Summary
Det mest bemerkelsesverdige symptomet på migrene er alvorlig hodesmerter, og det er hypoteset at dette formidles av sensoriske nevroner som innerver meningene. Her presenterer vi en metode for å lokalt bruke stoffer på dura på en minimalt invasiv måte mens du bruker ansiktsoverfølsomhet som utgang.
Abstract
Kranial meningene, som består av dura mater, arachnoid og pia mater, antas å primært tjene strukturelle funksjoner for nervesystemet. For eksempel beskytter de hjernen mot skallen og forankrer / organiserer den vaskulære og nevronale tilførselen av cortex. Meningene er imidlertid også involvert i nervesystemforstyrrelser som migrene, hvor smerten som oppleves under migrene tilskrives lokal steril betennelse og etterfølgende aktivering av lokale nociceptive afferenter. Av lagene i meningene er dura mater av spesiell interesse for patofysiologien til migrene. Det er svært vaskulært, har lokale nociceptive nevroner, og er hjem til et mangfoldig utvalg av beboerceller som immunceller. Subtile endringer i det lokale meningeale mikromiljøet kan føre til aktivering og sensibilisering av durale perivascular nociceptorer, og dermed føre til migrenesmerter. Studier har forsøkt å adressere hvordan durale afferenter blir aktivert/sensibilisert ved å bruke enten in vivo elektrofysiologi, avbildningsteknikker eller atferdsmodeller, men disse krever ofte svært invasive operasjoner. Denne protokollen presenterer en metode for relativt ikke-invasiv påføring av forbindelser på dura mater hos mus og en passende metode for å måle hodepinelignende taktil følsomhet ved hjelp av periorbital von Frey-testing etter dural stimulering. Denne metoden opprettholder integriteten til dura og skallen og reduserer forvirrende effekter fra invasive teknikker ved å injisere stoffer gjennom en 0,65 mm modifisert kanyle ved krysset mellom ufusterte skytten og lambdoid suturer. Denne prekliniske modellen vil tillate forskere å undersøke et bredt spekter av durale stimuli og deres rolle i den patologiske progresjonen av migrene, for eksempel nociceptoraktivering, immuncelleaktivering, vaskulære endringer og smerteatferd, samtidig som de opprettholder skadefrie forhold til skallen og meningene.
Introduction
Migrenesmerter er fortsatt et stort folkehelseproblem over hele verden. Verdens helseorganisasjon rangerer den som den sjette mest utbredte sykdommen i verden, og rammer i underkant av 15% av jordens befolkning1 og forårsaker en betydelig sosioøkonomisk byrde på samfunnet 2,3. Behandlingsalternativer og deres effekt har vært suboptimale og gir bare symptomatisk lindring og endrer ikke signifikant patofysiologiske hendelser som underfinerer migreneforekomst 4,5. Mangelen på behandlingssuksess skyldes sannsynligvis at migrene er en multifaktoriell lidelse hvis patologi er dårlig forstått, noe som fører til et begrenset antall terapeutiske mål. Migrene er også utfordrende å fange fullt ut i dyremodeller, spesielt gitt at migrenediagnose er laget basert på verbal kommunikasjon med pasienter som beskriver deres erfaring med migrene kjennetegn som aura, hodepine, fotofobi og allodynia. Til tross er det viktig å merke seg at nylige fremskritt innen migrenebehandlinger for tiden overgår behandlinger for mange nevrologiske forhold som har blitt godt validert av prekliniske modeller. For eksempel har monoklonale antistoffer og små molekyler som retter seg mot calcitonin genrelatert peptid, eller reseptoren vært svært vellykket i å forbedre livskvaliteten til migrene lider og kan potensielt transformere den kliniske behandlingen av migrene. Selv om det har vært fremskritt i å forstå denne lidelsen, er det fortsatt mye som ennå ikke er belyst.
Basert på prekliniske dyremodeller og menneskelige studier, er det allment akseptert at migrene hodepine er initiert av avvikende aktivering av nociceptive fibre innenfor meningene som signaliserer gjennom trigeminal og øvre Cervical dorsal-root ganglia 6,7,8,9,10. Til tross for denne teorien bruker mange studier fortsatt systemisk administrering av legemidler for å forstå underliggende medvirkende mekanismer i migrene. Selv om systemisk dosering av legemidler har styrket vår forståelse betydelig, vurderer ikke disse funnene direkte om lokale handlinger innenfor målvevet av interesse spiller en rolle i migrene. Omvendt har flere studier tatt en tilnærming for å stimulere dura; Imidlertid krever disse eksperimentene kanyleimplantasjon via en invasiv kraniotomi og utvidede gjenopprettingstider11,12. På grunn av disse begrensningene utviklet vi en minimalt invasiv tilnærming til lokalt å stimulere dura der mangelen på kraniotomi eliminerer postkirurgisk utvinning og muliggjør umiddelbar testing hos våken dyr 12,13,14. Disse injeksjonene utføres under lett isofluranbedøvelse og administreres ved krysset mellom sagittale og lambdoid suturer hos mus.
Flere tilnærminger er utviklet for å evaluere nociceptive atferdsresponser hos gnagere15. Kutan allodynia har blitt rapportert hos omtrent 80% av migrene lider16,17 og representerer et potensielt translasjonelt endepunkt for bruk hos gnagere. I prekliniske modeller har anvendelsen av von Frey filamenter til plantarområdet til gnagerpoten blitt brukt til å vurdere smerteadferd i prekliniske migrenemodeller. Den primære begrensningen i denne tilnærmingen er at den ikke tester cephalic-regionen. Ansikts grimase scoring har blitt brukt til å fange smerte atferd hos gnagere ved å analysere ansiktsuttrykk etter induksjon av smerte stimuli18,19. Begrensningene inkluderer imidlertid bare å fange opp svar på akutte stimuli og ikke kroniske orofaciale smertetilstander. Ansiktspleie og redusert oppdrett betraktes også som utganger av atferdsresponser i prekliniske modeller av migrene20,21. Begrensninger i førstnevnte inkluderer vanskeligheter med å differensiere smerteresponser fra normal rutinemessig grooming og andre opplevelser som kløe. Når det gjelder sistnevnte, reduseres oppdrettsatferden vanligvis raskt etter innføring av gnagere til nye miljøer. Selv om hvert av disse atferdsmessige endepunktene er verdifullt i forståelsen av ulike mekanismer som bidrar til smertetilstander, er det et kritisk behov for prekliniske modeller av smerteforstyrrelser som migrene for å inkludere endepunkter som spesifikt fanger opp cephalic overfølsomhetsresponser. Vurdering av taktil overfølsomhet i periorbital hud etter dural stimulering er en metode som kan gi bedre innsikt i mekanismer som bidrar til migrene der sensoriske symptomer hovedsakelig er cephalic i naturen. Her beskriver vi en metode for å administrere stoffer på museduraen som en preklinisk modell av migrene. Etter duralapplikasjonen presenterer vi også en detaljert metode for testing av periorbital taktil overfølsomhet ved hjelp av kalibrerte von Frey-filamenter som brukes i Dixon-opp-ned-metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført med forhåndsgodkjenning av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen ved University of Texas i Dallas. ICR(CD-1) (30-35 g) og C57/BL6 (25-30 g) mus i alderen 6-8 uker ble brukt i denne studien.
1. Dural infuser
- Lag musens infusatorer/injektorer ved å modifisere en kommersielt tilgjengelig intern kanyle og infuser for ensidige injeksjoner med en ikke-metallisk smeltet silikaplasthette som kan justeres og settes inn i/strekker seg under en 28 G føringskanyle med indre diameter (I.D.) på 0,18 mm og en ytre diameter (O.D.) på 0,35 mm (figur 1A).
- Bruk en kaliper eller annen måleenhet for å justere den smeltede silikaplasthetten på infuseren til en lengde på 0, 6 mm; målt fra spissen av infuseren til kanten av silikaplasthetten.
- Vær forsiktig så du ikke bøyer eller sløver infuseren når du justerer plasthetten.
- For andre musestammer som ikke tidligere har blitt brukt til duralinjeksjoner, bestem den optimale infuserlengden ved å sette lengden til 0,6 mm og gjennomføre pilotinjeksjoner med blekk eller fargestoff, justere infuserlengden til det er observert at fargestoffet bare er i dura mater og ikke på hjernen eller skallen.
- Fest den lange enden (eller enden som ikke ble målt til å være 0,6 mm) av den justerte infuseren til plastrør (pumperør, 2-stopp, I.D. 0,19 mm, lengde 406 mm).
- Klipp slangen til en minimumslengde på 8 i for å sikre at det er tilstrekkelig linje til å holde et volum på 5 μL.
- Pass på at slangen dekker metalldelen og toppen av plastproppen som er plassert på infuseren. Dette vil bidra til å forhindre at luftbobler akkumuleres i linjen.
- Fest den andre enden av slangen til en 10 μL glassmikrosyring (gasstett, sementert nål; 21 G med en 10 mm projeksjon), igjen, og sørg for å ha en tett forsegling over metalldelen av sprøyten (figur 1A).
- Når linjen er koblet til, fyll sprøyten på nytt med 5 μL fosfatbufret saltvann (PBS), syntetisk interstitiell væske (SIF) eller andre kjøretøyer du velger for å forhindre at luftbobler dannes.
- Hvis luftbobler observeres i linjen, oversvømme linjen med kjøretøyet til boblene har forsvunnet.
MERK: Det kan hjelpe å fylle sprøyten med kjøretøyet før du fester den til linjen og deretter skyve væsken gjennom linjen når den er tilkoblet.
- Hvis luftbobler observeres i linjen, oversvømme linjen med kjøretøyet til boblene har forsvunnet.
- Etter at linjen er fylt på nytt med 5 μL av kjøretøyet og fungerer effektivt, last 5 μL av legemidlet / løsningen inn i Hamilton-sprøyten (blekk eller fargestoff kan brukes som et alternativ til stoffet / løsningen hvis du lærer eller praktiserer denne teknikken).
- Sørg for at alle kjøretøyløsninger som administreres på duraen opprettholdes ved pH 7.4 og måles til en osmolalitet på 310. Dette reduserer den potensielle aktiveringen av syre-sensing ion kanaler og andre osmosensitive kanaler i dura.
- Det maksimale volumet som ble testet hos mus som ikke forårsaket lekkasje i hjernen, er omtrent 10 μL. Atferdseffektene etter injeksjoner med dette volumet er ikke testet. Av denne grunn, administrer bare 5 μL av løsningen på dura.
MERK: Disse observasjonene er basert på musestammene/alderen/vektene til 6-8 uker gamle CD1/ICR-mus.
2. Dural injeksjoner
- Når sprøyten er klargjort og stoffet er lastet, plasser en mus flatt på magen og bedøv den under kort 3% isofluran med en oksygenstrømningshastighet på 0,5-1 l / min via nosecone.
- Etter at musen ikke lenger viser en klype refleks, juster anestesi og opprettholde den på en 1,5% isofluran.
- Når du er bedøvet, bruk steril opthalmisk salve på øynene og barber dyrets hode, og desinfiser deretter huden med povidon-jod og etanol. Etter dette, komme i en posisjon som bidrar til en vellykket injeksjon.
- Bruk den ene hånden til å stabilisere dyrets hode og hold infuseren med den andre hånden.
- Sonde forsiktig og finn krysset mellom sagittale og lambdoidale suturer på musens skalle (figur 1B, C).
- For å finne dette diskrete krysset gjennom huden, bruk de topografiske egenskapene til skallen og sonde forsiktig den generelle plasseringen av krysset med infuseren.
- Kontroller posisjonen til krysset ved å plassere infuseren langs skallen og følelsen for den nøyaktige plasseringen.
- Når suturen er plassert og infuseren er på plass, vrir du forsiktig infuseren frem og tilbake til den pierces gjennom huden og faller ned i krysset helt opp til plastproppen.
MERK: Sørg for å sette hele 0,6 mm spissen av infuseren inn i krysset. - For å bekrefte nøyaktigheten, bruk blekk eller fargestoff som en injeksjonsoppløsning og avlive og halshugge musen.
- Fjern hodeskallehetten for å visualisere fargestoffet i dura mater (figur 1C).
MERK: Fargestoff skal ikke observeres på hjernen eller utsiden av skallen. På samme måte bør mus i ethvert eksperiment kontrolleres post-mortem for å verifisere nøyaktigheten av injeksjonen, samt for å sikre at integriteten til dura mater var uskadet.
- Fjern hodeskallehetten for å visualisere fargestoffet i dura mater (figur 1C).
- Etter injeksjonen, fjern musen fra anestesi, vent på at den skal gjenvinne bevisstheten og gå deretter tilbake til buret eller plasser den i et testkammer for å begynne de ønskede analysene.
MERK: La musen komme seg etter anestesi i minst 30 minutter før du utfører atferdseksperimenter.
3. Periorbital von Frey
- Begynn studien med en kohort på ca. 16-20 mus.
- En dagen før habituation, håndtere hver mus i minst 5 min.
- Omtrent 24 timer etter håndtering, habituate musene til testromforholdene og von Frey testapparatet (figur 2A).
MERK: Akryltestapparatet består av individuelle rom med lokk som er omtrent 3 x 3,5 x 5 in (B x H x D) og støttes av aluminiumsstativer koblet til via 0,25 i 19 G firkantet galvanisert stålnettledning.- Plasser musene inne i en horisontalt plassert 4-oz hvitt papirkopp som er luktfri og ikke inneholder polyeten eller parafinvoks.
MERK: Denne typen kopper foretrekkes fordi det reduserer gastrointestinal opprørthet hos musene ved inntak (figur 2B).
- Plasser musene inne i en horisontalt plassert 4-oz hvitt papirkopp som er luktfri og ikke inneholder polyeten eller parafinvoks.
- Mens dyrene er i sine respektive kamre, plasser en pellet av det normale chow-dietten i hvert musekammer for å roe dyrene og unngå unødvendig stress for dyrene. Gjør dette i 3 dager før noen von Frey atferdstesting.
- Forsikre deg om at hver gang musene er i kammeret, at det er tilgang til mat.
- Nummerer og tilordne hvert dyr til samme plass i teststativet. Plasser musen i samme kopp hver dag i testperioden for å sikre at hvert dyr blir akklimatiserte til testmiljøet.
MERK: Mus vil gnave på koppene og deretter ødelegge koppene. Hvis dette skulle skje, bytt ut koppen og merk den med det tilsvarende musenummeret.
- Etter de første 3 dagene med habituation, plasser musene i deres individuelle kamre.
- La dyrene akklimatisere seg til testrommet og kamrene i minst 1 time før von Frey-testing for å la musene roe seg ned og deretter være lettere å teste.
- Etter akklimatisering til rommet på testdagen, fjern en mus mens du fortsatt er i koppen fra sitt respektive kammer.
- Oppretthold koppen i horisontal stilling slik at musen er på både forpaws og bakpoter for å holde vekten jevnt fordelt.
MERK: Ulik vektfordeling kan endre dyrets respons og til og med forhindre at dyr reagerer.
- Oppretthold koppen i horisontal stilling slik at musen er på både forpaws og bakpoter for å holde vekten jevnt fordelt.
- Plasser koppen med musen inni på bordet under teststativet på den absorberende puten.
- For periorbital von Frey testing, plasser 0,07 g von Frey filament direkte i midten av ansiktet og mellom øynene.
- Påfør nok trykk på filamentet til å få von Frey-håret til å bøye seg til en "C" formet formasjon.
- Oppretthold kontakt med regionen minst 3 s, men ikke mer enn 5 s eller til musen trekker hodet og sveiper på filamentet med poten.
MERK: Hvis filamentet glir eller mer enn spissen av filamentet berører dyret under testing, bør eventuelle svar ikke telles. Disse svarene kan være som svar på børsten som aktiveres av forskjellige mekanoreceptorer og derfor kanskje ikke gjenspeiler nøyaktige resultater. - Påfør von Frey filaments i henhold til Dixon "opp-ned" metoden22,23.
- I utgangspunktet, bruk von Frey filament som har en vekt på 0,07 g. Lavest mulig filament og høyest testet filament i denne studien er filamenter med vekter på henholdsvis 0,008 g og 0,6 g.
- Bruk filamentene av vekt 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g og 0,6 g for å utføre denne analysen.
- I denne metoden, hvis et dyr ikke viser et svar på filamentet, bruk filamentet til neste høyere gramvekt.
- Hvis musen reagerer på et filament, bør du vurdere at musen reagerer på den filamentet. Hvis dette er tilfelle, bruk filamentet til neste lavere gramvekt.
- Gjenta dette mønsteret til dyret er testet 4 ganger etter den første responsen, eller dyret er fast bestemt på å ikke svare på noen filamenter testet i analysen.
MERK: Avstå fra å påføre ekstra trykk som stammer fra armen eller håndleddet. En skala kan brukes til å praktisere anvendelsen av filamentet.
- Oppretthold kontakt med regionen minst 3 s, men ikke mer enn 5 s eller til musen trekker hodet og sveiper på filamentet med poten.
4. Testing for baseline uttaksterskler
- Før de inkluderes i et eksperiment, må du sørge for at musene når en baseline abstinensterskel mellom 0,5-0,6 g.
- En mus når grunnlinjen hvis de ikke svarer på filamenttestet i serien som er nevnt i trinn 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g og 0,6 g).
- Test mus daglig når du etablerer baseline uttaksterskler.
- Testing gjør at dyr kan akklimatisere seg til testforholdene og trykket til von Frey-filamentene.
- Hvis musene fortsatt er ekstremt overfølsomme etter den tredje testdagen, kan du prøve å vente 1 eller 2 dager før du tester igjen.
MERK: For mye tid mellom testdager kan føre til at dyret ikke klarer å tilpasse seg vekten av filamentet på periorbitalområdet, og dermed ikke når den målrettede uttaksterskelen.
- Test mus i ca 7 dager før du bestemmer hvilke dyr som ikke oppfyller inklusjonskriteriene for et eksperiment.
MERK: Omtrent 70 % av musene vil nå det målrettede baseline-nivået.- Før dural stimulering analyserer du grunnlinjedataene for å utelate mus som ikke har nådd en grunnlinjeverdi på 0,5-0,6 gram eller høyere.
- Etter utelukkelse tildeler du hver gjenværende mus tilfeldig til en testgruppe. Oppnå dette ved å tegne ut av en kopp eller skrive et skript på et regneark for å randomisere tall til en gruppe.
5. Analyse av von Frey resultater
- Når serien med svar er oppnådd, bestem deltaet, k-verdien, 50% terskelen og uttaksterskelen i gram i henhold til tidligere publiserte metoder24.
- Beregn uttaksterskelen ved hjelp av denne formelen WT = 10(x * F + B), der WT = uttaksterskel, F = poteuttaksterskel beregnet via Chaplan-metoden, og B = lineær regresjon av logg (bøyekraft) = x * Filamentnummer + B.
- Plott dataene som enten 50% uttaksterskel eller gjennomsnittlig uttaksterskel i gram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne injeksjonsmetoden brukes til å administrere stimuli på musens dura slik at etterfølgende atferdstesting kan oppstå. Den vanligste atferdseffekten målt med denne modellen er kutan ansiktsoverfølsomhet vurdert via von Frey 12,13,14. Her viser vi hvordan denne modellen kan brukes til å vurdere potensielle kjønnsspesifikke bidrag til migrenepatologi (figur 3).
Denne prosedyren har blitt brukt til å undersøke effekten av dural prolaktin (PRL) på mekanisk fremkalt ansiktsoverfølsomhet14 (figur 3). Resultatene av denne studien viste at kvinnelige ICR-mus viser betydelig reduserte ansiktsavvenningsterskler som svar på 5 μg dural prolaktin (figur 3A). En ti ganger lavere dose på 0,5 μg prolaktin (PRL) viste også svar som ligner på høy dose PRL (figur 3B).
Disse injeksjonene har også vist seg å produsere spontan smerterelatert atferd vurdert via grimase. Dural 0,5 μg PRL forårsaket betydelig grimasering hos kvinnelige mus (figur 3C), noe som ytterligere viste en klar rolle for dural PRL i kvinnelig migrenelignende oppførsel. Vi utførte grimaseanalyser før alle tester med von Frey filaments.
Figur 1: Dural infuser og injeksjonsplassering. (A) Injektorene/infusatorene består av en modifisert kanyle justert til lengden på ~ 0,5 mm- 0,65 mm og festet til en nål sementert på en 10 μL gasstett sprøyte via tygonrør. (B) Flyfoto av markert injeksjonsstedsplassering på musens hode. (C) (Venstre panel) Diagram over plasseringen av duralinjeksjonen. Plassering av injeksjonen er på krysset mellom lambdoid og sagittal suturer på ca 4,8 mm bakre til bregma. (Midtre panel) Post-mortem flyfoto av en museskalle etter dural injeksjon av 5 μL blå injeksjon fargestoff. (Høyre panel) Separasjon av musens hodeskalle fra hjernen. Det var ingen observerbar lekkasje av blått injeksjonsfargestoff på hjernen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: von Frey Test chambers. (A) von Frey testkammer bestående av 3,5 x 3,5 i individuelle akrylkamre med lokk plassert på et nettingstativ. Disse er koblet via kolonner på 10 kamre organisert i 2 rader. (B) Eksempel på mus i deres individuelle kopper plassert inne i von Frey testkamre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dural påføring av prolaktin induserer atferdsresponser hos mus. Mekaniske abstinensterskler ble vurdert etter dural anvendelse av PRL (5 μg eller 0,5 μg) hos kvinnelige mus. (A) Anvendelse av 5 μg PRL (n = 7 PRL, n = 6 kjøretøy) indusert ansiktsoverfølsomhet sammenlignet med kjøretøyet. (B) Påføring av 0,5 μg PRL (n = 5 PRL, n = 4 kjøretøy) indusert langvarig ansiktsoverfølsomhet. (C) Grimace ble også vurdert hos de samme musene som ble behandlet med 0,5 μg PRL ved hvert tidspunkt. Disse musene viste betydelig høyere grimase score sammenlignet med musene behandlet med kjøretøy. Statistikk: Toveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni multippel sammenligning post-hoc analyse. Data representeres som ± SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Maladaptive endringer i det lokale nociceptive systemet i dura regnes som en viktig bidragsyter til hodepinefasen av migreneangrep til tross for mangel på vevsskade 25,26. Her presenterer studien en metode der minimal invasiv stimulering av dura kan indusere ansikts taktil overfølsomhet. Å belyse mekanismene og hendelsene som er involvert i dural nociceptoraktivering uten å forårsake skade på kraniet og vevet, kan mer nøyaktig reflektere migrenemekanismer i en preklinisk modell.
Kraniotomi og kanyleimplantasjon har lenge vært brukt til å vurdere funksjoner og mekanismer som bidrar til migrenesmerter 11,12. Det har imidlertid blitt rapportert at en kraniotomi kan indusere aktivering av dural mastceller og øke pialvaskulær permeabilitet hos gnagere27. Gitt at mastcelleaktivering i dura er svært implisert i migrene 7,8,28,29, har denne teknikken store forbehold som kan forskyve tolkningen. Administrering av stoffer gjennom krysset mellom sagittale og lambdoidale suturer reduserer effektivt aktiveringen av nociceptorer formidlet av kraniotomiindusert mastcelleaktivering. Videre krever ikke-invasiv dural stimulering ikke postkirurgisk gjenoppretting og administrering av smertestillende midler som kan endre tolkningen av resultatene. Lokal anvendelse av stoffer på dura gjør det mulig for forskere å fokusere på dette spesifikke målvevet, i motsetning til systemisk administrering av legemidler der handlingsstedet ikke lett bestemmes 12,13,14. Mens systemisk administrering av stoffer som nitroglyserin og calcitonin genrelatert peptid utløser eksperimentelle angrep hos mennesker som ligner migrene, tillater de ikke vurdering av handlingsstedet i gnagermodeller; mer målrettede vevsspesifikke modeller tilbyr en alternativ tilnærming.
Denne teknikken beskrevet her innebærer å injisere et stoff eller annen løsning direkte på dura mater av meningene gjennom krysset der sagittal og lambdoidal suturer av skallen møtes. For best resultat bør ICR-mus (CD-1) eller C57/BL6 i alderen 6-8 uker brukes til disse eksperimentene. Yngre mus kan brukes; Imidlertid anbefales ikke bruk av ICR (CD-1) mus som er eldre enn 8 uker, da deres hodeskalleplate suturer vanligvis er helt smeltet sammen av denne alderen, noe som gjør det umulig å injisere uten å skade skallen. Det er også viktig å vurdere vekten / størrelsen på hver mus som vil gjennomgå denne prosedyren. Det anbefales at disse injeksjonene utføres på dyr som har en vekt større enn 19 g, da skallen vanligvis er veldig tynn ved lavere vekter og kanskje ikke tåler trykket som påføres under injeksjonen. Av betydning er det også sannsynlige faktorer som bidrar til alder / vekt der hodeskalleplatefusjon oppstår (f.eks. sammensetningen av lab chow som brukes i dyreanlegg). Derfor kan det hende at eksperimentere må bestemme alder/vekt-området som passer under egne forhold. Ulike aldersgrupper og dyrevekter kan være nødvendig for andre musestammer eller genotyper, avhengig av når skalleplatene smelter sammen i disse dyrene, og kan også kreve optimalisering av selve injeksjonen.
Når du lærer eller praktiserer denne teknikken, anbefales det på det sterkeste at et nivå av komfort oppnås ved å finne suturkrysset i euthanized mus. Det kan være best å først øve med hodebunnen utskilt eller skrelt tilbake i disse musene og sakte gå videre til å finne krysset gjennom huden. Når du har fastslått den nøyaktige plasseringen, kan blekk og fargestoffer injiseres i dura for å verifisere posisjonsnøyaktighet og dybde på injeksjonen. Denne teknikken ble utviklet og optimalisert ved hjelp av ICR (CD-1) mus (30-35 g) og C57/BL6 mus (25-30 g). En infuserlengde på 0,5-0,6 mm er tilstrekkelig til å injisere en mus som veier innenfor området 25-35 g. Imidlertid kan lengden på infuseren måtte kalibreres hvis injisering av mus som er vesentlig forskjellig fra musene som brukes til å optimalisere denne teknikken. For eksempel vil en mus mindre enn 25 g sannsynligvis resultere i bruk av en infuser som har en lengde mindre enn 0, 5 mm. Ved mestring av denne teknikken og når den utføres i alderstilpassede mus, kan suksessraten for denne injeksjonen være nær 100%; Komplikasjoner med injeksjonen kan imidlertid skyldes problemer som å bryte skallen på grunn av å bruke for mye kraft til å sette inn infuseren, samt unormal blødning forårsaket av skadelige meningeale blodårer.
Endringer i taktil følsomhet er en viktig måling når man vurderer smerteatferd hos gnagere. Her demonstrerer vi bruken av periorbital von Frey-testing for å vurdere disse atferdene i en preklinisk migrenemodell. En stor fordel med å bruke denne teknikken i migrenemodeller er at vi kan vurdere overfølsomhet i hodet, som har mer relevans enn andre ikke-kraniale steder som poter. Det kritiske trinnet for å sikre reproduserbare resultater er å sørge for at musene er helt baselined. Dette vil kreve en godt trent eksperiment som kan bruke von Frey filaments nettopp. Det er sannsynlig at det vil ta ca 7 dager for et dyr å nå baseline. Det er imidlertid mulig at ikke alle dyr vil nå den målrettede grunnlinjen. Etter vår erfaring, etter ca 7 dager med arbeid med mus, vil bare 60% -70% av dyrene nå en basislinje på 0,6 g i periorbitalområdet, men dette er avhengig av dyrenes kohort. Denne timingen bør vurderes før du begynner et eksperiment for å sikre at tilstrekkelige tall brukes til å ta hensyn til frafall, og at dyr er riktig alder etter baseline for å bruke denne ikke-invasive metoden for å stimulere dura. Trinnene for å bestemme en opprinnelig plan er beskrevet i protokolldel 4.
En begrensning ved von Frey-testing er at det kan være vanskelig å skille mellom smerteresponser og rutinemessig pleie/kløe. For å skille smerte fra grooming, er det viktig å legge merke til hvor lenge denne oppførselen oppstår. Vanligvis er en smerterespons ett sveip etter filamentapplikasjonen, mens grooming atferd har en tendens til å være langvarig og kan vare i flere sekunder til minutter. Hvis pleie/kløe ikke kan skilles fra en overfølsom respons, er det best å ikke registrere dette som et svar. I tillegg kan feil filamentplassering (f.eks. filamentglidning) føre til langvarig grooming av dyret, noe som gjør det vanskelig å teste riktig. Hvis dette skjer, bør eksperimentet vente til grooming har stoppet og musen er rolig nok til å teste. Fortsett fra den samme filamentet som ble brukt før begynnelsen av grooming-oppførselen. Hvis musen fortsetter i svært lang tid, plasser musen tilbake i testkammeret i ca. 5 minutter. Når 5 min har gått, kan du prøve å teste musen igjen. Hvis denne oppførselen fortsetter uten løsning, må musene fjernes fra studien. Av betydning anbefales det ikke å barbere pelsen i ansiktet, da det er uklart om musehuden beholder samme følsomhet etter at håret er fjernet, og prosessen med hårfjerning (barbering, depilatoriske kremer) kan også påvirke hudens følsomhet.
I de fleste situasjoner er det ideelt for administrering av stoffer på dura ikke mer enn 24 timer etter at musen har nådd baseline. Det anbefales at mus blir utsatt for von Frey filament testing en gang i timen. Hvis det er mulig, gir testing annenhver time nok tid til at dyrene kan roe seg ned etter testing. I tillegg bør eksperimenter tidsavganger for ikke å forstyrre deres sirkadiske mønstre. Endringer i døgnrytmen hos mus kan endre atferdsfenotyper og til slutt resultere i uopprettelige resultater.
Periorbital von Frey-testing kan brukes i kombinasjon med andre atferdsanalyser for å styrke eksperimentelle konklusjoner. Grimaseskalaen er avhengig av spontane ansiktsuttrykk hos gnagere i stedet for fremkalte svar18,19. Denne metoden har høy nøyaktighet og pålitelighet ved vurdering og kvantifisering av akutt smerteatferd og har blitt brukt i mange prekliniske modeller av migrene12,30. Når du bruker både grimace og periorbital von Frey-analyser, bør eksperimentet vurdere å score for grimace før påføring av von Frey filamenter til musens periorbitale region. Dette sikrer at grimaserende oppførsel er spontan og ikke fremkalt av filamentapplikasjon. Hindpaw mekanisk overfølsomhet kan også brukes i forbindelse med periorbital von Frey testing. I motsetning til grimace scoring, er det best å teste ansiktsoverfølsomhet før du vurderer bakre pote overfølsomhet. Hindpaw testing krever at musen er plassert tilbake i kammeret uten koppen etter periorbital von Frey testing er fullført.
Til slutt legger periorbital von Frey-testing og ikke-invasiv dural stimulering hos mus til verdifulle alternativer til det nåværende spekteret av prekliniske modeller av migrene. Når den utføres riktig, presenterer denne teknikken en raffinert tilnærming til å generere en hodepinelignende fenotype hos gnagere, da det ikke krever kirurgisk implantasjon av en kanyle. Hos rotter er kanyler utsatt for bakteriell infeksjon, kan bli tilstoppet, kan falle av og kreve at hvert dyr skal være enkelthus, noe som skaper unødvendig stress på dyret. Videre kan duralstimuleringsprotokollen enkelt endres til bruk med flere legemiddelapplikasjoner. Periorbital von Frey testparadigmer kan også modifiseres for å passe best mulig til de eksperimentelle spesifikasjonene. I tillegg kan periorbital von Frey-testing brukes i andre orofaciale smerteforstyrrelser. Disse teknikkene er et viktig verktøy for å forstå de komplekse underliggende mekanismene for migrenesmerter ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NS104200 og NS072204 til GD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 oz Hot Paper Cups | Choice Paper Company | 5004W | https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html |
| Absorbent Underpads | Fisherbrand | 14-206-65 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048 |
| C313I/SPC Internal 28 G cannula | P1 Technologies (formerly Plastics One) | 8IC313ISPCXC | I.D. 18 mm, O.D. 35 mm |
| Gastight Model 1701 SN Syringes | Hamilton | 80008 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008 |
| Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm | Cole-Palmer | EW-96460-10 | https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010 |
| Stand with chicken wire | Custom | The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge | |
| Testing Rack with individual Chambers | Custom | Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup. | |
| von Frey Filaments | Touch test/Stoelting | 58011 | https://www.stoeltingco.com/touch-test.html |
References
- GBD 2016 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Woldeamanuel, Y. W., Cowan, R. P. Migraine affects 1 in 10 people worldwide featuring recent rise: A systematic review and meta-analysis of community-based studies involving 6 million participants. Journal of the Neurological Sciences. 372, 307-315 (2017).
- Burch, R. C., Loder, S., Loder, E., Smitherman, T. A. The prevalence and burden of migraine and severe headache in the United States: updated statistics from government health surveillance studies. Headache. 55 (1), 21-34 (2015).
- Ashina, M.
- Ashina, M., et al. Migraine: integrated approaches to clinical management and emerging treatments. Lancet. 397 (10283), 1505-1518 (2021).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: Moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
- Koyuncu Irmak, D., Kilinc, E., Tore, F. Shared Fate of Meningeal Mast Cells and Sensory Neurons in Migraine. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 136 (2019).
- Levy, D. Migraine pain, meningeal inflammation, and mast cells. Current Pain and Headache Reports. 13 (3), 237-240 (2009).
- Levy, D., Labastida-Ramirez, A., MaassenVanDenBrink, A. Current understanding of meningeal and cerebral vascular function underlying migraine headache. Cephalalgia. 39 (13), 1606-1622 (2019).
- Phebus, L. A., Johnson, K. W. Dural inflammation model of migraine pain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
- Fried, N. T., Maxwell, C. R., Elliott, M. B., Oshinsky, M. L. Region-specific disruption of the blood-brain barrier following repeated inflammatory dural stimulation in a rat model of chronic trigeminal allodynia. Cephalalgia. 38 (4), 674-689 (2018).
- Avona, A., et al. Dural calcitonin gene-related peptide produces female-specific responses in rodent migraine models. The Journal of Neuroscience. 39 (22), 4323-4331 (2019).
- Burgos-Vega, C. C., et al. Non-invasive dural stimulation in mice: A novel preclinical model of migraine. Cephalalgia. 39 (1), 123-134 (2019).
- Avona, A., et al. Meningeal CGRP-Prolactin interaction evokes female-specific migraine behavior. Annals of Neurology. 89 (6), 1129-1144 (2021).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Lipton, R. B., et al.
- Goadsby, P. J. Migraine, allodynia, sensitisation and all of that. European Neurology. 53, Suppl 1 10-16 (2005).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
- Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 11 (2019).
- Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central CGRP mechanisms. The journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
- Dixon, W. J., Mood, A. M. A method for obtaining and analyzing sensitivity data. The Journal of the American Statistical Association. 43 (241), 109-126 (1948).
- Dixon, W. The up-and-down method for small samples. The Journal of the American Statistical Association. 60, (1965).
- Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Molecular Pain. 10, 26 (2014).
- Ramachandran, R. Neurogenic inflammation and its role in migraine. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 301-314 (2018).
- Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K. Does inflammation have a role in migraine. Nature Reviews Neurology. 15 (8), 483-490 (2019).
- Stokely, M. E., Orr, E. L. Acute effects of calvarial damage on dural mast cells, pial vascular permeability, and cerebral cortical histamine levels in rats and mice. Journal of Neurotrauma. 25 (1), 52-61 (2008).
- Theoharides, T. C., Donelan, J., Kandere-Grzybowska, K., Konstantinidou, A. The role of mast cells in migraine pathophysiology. Brain Research Reviews. 49 (1), 65-76 (2005).
- Conti, P., et al. Progression in migraine: Role of mast cells and pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. European Journal of Pharmacology. 844, 87-94 (2019).
- Rea, B. J., et al. Peripherally administered calcitonin gene-related peptide induces spontaneous pain in mice: implications for migraine. Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).
