמן לבעלי החיים להירגע לאחר הבדיקה. בנוסף, יש לתזמן ניסויים כדי לא להפריע לתבניות הצירקדיות שלהם. שינויים בשעון הביולוגי בעכברים עשויים לשנות פנוטיפים התנהגותיים ובסופו של דבר לגרום לתוצאות בלתי ניתנות לשחזור.

ניתן להשתמש בבדיקות פון פריי (Periorbital von Frey) בשילוב עם מבחנים התנהגותיים אחרים כדי לחזק את המסקנות הניסוייות. סולם העגמומיות מסתמך על הבעות פנים ספונטניות במכרסמים ולא על תגובות מעוררות18,19. לשיטה זו יש דיוק ואמינות גבוהים בעת הערכה וכימות של התנהגויות כאב חריפות והיא שימשה במודלים פרה-קליניים רבים של מיגרנה12,30. כאשר משתמשים הן במבחנים של פון פריי והן במבחנים פריי-אורביטליים של פון פריי, על הנסיין לשקול ניקוד עבור גרימס לפני השימוש בחוטים של פון פריי לאזור הפריאורביטלי של העכבר. זה מבטיח שההתנהגות המחוספסת תהיה ספונטנית ולא תתעורר על ידי יישום נימה. ניתן להשתמש גם ברגישות יתר מכנית של Hindpaw בשילוב עם בדיקות פריאורביטל פון פריי. בניגוד לניקוד קודר, עדיף לבחון רגישות יתר לפני הערכת רגישות יתר של כף היד האחורית. בדיקת Hindpaw דורשת כי העכבר יונח בחזרה בתא ללא הכוס לאחר השלמת בדיקת פון פריי פריירביטל.

לסיכום, בדיקות פריאורביטליות של פון פריי וגירוי דוראלי לא פולשני בעכברים מוסיפים אפשרויות חשובות לטווח הנוכחי של מודלים פרה-קליניים של מיגרנה. כאשר היא מבוצעת כראוי, טכניקה זו מציגה גישה מעודנת ליצירת פנוטיפ דמוי כאב ראש במכרסמים, שכן היא אינה דורשת השתלה כירורגית של צינורית. בחולדות, צינוריות נוטות לזיהום חיידקי, עלולות להיסתם, עלולות ליפול, ולדרוש מכל בעל חיים להיות חד-ביתי, מה שיוצר לחץ מיותר על החיה. יתר על כן, ניתן לשנות בקלות את פרוטוקול הגירוי הדוראלי לשימוש עם מספר יישומי תרופות. ניתן גם לשנות את פרדיגמות הבדיקה של Periorbital von Frey כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר למפרטי הניסוי. בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקות פריאורביטליות של פון פריי בהפרעות כאב אורופציאליות אחרות. טכניקות אלה הן כלי חשוב כדי לעזור להבין עוד יותר את המנגנונים הבסיסיים המורכבים של כאב מיגרנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NS104200 ו- NS072204 עד GD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 oz Hot Paper Cups Choice Paper Company 5004W https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads Fisherbrand 14-206-65 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula P1 Technologies (formerly Plastics One) 8IC313ISPCXC I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes Hamilton 80008 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm Cole-Palmer EW-96460-10 https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire Custom The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers Custom Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments Touch test/Stoelting 58011 https://www.stoeltingco.com/touch-test.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Woldeamanuel, Y. W., Cowan, R. P. Migraine affects 1 in 10 people worldwide featuring recent rise: A systematic review and meta-analysis of community-based studies involving 6 million participants. Journal of the Neurological Sciences. 372, 307-315 (2017).
  3. Burch, R. C., Loder, S., Loder, E., Smitherman, T. A. The prevalence and burden of migraine and severe headache in the United States: updated statistics from government health surveillance studies. Headache. 55 (1), 21-34 (2015).
  4. Ashina, M. Migraine. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1866-1876 (2020).
  5. Ashina, M., et al. Migraine: integrated approaches to clinical management and emerging treatments. Lancet. 397 (10283), 1505-1518 (2021).
  6. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: Moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  7. Koyuncu Irmak, D., Kilinc, E., Tore, F. Shared Fate of Meningeal Mast Cells and Sensory Neurons in Migraine. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 136 (2019).
  8. Levy, D. Migraine pain, meningeal inflammation, and mast cells. Current Pain and Headache Reports. 13 (3), 237-240 (2009).
  9. Levy, D., Labastida-Ramirez, A., MaassenVanDenBrink, A. Current understanding of meningeal and cerebral vascular function underlying migraine headache. Cephalalgia. 39 (13), 1606-1622 (2019).
  10. Phebus, L. A., Johnson, K. W. Dural inflammation model of migraine pain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  11. Fried, N. T., Maxwell, C. R., Elliott, M. B., Oshinsky, M. L. Region-specific disruption of the blood-brain barrier following repeated inflammatory dural stimulation in a rat model of chronic trigeminal allodynia. Cephalalgia. 38 (4), 674-689 (2018).
  12. Avona, A., et al. Dural calcitonin gene-related peptide produces female-specific responses in rodent migraine models. The Journal of Neuroscience. 39 (22), 4323-4331 (2019).
  13. Burgos-Vega, C. C., et al. Non-invasive dural stimulation in mice: A novel preclinical model of migraine. Cephalalgia. 39 (1), 123-134 (2019).
  14. Avona, A., et al. Meningeal CGRP-Prolactin interaction evokes female-specific migraine behavior. Annals of Neurology. 89 (6), 1129-1144 (2021).
  15. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  16. Lipton, R. B., et al. Cutaneous allodynia in the migraine population. Annals of Neurology. 63 (2), 148-158 (2008).
  17. Goadsby, P. J. Migraine, allodynia, sensitisation and all of that. European Neurology. 53, Suppl 1 10-16 (2005).
  18. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  19. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  20. Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 11 (2019).
  21. Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central CGRP mechanisms. The journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
  22. Dixon, W. J., Mood, A. M. A method for obtaining and analyzing sensitivity data. The Journal of the American Statistical Association. 43 (241), 109-126 (1948).
  23. Dixon, W. The up-and-down method for small samples. The Journal of the American Statistical Association. 60, (1965).
  24. Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Molecular Pain. 10, 26 (2014).
  25. Ramachandran, R. Neurogenic inflammation and its role in migraine. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 301-314 (2018).
  26. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K. Does inflammation have a role in migraine. Nature Reviews Neurology. 15 (8), 483-490 (2019).
  27. Stokely, M. E., Orr, E. L. Acute effects of calvarial damage on dural mast cells, pial vascular permeability, and cerebral cortical histamine levels in rats and mice. Journal of Neurotrauma. 25 (1), 52-61 (2008).
  28. Theoharides, T. C., Donelan, J., Kandere-Grzybowska, K., Konstantinidou, A. The role of mast cells in migraine pathophysiology. Brain Research Reviews. 49 (1), 65-76 (2005).
  29. Conti, P., et al. Progression in migraine: Role of mast cells and pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. European Journal of Pharmacology. 844, 87-94 (2019).
  30. Rea, B. J., et al. Peripherally administered calcitonin gene-related peptide induces spontaneous pain in mice: implications for migraine. Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).

Tags

מדעי המוח גיליון 173 מיגרנה דורה מאטר רגישות יתר לפנים גירוי לא פולשני התנהגות
גירוי דוראלי ובדיקות פריאורביטל פון פריי בעכברים כמודל פרה-קליני של כאב ראש
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mason, B. N., Avona, A., Lackovic,… More

Mason, B. N., Avona, A., Lackovic, J., Dussor, G. Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache. J. Vis. Exp. (173), e62867, doi:10.3791/62867 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter