Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Дуральная стимуляция и периорбитальное тестирование фон Фрея на мышах как доклиническая модель головной боли

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

Наиболее заметным симптомом мигрени является сильная головная боль, и предполагается, что это опосредовано сенсорными нейронами, иннервирующими мозговые оболочки. Здесь мы представляем метод локального нанесения веществ на твердую мозговую оболочку минимально инвазивным способом, используя гиперчувствительность лица в качестве выхода.

Abstract

Считается, что черепные мозговые оболочки, состоящие из твердой мозговой оболочки, арахноидальной и пиа-матер, в первую очередь выполняют структурные функции для нервной системы. Например, они защищают мозг от черепа и закрепляют/организуют сосудистое и нейронное снабжение коры. Тем не менее, мозговые оболочки также участвуют в расстройствах нервной системы, таких как мигрень, где боль, испытываемая во время мигрени, приписывается местному стерильному воспалению и последующей активации местных ноцицептивных афферентов. Из слоев в мозговых оболочках твердые мозги представляют особый интерес в патофизиологии мигрени. Он сильно васкуляризирован, содержит местные ноцицептивные нейроны и является домом для разнообразного массива резидентных клеток, таких как иммунные клетки. Тонкие изменения в местном менингеальном микроокружении могут привести к активации и сенсибилизации дуральных периваскулярных ноцицепторов, что приводит к мигрени. Исследования были направлены на то, чтобы выяснить, как дуральные афференты активируются / сенсибилизируются с использованием электрофизиологии in vivo, методов визуализации или поведенческих моделей, но они обычно требуют очень инвазивных операций. В этом протоколе представлен метод сравнительно неинвазивного применения соединений на твердой мозговой оболочке у мышей и подходящий метод измерения головной боли подобной тактильной чувствительности с использованием периорбитального тестирования фон Фрея после дуральной стимуляции. Этот метод поддерживает целостность твердой мозговой оболочки и черепа и уменьшает смешанные эффекты от инвазивных методов путем введения веществ через модифицированную канюлю 0,65 мм в месте соединения несросшихся сагиттальных и лямбдовидных швов. Эта доклиническая модель позволит исследователям исследовать широкий спектр дуральных стимулов и их роль в патологическом прогрессировании мигрени, таких как активация ноцицепторов, активация иммунных клеток, сосудистые изменения и болевое поведение, сохраняя при этом безвредные состояния черепа и мозговых оболочек.

Introduction

Боль при мигрени остается серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. Всемирная организация здравоохранения оценивает его как шестое наиболее распространенное заболевание в мире, поражающее чуть менее 15% населения Земли1 и вызывающее существенное социально-экономическое бремя для общества 2,3. Варианты лечения и их эффективность были неоптимальными и обеспечивают только симптоматическое облегчение и существенно не изменяют патофизиологические события, которые вызывают возникновение мигрени 4,5. Отсутствие успеха лечения, вероятно, связано с тем, что мигрень является многофакторным расстройством, патология которого плохо изучена, что приводит к ограниченному числу терапевтических целей. Мигрень также сложно полностью уловить на животных моделях, особенно учитывая, что диагноз мигрени ставится на основе вербального общения с пациентами, которые описывают свой опыт с признаками мигрени, такими как аура, головная боль, светобоязнь и аллодиния. Несмотря на это, важно отметить, что последние достижения в лечении мигрени в настоящее время превосходят методы лечения многих неврологических состояний, которые были хорошо подтверждены доклиническими моделями. Например, моноклональные антитела и небольшие молекулы, которые нацелены на пептид, связанный с геном кальцитонина, или его рецептор были очень успешными в улучшении качества жизни страдающих мигренью и потенциально могут трансформировать клиническое ведение мигрени. Несмотря на то, что в понимании этого расстройства был достигнут прогресс, многое еще предстоит выяснить.

Основываясь на доклинических моделях на животных и исследованиях на людях, широко признано, что головные боли мигрени инициируются аберрантной активацией ноцицептивных волокон в мозговых оболочках, которые сигнализируют через тройничные и верхние шейные дорсальные ганглии 6,7,8,9,10. Несмотря на эту теорию, многие исследования по-прежнему используют системное введение лекарств для понимания основных механизмов, способствующих мигрени. Хотя системная дозировка лекарств существенно укрепила наше понимание, эти результаты напрямую не оценивают, играют ли местные действия в целевой ткани, представляющей интерес, роль в мигрени. И наоборот, в нескольких исследованиях использовался подход к стимуляции твердой мозговой оболочки; однако эти эксперименты требуют имплантации канюли с помощью инвазивной трепанации черепа и длительного времени восстановления11,12. Из-за этих ограничений мы разработали минимально инвазивный подход к местной стимуляции твердой мозговой оболочки, где отсутствие трепанации черепа исключает послеоперационное восстановление и позволяет проводить немедленное тестирование на бодрствующих животных 12,13,14. Эти инъекции выполняются под легким изофлурановым наркозом и вводятся в месте соединения сагиттального и лямбдовидного швов у мышей.

Было разработано несколько подходов для оценки ноцицептивных поведенческих реакций у грызунов15. Кожная аллодиния была зарегистрирована примерно у 80% страдающих мигренью16,17 и представляет собой потенциальную трансляционную конечную точку для использования у грызунов. В доклинических моделях применение нитей фон Фрея к подошвенной области лапы грызуна использовалось для оценки болевого поведения в доклинических моделях мигрени. Основным ограничением этого подхода является то, что он не тестирует головную область. Оценка лицевой гримасы использовалась для выявления болевого поведения у грызунов путем анализа выражений лица после индукции болевых стимулов18,19. Тем не менее, его ограничения включают только захват реакций на острые раздражители, а не хронические орофациальные болевые состояния. Уход за лицом и снижение выращивания также считаются результатами поведенческих реакций в доклинических моделях мигрени20,21. Ограничения первого включают трудности в дифференциации болевых реакций от обычного рутинного ухода и других ощущений, таких как зуд. В последнем случае поведение при выращивании обычно быстро снижается после введения грызунов в новые среды. Хотя каждая из этих поведенческих конечных точек ценна для понимания различных механизмов, которые способствуют болевым состояниям, существует острая необходимость в доклинических моделях болевых расстройств, таких как мигрень, для включения конечных точек, которые конкретно фиксируют реакции цефальной гиперчувствительности. Оценка тактильной гиперчувствительности периорбитальной кожи после дуральной стимуляции является методом, который может обеспечить лучшее понимание механизмов, способствующих мигрени, где сенсорные симптомы носят преимущественно цефальный характер. Здесь мы описываем метод введения веществ на твердую мозговую оболочку мыши как доклиническую модель мигрени. После применения дюралей мы также представляем подробный метод тестирования периорбитальной тактильной гиперчувствительности с использованием калиброванных нитей фон Фрея, применяемых в методе Диксона вверх-вниз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были проведены с предварительного одобрения институционального Комитета по уходу и использованию животных в Техасском университете в Далласе. В этом исследовании использовались мыши ICR (CD-1) (30-35 г) и C57/BL6 (25-30 г) в возрасте 6-8 недель.

1. Дураловый инфузор

  1. Создайте мышиные инфузоры/инжекторы, модифицировав коммерчески доступную внутреннюю канюлю и инфузор для односторонних инъекций с неметаллическим плавленым кварцевым пластиковым колпачком, который регулируется и вставляется в/простирается ниже направляющей канюли 28 Г с внутренним диаметром (I.D.) 0,18 мм и наружным диаметром (O.D.) 0,35 мм (рисунок 1A).
  2. Используйте штангенциркуль или другое измерительное устройство для регулировки расплавленного кремнеземного пластикового колпачка на инфузоре до длины 0,6 мм; измеряется от кончика инфузора до края кремнеземного пластикового колпачка.
    1. Соблюдайте осторожность, чтобы не согнуть и не затупить инфузор при регулировке пластикового колпачка.
    2. Для других штаммов мышей, которые ранее не использовались для инъекций дураля, определите оптимальную длину инфузии, установив длину на 0,6 мм и проведя пилотные инъекции чернилами или красителем, регулируя длину инфузии до тех пор, пока не будет замечено, что краситель находится только в твердой мозговой оболочке, а не на мозге или черепе.
  3. Прикрепите длинный конец (или конец, который не был измерен как 0,6 мм) отрегулированного инфузионного насоса к пластиковой трубке (насосная трубка, 2-ступенчатая, I.D. 0,19 мм, длина 406 мм).
    1. Разрежьте трубку на минимальную длину 8 дюймов, чтобы обеспечить достаточную линию для удержания объема 5 мкл.
    2. Убедитесь, что трубка покрывает металлическую часть и верхнюю часть пластиковой пробки, расположенную на инфузии. Это поможет предотвратить накопление пузырьков воздуха в линии.
  4. Прикрепите другой конец трубки к стеклянному микрошприцу объемом 10 мкл (газонепроницаемый; цементированная игла; 21 г с выступом 10 мм), опять же, убедившись, что над металлической частью шприца есть плотное уплотнение (рисунок 1А).
  5. После соединения линии засыпьте шприц 5 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), синтетической интерстициальной жидкости (SIF) или других транспортных средств по выбору, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.
    1. Если в линии наблюдаются пузырьки воздуха, затопите линию транспортным средством до тех пор, пока пузырьки не рассеются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может помочь заполнить шприц транспортным средством перед его прикреплением к линии, а затем протолкнуть жидкость через линию после подключения.
  6. После того, как линия заполнена 5 мкл транспортного средства и работает эффективно, загрузите 5 мкл лекарственного средства / раствора в шприц Гамильтона (чернила или краситель могут быть использованы в качестве альтернативы препарату / раствору при изучении или практике этой техники).
    1. Убедитесь, что все растворы транспортного средства, вводимые на твердое вещество, поддерживаются при рН 7,4 и измеряются до осмоляльности 310. Это уменьшает потенциальную активацию кислотно-чувствительных ионных каналов и других осмочувствительных каналов в твердой мозговой оболочке.
  7. Максимальный объем, протестированный на мышах, которые не вызывали утечки в мозг, составляет примерно 10 мкл. Поведенческие эффекты после инъекций с таким объемом не тестировались. По этой причине вводят только 5 мкл раствора на твердую мозговую оболочку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти наблюдения основаны на штаммах мышей / возрасте / весе 6-8-недельных мышей CD1 / ICR.

2. Инъекции дуралей

  1. После того, как шприц приготовлен и препарат загружен, поместите мышь на брюшко и обезболите ее под коротким 3% изофлураном со скоростью потока кислорода 0,5-1 л / мин через носовой конус.
    1. После того, как мышь перестанет проявлять рефлекс защемления, отрегулируйте анестезию и поддерживайте ее на уровне 1,5% изофлурана.
  2. После обезболивания нанесите стерильную офтальмологическую мазь на глаза и побрейте голову животного, затем продезинфицируйте кожу повидон-йодом и этанолом. После этого встаньте в положение, способствующее успешной инъекции.
  3. Используйте одну руку, чтобы стабилизировать голову животного, а другой рукой держите инфузию.
  4. Тщательно прощупайте и найдите стык сагиттального и лямбдоидального швов на черепе мыши (рисунок 1B, C).
    1. Чтобы обнаружить это незаметное соединение через кожу, используйте топографические особенности черепа и осторожно прощупайте общее местоположение соединения с инфузией.
    2. Проверьте положение соединения, перепозиционировав инфузию вдоль черепа и почувствовав точное местоположение.
  5. Как только шов будет локализован и инфузия будет на месте, очень медленно и осторожно пошевелите инфузией вперед и назад, пока она не проткнет кожу и не упадет вниз в соединение вплоть до пластиковой пробки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в соединение вставлен весь наконечник инфузора толщиной 0,6 мм.
  6. Чтобы проверить точность, используйте чернила или краситель в качестве инъекционного раствора и усыплитируйте и обезглавливайте мышь.
    1. Снимите крышку черепа, чтобы визуализировать краситель внутри твердой мозговой оболочки (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель не должен наблюдаться на головном мозге или внешней стороне черепа. Аналогичным образом, мыши в любом эксперименте должны быть проверены посмертно, чтобы проверить точность инъекции, а также убедиться, что целостность твердой мозговой оболочки не была повреждена.
  7. После инъекции извлеките мышь из анестезии, подождите, пока она придет в сознание, а затем вернитесь в свою клетку или поместите ее в тестовую камеру, чтобы начать желаемые анализы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позвольте мыши восстановиться после анестезии в течение как минимум 30 минут, прежде чем проводить какие-либо поведенческие эксперименты.

3. Периорбитальный фон Фрей

  1. Начните исследование с когорты примерно из 16-20 мышей.
  2. За день до привыкания обрабатывайте каждую мышь не менее 5 минут.
  3. Примерно через 24 часа после обработки приучите мышей к условиям испытательной комнаты и испытательному аппарату фон Фрея (рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат для тестирования акрила состоит из отдельных отсеков с крышками размером приблизительно 3 x 3,5 дюйма x 5 дюймов (Ш x В x Г) и поддерживается алюминиевыми подставками, соединенными через 0,25 в квадратной оцинкованной стальной сетчатой проволоке 19 G.
    1. Поместите мышей в горизонтально расположенный стаканчик из белой бумаги весом 4 унции, который не имеет запаха и не содержит полиэтиленового или парафинового воска.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти типы чашек предпочтительны, потому что они уменьшают желудочно-кишечное расстройство у мышей при приеме внутрь (рисунок 2B).
  4. Пока животные находятся в своих соответствующих камерах, поместите гранулу нормальной диеты чау в отдельную камеру каждой мыши, чтобы успокоить животных и избежать любого ненужного стресса для животных. Делайте это в течение 3 дней до любого тестирования поведения фон Фрея.
    1. Убедитесь, что каждый раз, когда мыши находятся в камере, есть доступ к пище.
    2. Пронумеруйте и присвойте каждому животному одно и то же место в испытательной стойке. Помещайте мышь в одну и ту же чашку каждый день периода тестирования, чтобы убедиться, что каждое животное привыкает к своей тестовой среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши будут грызть чашки и впоследствии разрушать чашки. Если это произойдет, замените чашку и пометьте ее соответствующим номером мыши.
  5. После первых 3 дней привыкания поместите мышей в их отдельные камеры.
    1. Позвольте животным акклиматизироваться в испытательной комнате и камерах в течение не менее 1 часа перед любым тестированием фон Фрея, чтобы мыши успокоились и впоследствии их было легче тестировать.
  6. После акклиматизации в комнате в день тестирования извлеките одну мышь, все еще находящуюся в чашке, из соответствующей камеры.
    1. Поддерживайте чашку в горизонтальном положении, чтобы мышь находилась как на передних лапах, так и на задних лапах, чтобы помочь их весу равномерно распределиться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неравное распределение веса может изменить реакцию животных и даже помешать животным реагировать.
  7. Поместите чашку с мышью внутрь на стол под испытательной стойкой на абсорбирующей прокладке.
  8. Для периорбитального тестирования фон Фрея поместите нить 0,07 г фон Фрея непосредственно в центр лица и между глазами.
  9. Приложите достаточное давление на нить, чтобы волосы фон Фрея согнулись в образование в форме «С».
    1. Поддерживайте контакт с областью не менее 3 с, но не более 5 с или до тех пор, пока мышь не выведет голову и не проведет лапой по нити.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если нить накала скользит или больше, чем кончик нити накала касается животного во время испытаний, любые ответы не должны учитываться. Эти реакции могут быть в ответ на щетку, которые активируются различными механорецепторами и, следовательно, могут не отражать точные результаты.
    2. Применяют нити фон Фрея по методу Диксона «вверх-вниз»22,23.
      1. Первоначально применяют нить фон Фрея, которая имеет вес 0,07 г. Наименьшая возможная нить и самая высокая испытанная нить в этом исследовании представляют собой нити с массой 0,008 г и 0,6 г соответственно.
      2. Используйте нити массой 0,008 г, 0,02 г, 0,04 г, 0,07 г, 0,16 г, 0,4 г и 0,6 г для выполнения этого анализа.
      3. В этом методе, если животное не проявляет реакции на нить, применяют нить следующего более высокого веса грамма.
      4. Если мышь реагирует на нить, учтите, что мышь реагирует на эту нить. Если это так, примените нить следующего меньшего веса грамма.
      5. Повторяйте эту схему до тех пор, пока животное не будет протестировано 4 раза после первоначального ответа или животное не будет определено как не реагирующее на любые нити, протестированные в анализе.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержитесь от применения любого дополнительного давления, исходящего от руки или запястья. Для практической практики применения нити накала может использоваться шкала.

4. Тестирование базовых пороговых значений вывода средств

  1. Перед включением в эксперимент убедитесь, что мыши достигают базового порога отмены между 0,5-0,6 г.
    1. Мышь достигает исходного уровня, если она не реагирует на какую-либо нить, испытанную в серии, упомянутой на этапе 3.9.2.2 (0,07 г, 0,16 г, 0,4 г и 0,6 г).
  2. Тестируйте мышей ежедневно при установлении базовых порогов отмены.
    1. Тестирование позволяет животным акклиматизироваться к условиям тестирования и давлению нитей фон Фрея.
    2. Если мыши все еще чрезвычайно гиперчувствительны после третьего дня тестирования, попробуйте подождать 1 или 2 дня, прежде чем снова тестировать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком много времени между днями тестирования может привести к тому, что животное не сможет приспособиться к весу нити накаливания на периорбитальной области, тем самым не достигнув целевого порога вывода.
  3. Тестируйте мышей в течение примерно 7 дней, прежде чем определить, какие животные не соответствуют критериям включения в эксперимент.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно 70% мышей достигнут целевого базового уровня.
    1. Перед дуральной стимуляцией проанализируйте исходные данные, чтобы исключить любую мышь, которая не достигла исходного значения 0,5-0,6 грамма или выше.
    2. После исключения случайным образом выделите каждую оставшуюся мышь в тестовую группу. Достигните этого, нарисовав чашку или написав сценарий в электронной таблице, чтобы рандомизировать числа в группе.

5. Анализ результатов фон Фрея

  1. После получения серии ответов определяют дельту, значение k, порог 50% и порог вывода в граммах в соответствии с ранее опубликованными методами24.
  2. Рассчитайте порог вывода, используя эту формулу WT = 10(x*F+B),где WT= порог вывода, F = порог вывода лапы, рассчитанный методом Чаплана, и B = линейная регрессия логарифма (сила изгиба) = x*Число нити накала + B.
  3. Постройте данные в виде либо 50% порога вывода, либо среднего порога вывода в граммах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот метод инъекции используется для введения стимулов на твердую мозговую оболочку мышей, чтобы могло произойти последующее поведенческое тестирование. Наиболее распространенным поведенческим результатом, измеренным с помощью этой модели, является кожная гиперчувствительность лица, оцененная с помощью фон Фрея 12,13,14. Здесь мы показываем, как эта модель может быть использована для оценки потенциального специфического для пола вклада в патологию мигрени (рисунок 3).

Эта процедура была использована для изучения влияния дурального пролактина (PRL) на механически вызванную гиперчувствительность лица14 (рисунок 3). Результаты этого исследования показали, что у самок мышей ICR значительно снижены пороги отмены лица в ответ на 5 мкг дурального пролактина (рисунок 3A). Десятикратная более низкая доза 0,5 мкг пролактина (PRL) также показала ответы, аналогичные высокой дозе PRL (рисунок 3B).

Было также показано, что эти инъекции вызывают спонтанное поведение, связанное с болью, оцениваемое с помощью гримасы. Dural 0,5 мкг PRL вызывал значительное гримасничание у самок мышей (рисунок 3C), дополнительно демонстрируя четкую роль дурального PRL в поведении женщин, подобном мигрени. Мы выполнили анализ гримасы перед всеми испытаниями с нитями фон Фрея.

Figure 1
Рисунок 1: Дуралевый инфузор и размещение инъекций. (A) Инжекторы/инфузоры состоят из модифицированной канюли, отрегулированной до длины ~0,5 мм-0,65 мм и прикрепленной к игле, сцементированной на газонепроницаемом шприце объемом 10 мкл с помощью трубы tygon. (B) Вид с воздуха на отмеченное место инъекции на голове мыши. (C) (Левая панель) Схема места инъекции дураля. Размещение инъекции происходит на стыке лямбдовидного и сагиттального швов примерно на 4,8 мм сзади к брегме. (Средняя панель) Посмертный аэрофотосъемка черепа мыши после дуральной инъекции 5 мкл синего инъекционного красителя. (Правая панель) Отделение тюбетейки мыши от мозга. Не было никакой наблюдаемой утечки синего инъекционного красителя на мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Испытательные камеры фон Фрея. (A) Испытательная камера фон Фрея состоит из 3,5 в х 3,5 в отдельных акриловых камерах с крышками, размещенными на стойке из проволочной сетки. Они соединены колоннами из 10 камер, организованных в 2 ряда. (B) Пример мышей в их индивидуальных чашках, размещенных внутри испытательных камер фон Фрея. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Дуральное применение пролактина вызывает поведенческие реакции у мышей. Механические пороги отмены оценивали после дуралевого применения PRL (5 мкг или 0,5 мкг) у самок мышей. (A) Применение 5 мкг PRL (n = 7 PRL, n = 6 транспортного средства), вызванное гиперчувствительностью лица по сравнению с транспортным средством. (B) Применение 0,5 мкг PRL (n = 5 PRL, n = 4 носителя) индуцировало длительную гиперчувствительность лица. (C) Гримаса также оценивали у тех же мышей, получавших 0,5 мкг PRL в каждый момент времени. Эти мыши показали значительно более высокие показатели гримасы по сравнению с мышами, обработанными транспортным средством. Статистика: Двусторонняя ANOVA, за которой следует множественный сравнительный пост-специальный анализ Бонферрони. Данные представлены в виде средств ± SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Дезадаптивные изменения в местной ноцицептивной системе в твердой мозговой оболочке считаются ключевым фактором фазы головной боли приступов мигрени, несмотря на отсутствие повреждения тканей25,26. Здесь в исследовании представлен метод, при котором минимально инвазивная стимуляция твердой мозговой оболочки может вызвать тактильную гиперчувствительность лица. Выяснение механизмов и событий, участвующих в активации дурального ноцицептора, не вызывая повреждения черепа и тканей, может более точно отражать механизмы мигрени в доклинической модели.

Трепанация черепа и имплантация канюли уже давно используются для оценки функций и механизмов, которые способствуют боли при мигрени11,12. Тем не менее, сообщалось, что трепанация черепа может индуцировать активацию дуральных тучных клеток и увеличивать проницаемость пиальных сосудов у грызунов27. Учитывая, что активация тучных клеток в твердой мозговой оболочке сильно вовлечена в мигрень 7,8,28,29, этот метод имеет серьезные предостережения, которые могут исказить интерпретацию. Введение веществ через соединение сагиттального и лямбдоидального швов эффективно уменьшает активацию ноцицепторов, опосредованную активацией тучных клеток, вызванной краниотомией. Кроме того, неинвазивная дуральная стимуляция не требует послеоперационного восстановления и введения анальгетиков, которые могут изменить интерпретацию результатов. Локальное применение веществ на твердой мозговой оболочке позволяет исследователям сосредоточиться на этой конкретной ткани-мишени, в отличие от системного введения лекарств, где место действия нелегко определить 12,13,14. В то время как системное введение таких веществ, как нитроглицерин и пептид, связанный с геном кальцитонина, вызывает экспериментальные атаки у людей, которые похожи на мигрень, они не позволяют оценить местоположение действия в моделях грызунов; более целенаправленные тканеспецифические модели предлагают альтернативный подход.

Этот метод, описанный здесь, включает в себя введение лекарственного средства или другого раствора непосредственно на твердую мозговую оболочку мозговых оболочек через соединение, где встречаются сагиттальные и лямбдоидальные швы черепа. Для достижения наилучших результатов для этих экспериментов следует использовать мышей ICR (CD-1) или C57/BL6 в возрасте 6-8 недель. Могут быть использованы более молодые мыши; однако использование мышей ICR (CD-1), которые старше 8 недель, не рекомендуется, так как их швы черепной пластины обычно полностью сращены к этому возрасту, что делает невозможным инъекцию без повреждения черепа. Также важно учитывать вес / размер каждой мыши, которая будет проходить эту процедуру. Рекомендуется, чтобы эти инъекции выполнялись животным, которые имеют вес более 19 г, поскольку череп, как правило, очень тонкий при более низком весе и может не выдерживать давления, приложенного во время инъекции. Важно отметить, что существуют также вероятные факторы, которые влияют на возраст / вес, при котором происходит слияние пластин черепа (например, состав лабораторного чау, используемого в животноводческих учреждениях). Поэтому экспериментаторам, возможно, придется определить диапазон возраста / веса, подходящий для их собственных условий. Различные возрастные диапазоны и вес животных могут потребоваться для других штаммов мышей или генотипов, в зависимости от того, когда пластины черепа сливаются у этих животных, а также могут потребовать оптимизации самой инъекции.

При изучении или практике этой техники настоятельно рекомендуется получить уровень комфорта при обнаружении шовного соединения у усыпленных мышей. Возможно, лучше всего сначала попрактиковаться с иссеченной или шелушенной кожей головы у этих мышей и медленно продвигаться к обнаружению соединения через кожу. После установления точного местоположения чернила и красители могут быть введены в твердое вещество для проверки точности местоположения и глубины инъекции. Эта методика была разработана и оптимизирована с использованием мышей ICR (CD-1) (30-35 г) и C57/BL6 (25-30 г). Инфузион длиной 0,5-0,6 мм достаточен для введения мыши весом в пределах 25-35 г. Тем не менее, длина инфузии, возможно, потребуется откалибровать при инъекции мышей, которые значительно отличаются от мышей, используемых для оптимизации этой техники. Например, мышь размером менее 25 г, вероятно, приведет к использованию инфузии, которая имеет длину менее 0,5 мм. После освоения этой техники и при выполнении на соответствующих возрасту мышах показатель успеха этой инъекции может быть близок к 100%; однако осложнения с инъекцией могут быть связаны с такими проблемами, как перелом черепа из-за применения слишком большой силы для введения инфузии, а также аномальное кровотечение, вызванное повреждением мозговых кровеносных сосудов.

Изменения в тактильной чувствительности являются важным измерением при оценке болевого поведения у грызунов. Здесь мы демонстрируем использование периорбитального тестирования фон Фрея для оценки этого поведения в доклинической модели мигрени. Основным преимуществом использования этого метода в моделях мигрени является то, что мы можем оценить гиперчувствительность головы, которая имеет большее значение, чем другие некраниальные места, такие как лапы. Критическим шагом для обеспечения воспроизводимых результатов является обеспечение того, чтобы мыши были полностью исходными линиями. Для этого потребуется хорошо обученный экспериментатор, который может точно применять нити фон Фрея. Вполне вероятно, что животному потребуется примерно 7 дней, чтобы достичь исходного уровня. Однако не исключено, что не каждое животное достигнет целевого базового уровня. По нашему опыту, примерно через 7 дней работы с мышами только 60%-70% животных достигнут исходного уровня в 0,6 г в периорбитальной области, но это зависит от когорты животных. Это время следует учитывать до начала эксперимента, чтобы убедиться, что достаточное количество используется для учета отсева и что животные являются надлежащим возрастом после исходного уровня для использования этого неинвазивного метода для стимуляции твердой мозговой оболочки. Этапы определения базового уровня описаны в разделе 4 протокола.

Ограничением тестирования фон Фрея является то, что может быть трудно различить болевые реакции и рутинный груминг / зуд. Чтобы помочь отличить боль от груминга, важно заметить продолжительность времени, в течение которого происходит такое поведение. Обычно болевая реакция представляет собой один свайп после применения нити, в то время как поведение груминга, как правило, затягивается и может длиться от нескольких секунд до минут. Если поведение груминга /зуда нельзя отличить от гиперчувствительной реакции, лучше не записывать это как реакцию. Кроме того, неправильное размещение нити накаливания (например, скольжение нити) может привести к длительному уходу за животным, что затрудняет правильное тестирование. Если это произойдет, экспериментатор должен подождать, пока груминг не прекратится, и мышь не будет достаточно спокойна, чтобы протестировать. Продолжайте от той же нити, которая использовалась до начала грумингового поведения. Если мышь продолжает в течение очень долгих периодов времени, поместите мышь обратно в тестовую камеру примерно на 5 минут. По прошествии 5 минут попробуйте снова протестировать мышь. Если такое поведение продолжается без разрешения, мыши должны быть удалены из исследования. Важно, что не рекомендуется брить шерсть на лице, так как неясно, сохраняет ли кожа мыши такую же чувствительность после удаления волос, а процесс удаления волос (бритье, кремы для депиляции) также может влиять на чувствительность кожи.

В большинстве ситуаций он идеально подходит для введения веществ на твердый мозг не более чем через 24 ч после того, как мышь достигла исходного уровня. Рекомендуется, чтобы мыши подвергались тестированию нитей фон Фрея один раз в час. Если возможно, тестирование каждые два часа дает достаточно времени, чтобы животные успокоились после тестирования. Кроме того, эксперименты должны быть рассчитаны по времени, чтобы не мешать их циркадным паттернам. Изменения циркадного ритма у мышей могут изменить поведенческие фенотипы и в конечном итоге привести к невоспроизводимым результатам.

Периорбитальное тестирование фон Фрея может быть использовано в сочетании с другими поведенческими анализами для укрепления экспериментальных выводов. Шкала гримасы опирается на спонтанную мимику у грызунов, а не на вызванные реакции18,19. Этот метод имеет высокую точность и надежность при оценке и количественной оценке острого болевого поведения и использовался во многих доклинических моделях мигрени12,30. При использовании как гримасы, так и периорбитальных анализов фон Фрея экспериментатор должен рассмотреть возможность оценки гримасы до применения нитей фон Фрея к периорбитальной области мыши. Это гарантирует, что гримасничающее поведение является спонтанным и не вызвано применением нити. Механическая гиперчувствительность Hindpaw также может быть использована в сочетании с периорбитальным тестированием фон Фрея. В отличие от оценки гримасы, лучше всего проверить гиперчувствительность лица перед оценкой гиперчувствительности задней лапы. Тестирование Hindpaw требует, чтобы мышь была помещена обратно в камеру без чашки после завершения периорбитального тестирования фон Фрея.

В заключение, периорбитальное тестирование фон Фрея и неинвазивная дуральная стимуляция у мышей добавляют ценные варианты к текущему диапазону доклинических моделей мигрени. При правильном выполнении эта методика представляет собой усовершенствованный подход к генерации головного фенотипа у грызунов, так как не требует хирургической имплантации канюли. У крыс канюли склонны к бактериальной инфекции, могут забиваться, могут отваливаться и требовать, чтобы каждое животное было одножилым, создавая ненужный стресс для животного. Кроме того, протокол дуральной стимуляции может быть легко модифицирован для использования с несколькими лекарственными препаратами. Парадигмы периорбитального тестирования фон Фрея также могут быть изменены, чтобы наилучшим образом соответствовать экспериментальным спецификациям. Кроме того, периорбитальное тестирование фон Фрея может быть использовано при других орофациальных болевых расстройствах. Эти методы являются важным инструментом, помогающим лучше понять сложные основные механизмы боли при мигрени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (NS104200 и NS072204 to GD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 oz Hot Paper Cups Choice Paper Company 5004W https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads Fisherbrand 14-206-65 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula P1 Technologies (formerly Plastics One) 8IC313ISPCXC I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes Hamilton 80008 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm Cole-Palmer EW-96460-10 https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire Custom The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers Custom Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments Touch test/Stoelting 58011 https://www.stoeltingco.com/touch-test.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Woldeamanuel, Y. W., Cowan, R. P. Migraine affects 1 in 10 people worldwide featuring recent rise: A systematic review and meta-analysis of community-based studies involving 6 million participants. Journal of the Neurological Sciences. 372, 307-315 (2017).
  3. Burch, R. C., Loder, S., Loder, E., Smitherman, T. A. The prevalence and burden of migraine and severe headache in the United States: updated statistics from government health surveillance studies. Headache. 55 (1), 21-34 (2015).
  4. Ashina, M. Migraine. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1866-1876 (2020).
  5. Ashina, M., et al. Migraine: integrated approaches to clinical management and emerging treatments. Lancet. 397 (10283), 1505-1518 (2021).
  6. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: Moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  7. Koyuncu Irmak, D., Kilinc, E., Tore, F. Shared Fate of Meningeal Mast Cells and Sensory Neurons in Migraine. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 136 (2019).
  8. Levy, D. Migraine pain, meningeal inflammation, and mast cells. Current Pain and Headache Reports. 13 (3), 237-240 (2009).
  9. Levy, D., Labastida-Ramirez, A., MaassenVanDenBrink, A. Current understanding of meningeal and cerebral vascular function underlying migraine headache. Cephalalgia. 39 (13), 1606-1622 (2019).
  10. Phebus, L. A., Johnson, K. W. Dural inflammation model of migraine pain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  11. Fried, N. T., Maxwell, C. R., Elliott, M. B., Oshinsky, M. L. Region-specific disruption of the blood-brain barrier following repeated inflammatory dural stimulation in a rat model of chronic trigeminal allodynia. Cephalalgia. 38 (4), 674-689 (2018).
  12. Avona, A., et al. Dural calcitonin gene-related peptide produces female-specific responses in rodent migraine models. The Journal of Neuroscience. 39 (22), 4323-4331 (2019).
  13. Burgos-Vega, C. C., et al. Non-invasive dural stimulation in mice: A novel preclinical model of migraine. Cephalalgia. 39 (1), 123-134 (2019).
  14. Avona, A., et al. Meningeal CGRP-Prolactin interaction evokes female-specific migraine behavior. Annals of Neurology. 89 (6), 1129-1144 (2021).
  15. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  16. Lipton, R. B., et al. Cutaneous allodynia in the migraine population. Annals of Neurology. 63 (2), 148-158 (2008).
  17. Goadsby, P. J. Migraine, allodynia, sensitisation and all of that. European Neurology. 53, Suppl 1 10-16 (2005).
  18. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  19. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  20. Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 11 (2019).
  21. Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central CGRP mechanisms. The journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
  22. Dixon, W. J., Mood, A. M. A method for obtaining and analyzing sensitivity data. The Journal of the American Statistical Association. 43 (241), 109-126 (1948).
  23. Dixon, W. The up-and-down method for small samples. The Journal of the American Statistical Association. 60, (1965).
  24. Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Molecular Pain. 10, 26 (2014).
  25. Ramachandran, R. Neurogenic inflammation and its role in migraine. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 301-314 (2018).
  26. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K. Does inflammation have a role in migraine. Nature Reviews Neurology. 15 (8), 483-490 (2019).
  27. Stokely, M. E., Orr, E. L. Acute effects of calvarial damage on dural mast cells, pial vascular permeability, and cerebral cortical histamine levels in rats and mice. Journal of Neurotrauma. 25 (1), 52-61 (2008).
  28. Theoharides, T. C., Donelan, J., Kandere-Grzybowska, K., Konstantinidou, A. The role of mast cells in migraine pathophysiology. Brain Research Reviews. 49 (1), 65-76 (2005).
  29. Conti, P., et al. Progression in migraine: Role of mast cells and pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. European Journal of Pharmacology. 844, 87-94 (2019).
  30. Rea, B. J., et al. Peripherally administered calcitonin gene-related peptide induces spontaneous pain in mice: implications for migraine. Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).

Tags

Неврология выпуск 173 мигрень твердая мозговая оболочка гиперчувствительность лица неинвазивная стимуляция поведение
Дуральная стимуляция и периорбитальное тестирование фон Фрея на мышах как доклиническая модель головной боли
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mason, B. N., Avona, A., Lackovic,… More

Mason, B. N., Avona, A., Lackovic, J., Dussor, G. Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache. J. Vis. Exp. (173), e62867, doi:10.3791/62867 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter