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Neuroscience

Estimulación dural y pruebas periorbitarias de von Frey en ratones como modelo preclínico de dolor de cabeza

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

El síntoma más notable de la migraña es el dolor de cabeza severo, y se plantea la hipótesis de que esto está mediado por neuronas sensoriales que inervan las meninges. Aquí, presentamos un método para aplicar localmente sustancias a la duramadre de una manera mínimamente invasiva mientras se utiliza la hipersensibilidad facial como resultado.

Abstract

Se cree que las meninges craneales, compuestas por la duramadre, la aracnoidea y la piamadre, cumplen principalmente funciones estructurales para el sistema nervioso. Por ejemplo, protegen el cerebro del cráneo y anclan / organizan el suministro vascular y neuronal de la corteza. Sin embargo, las meninges también están implicadas en trastornos del sistema nervioso como la migraña, donde el dolor experimentado durante una migraña se atribuye a la inflamación estéril local y la posterior activación de las aferencias nociceptivas locales. De las capas en las meninges, la duramadre es de particular interés en la fisiopatología de las migrañas. Está altamente vascularizado, alberga neuronas nociceptivas locales y es el hogar de una amplia gama de células residentes, como las células inmunes. Los cambios sutiles en el microambiente meníngeo local pueden conducir a la activación y sensibilización de los nociceptores perivasculares durales, lo que conduce al dolor de migraña. Los estudios han tratado de abordar cómo los aferentes durales se activan / sensibilizan mediante el uso de electrofisiología in vivo, técnicas de imagen o modelos de comportamiento, pero estos comúnmente requieren cirugías muy invasivas. Este protocolo presenta un método para la aplicación comparativamente no invasiva de compuestos en la duramadre en ratones y un método adecuado para medir la sensibilidad táctil similar al dolor de cabeza utilizando pruebas de von Frey periorbitarias después de la estimulación dural. Este método mantiene la integridad de la duramadre y el cráneo y reduce los efectos de confusión de las técnicas invasivas mediante la inyección de sustancias a través de una cánula modificada de 0,65 mm en la unión de suturas sagitales y lambdoides no fusionadas. Este modelo preclínico permitirá a los investigadores investigar una amplia gama de estímulos durales y su papel en la progresión patológica de la migraña, como la activación de nociceptores, la activación de células inmunes, los cambios vasculares y los comportamientos de dolor, todo mientras se mantienen condiciones libres de lesiones en el cráneo y las meninges.

Introduction

El dolor de migraña sigue siendo un importante problema de salud pública en todo el mundo. La Organización Mundial de la Salud la clasifica como la sexta enfermedad más prevalente en el mundo, afectando a poco menos del 15% de la población de la Tierra1 y causando una carga socioeconómica sustancial en la sociedad 2,3. Las opciones de tratamiento y su eficacia han sido subóptimas y solo proporcionan alivio sintomático y no modifican significativamente los eventos fisiopatológicos que subyacen a la aparición demigrañas 4,5. La falta de éxito del tratamiento se debe probablemente a que la migraña es un trastorno multifactorial cuya patología es poco conocida, lo que lleva a un número limitado de dianas terapéuticas. La migraña también es difícil de capturar completamente en modelos animales, especialmente dado que el diagnóstico de migraña se realiza en función de la comunicación verbal con pacientes que describen su experiencia con las características de la migraña como el aura, el dolor de cabeza, la fotofobia y la alodinia. No obstante, es importante tener en cuenta que los avances recientes en los tratamientos de la migraña actualmente están superando a los tratamientos para muchas afecciones neurológicas que han sido bien validadas por modelos preclínicos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales y las moléculas pequeñas que se dirigen al péptido relacionado con el gen de la calcitonina, o su receptor, han tenido mucho éxito en la mejora de la calidad de vida de los pacientes con migraña y pueden transformar potencialmente el tratamiento clínico de la migraña. Si bien ha habido avances en la comprensión de este trastorno, todavía hay mucho por dilucidar.

Sobre la base de modelos animales preclínicos y estudios en humanos, es ampliamente aceptado que las migrañas se inician por la activación aberrante de fibras nociceptivas dentro de las meninges que señalan a través de los ganglios trigémino y de la raíz dorsal cervical superior 6,7,8,9,10. A pesar de esta teoría, muchos estudios todavía utilizan la administración sistémica de medicamentos para comprender los mecanismos subyacentes que contribuyen a la migraña. Si bien la dosificación sistémica de medicamentos ha fortalecido sustancialmente nuestra comprensión, estos hallazgos no evalúan directamente si las acciones locales dentro del tejido objetivo de interés desempeñan un papel en la migraña. Por el contrario, varios estudios han adoptado un enfoque para estimular la duramadre; sin embargo, estos experimentos requieren la implantación de cánulas a través de una craneotomía invasiva y tiempos de recuperación prolongados11,12. Debido a estas limitaciones, desarrollamos un enfoque mínimamente invasivo para estimular localmente la duramadre donde la falta de una craneotomía elimina la recuperación postquirúrgica y permite realizar pruebas inmediatas en animales despiertos 12,13,14. Estas inyecciones se realizan bajo anestesia ligera de isoflurano y se administran en la unión de las suturas sagital y lambdoide en ratones.

Se han desarrollado varios enfoques para evaluar las respuestas conductuales nociceptivas en roedores15. Se ha notificado alodinia cutánea en aproximadamente el 80% de los pacientes con migraña16,17 y representa un posible criterio de valoración traslacional para su uso en roedores. En modelos preclínicos, la aplicación de filamentos de von Frey a la región plantar de la pata del roedor se ha utilizado para evaluar los comportamientos del dolor en modelos preclínicos de migraña. La principal limitación de este enfoque es que no prueba la región cefálica. La puntuación de la mueca facial se ha utilizado para capturar los comportamientos de dolor en roedores mediante el análisis de las expresiones faciales después de la inducción de estímulos de dolor18,19. Sin embargo, sus limitaciones incluyen solo la captura de respuestas a estímulos agudos y no condiciones de dolor orofacial crónico. El aseo facial y la disminución de la crianza también se consideran salidas de respuestas conductuales en modelos preclínicos de migraña20,21. Las limitaciones de los primeros incluyen dificultad para diferenciar las respuestas al dolor del aseo rutinario normal y otras sensaciones como la picazón. En el caso de este último, los comportamientos de cría generalmente disminuyen rápidamente después de la introducción de roedores en nuevos entornos. Aunque cada uno de estos criterios de valoración conductuales es valioso en la comprensión de varios mecanismos que contribuyen a las condiciones de dolor, existe una necesidad crítica de modelos preclínicos de trastornos del dolor como la migraña para incluir puntos finales que capturen específicamente las respuestas de hipersensibilidad cefálica. La evaluación de la hipersensibilidad táctil de la piel periorbitaria después de la estimulación dural es un método que puede proporcionar una mejor comprensión de los mecanismos que contribuyen a las migrañas donde los síntomas sensoriales son predominantemente de naturaleza cefálica. Aquí, describimos un método para administrar sustancias en la duramadre del ratón como un modelo preclínico de migraña. Después de la aplicación dural, también presentamos un método detallado para probar la hipersensibilidad táctil periorbitaria utilizando filamentos de von Frey calibrados aplicados en el método Dixon hacia arriba y hacia abajo.

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Protocol

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación previa del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Universidad de Texas en Dallas. En este estudio se utilizaron ratones ICR (CD-1) (30-35 g) y C57/BL6 (25-30 g) de 6 a 8 semanas de edad.

1. Infusor Dural

  1. Cree los infusores/inyectores de ratón modificando una cánula interna e infusor disponible en el mercado para inyecciones unilaterales con una tapa de plástico de sílice fundida no metálica que es ajustable y se inserta en/se extiende por debajo de una cánula guía de 28 G con diámetro interior (I.D.) de 0,18 mm y un diámetro exterior (O.D.) de 0,35 mm (Figura 1A).
  2. Use una pinza u otro dispositivo de medición para ajustar la tapa de plástico de sílice fundido en el infusor a una longitud de 0,6 mm; medido desde la punta del infusor hasta el borde de la tapa de plástico de sílice.
    1. Tenga cuidado de no doblar ni opacar el infusor al ajustar la tapa de plástico.
    2. Para otras cepas de ratón que no se han utilizado previamente para inyecciones durales, determine la longitud óptima del infusor estableciendo la longitud a 0,6 mm y realizando inyecciones piloto con tinta o tinte, ajustando la longitud del infusor hasta que se observe que el tinte está solo en la duramadre y no en el cerebro o el cráneo.
  3. Conecte el extremo largo (o el extremo que no se midió para ser de 0,6 mm) del infusor ajustado a la tubería de plástico (tubería de la bomba, 2 pasos, I.D. 0,19 mm, longitud 406 mm).
    1. Corte el tubo a una longitud mínima de 8 pulgadas para asegurarse de que haya suficiente línea para sostener un volumen de 5 μL.
    2. Asegúrese de que el tubo cubra la parte metálica y la parte superior del tapón de plástico ubicado en el infusor. Esto ayudará a evitar que las burbujas de aire se acumulen en la línea.
  4. Fije el otro extremo del tubo a una microjeringa de vidrio de 10 μL (hermética al gas; aguja cementada; 21 G con una proyección de 10 mm), nuevamente, asegurándose de tener un sello hermético sobre la parte metálica de la jeringa (Figura 1A).
  5. Una vez que la línea esté conectada, rellene la jeringa con 5 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), líquido intersticial sintético (SIF) u otros vehículos de elección para evitar que se formen burbujas de aire.
    1. Si se observan burbujas de aire en la línea, inunde la línea con el vehículo hasta que las burbujas se hayan disipado.
      NOTA: Puede ser útil llenar la jeringa con el vehículo antes de conectarla a la línea y luego empujar el fluido a través de la línea una vez conectado.
  6. Después de que la línea se vuelva a llenar con 5 μL del vehículo y funcione de manera eficiente, cargue 5 μL del medicamento / solución en la jeringa Hamilton (la tinta o el tinte se pueden usar como alternativa al medicamento / solución si aprende o practica esta técnica).
    1. Asegúrese de que todas las soluciones del vehículo administradas en la duramadre se mantengan a un pH 7.4 y se midan a una osmolalidad de 310. Esto reduce la activación potencial de los canales iónicos sensibles al ácido y otros canales osmosensibles dentro de la duramadre.
  7. El volumen máximo probado en ratones que no causó fugas en el cerebro es de aproximadamente 10 μL. Los efectos conductuales después de las inyecciones con este volumen no se han probado. Por esta razón, administre solo 5 μL de la solución en la duramadre.
    NOTA: Estas observaciones se basan en las cepas de ratón / edades / pesos de ratones cd1 / ICR de 6-8 semanas de edad.

2. Inyecciones durales

  1. Una vez que se prepara la jeringa y se carga el medicamento, coloque un ratón plano sobre su abdomen y anestéselo bajo un breve isoflurano al 3% con un caudal de oxígeno de 0.5-1 L / min a través de nosecone.
    1. Después de que el ratón ya no muestre un reflejo de pellizco, ajuste la anestesia y manténgala a un 1,5% de isoflurano.
  2. Una vez anestesiado, aplique ungüento oftalmológico estéril en los ojos y afeite la cabeza del animal, luego desinfecte la piel con povidona yodada y etanol. Después de esto, póngase en una posición propicia para una inyección exitosa.
  3. Use una mano para estabilizar la cabeza del animal y sostenga el infusor con la otra mano.
  4. Sondee cuidadosamente y localice la unión de las suturas sagital y lambdoidal en el cráneo del ratón (Figura 1B, C).
    1. Para localizar esta unión discreta a través de la piel, use las características topográficas del cráneo y sondee suavemente la ubicación general de la unión con el infusor.
    2. Verifique la posición de la unión volviendo a colocar el infusor a lo largo del cráneo y sintiendo la ubicación exacta.
  5. Una vez que la sutura esté ubicada y el infusor esté en su lugar, mueva muy lenta y suavemente el infusor hacia adelante y hacia atrás hasta que perfore la piel y caiga hacia abajo en la unión hasta el tapón de plástico.
    NOTA: Asegúrese de insertar toda la punta de 0,6 mm del infusor en la unión.
  6. Para verificar la precisión, use tinta o tinte como solución inyectable y eutanasia y decapita al ratón.
    1. Retire la tapa del cráneo para visualizar el tinte dentro de la duramadre (Figura 1C).
      NOTA: El tinte no debe observarse en el cerebro o en el exterior del cráneo. Del mismo modo, los ratones en cualquier experimento deben ser revisados post mortem para verificar la precisión de la inyección, así como para garantizar que la integridad de la duramadre no se dañe.
  7. Después de la inyección, retire al ratón de la anestesia, espere a que recupere la conciencia y luego regrese a su jaula o colóquelo en una cámara de prueba para comenzar los ensayos deseados.
    NOTA: Permita que el ratón se recupere de la anestesia durante un mínimo de 30 minutos antes de realizar cualquier experimento de comportamiento.

3. Periorbital von Frey

  1. Comience el estudio con una cohorte de aproximadamente 16-20 ratones.
  2. Uno el día anterior a la habituación, manipule cada ratón durante al menos 5 minutos.
  3. Aproximadamente 24 h después de la manipulación, habitúe a los ratones a las condiciones de la sala de pruebas y al aparato de prueba de von Frey (Figura 2A).
    NOTA: El aparato de prueba de acrílico consiste en compartimentos individuales con tapas que son aproximadamente 3 en x 3.5 en x 5 in (W x H x D) y están soportados por soportes de aluminio conectados a través de 0.25 en alambre de malla de acero galvanizado cuadrado de 19 G.
    1. Coloque los ratones dentro de un vaso de papel blanco de 4 onzas colocado horizontalmente que sea inodoro y no contenga cera de polietileno o parafina.
      NOTA: Se prefieren estos tipos de tazas porque reducen el malestar gastrointestinal en los ratones si se ingieren (Figura 2B).
  4. Mientras los animales están en sus respectivas cámaras, coloque un pellet de la dieta normal de chow en la cámara individual de cada ratón para calmar a los animales y evitar cualquier estrés innecesario para los animales. Haga esto durante 3 días antes de cualquier prueba de comportamiento de von Frey.
    1. Asegúrese de que cada vez que los ratones estén en la cámara haya acceso a los alimentos.
    2. Numere y asigne a cada animal al mismo espacio en el bastidor de prueba. Coloque el ratón en la misma taza todos los días del período de prueba para asegurarse de que cada animal se aclimate a su entorno de prueba.
      NOTA: Los ratones roerán las copas y posteriormente destruirán las tazas. Si esto sucede, reemplace la taza y etiquétela con el número de mouse correspondiente.
  5. Después de los 3 días iniciales de habituación, coloque a los ratones en sus cámaras individuales.
    1. Permita que los animales se aclimaten a la sala de pruebas y las cámaras durante al menos 1 h antes de cualquier prueba de von Frey para permitir que los ratones se calmen y, posteriormente, sean más fáciles de probar.
  6. Después de aclimatarse a la habitación el día de la prueba, retire un ratón mientras aún está en su taza de su cámara respectiva.
    1. Mantenga la copa en posición horizontal para que el ratón esté en las patas delanteras y traseras para ayudar a mantener su peso distribuido uniformemente.
      NOTA: La distribución desigual del peso puede alterar las respuestas de los animales e incluso evitar que los animales respondan.
  7. Coloque la taza con el ratón dentro de la mesa debajo del bastidor de prueba en la almohadilla absorbente.
  8. Para las pruebas periorbitarias de von Frey, coloque el filamento von Frey de 0,07 g directamente en el centro de la cara y entre los ojos.
  9. Aplique suficiente presión sobre el filamento para hacer que el cabello de von Frey se doble en una formación en forma de "C".
    1. Mantenga el contacto con la región al menos 3 s pero no más de 5 s o hasta que el ratón retire la cabeza y golpee el filamento con su pata.
      NOTA: Si el filamento se desliza o más que la punta del filamento toca al animal durante la prueba, no se deben contar las respuestas. Estas respuestas pueden ser en respuesta al cepillo que son activadas por diferentes mecanorreceptores y, por lo tanto, pueden no reflejar resultados precisos.
    2. Aplicar filamentos von Frey según el método "arriba-abajo" de Dixon22,23.
      1. Inicialmente, aplique el filamento von Frey que tiene un peso de 0,07 g. El filamento más bajo posible y el filamento más alto probado en este estudio son filamentos con pesos de 0,008 g y 0,6 g, respectivamente.
      2. Utilice los filamentos de peso 0.008 g, 0.02 g, 0.04 g, 0.07 g, 0.16 g, 0.4 g y 0.6 g para realizar este ensayo.
      3. En este método, si un animal no exhibe una respuesta al filamento, aplique el filamento del siguiente gramo de peso más alto.
      4. Si el ratón responde a un filamento, considere que el ratón responde a ese filamento. Si este es el caso, aplique el filamento del siguiente gramo de peso más bajo.
      5. Repita este patrón hasta que el animal sea probado 4 veces después de la respuesta inicial o se determine que el animal no responde a los filamentos probados en el ensayo.
        NOTA: Abstenerse de aplicar cualquier presión adicional derivada del brazo o la muñeca. Se puede utilizar una escala para practicar la aplicación del filamento.

4. Comprobación de los umbrales de retirada de referencia

  1. Antes de su inclusión en un experimento, asegúrese de que los ratones alcancen un umbral de abstinencia basal entre 0,5-0,6 g.
    1. Un ratón alcanza la línea de base si no responde a ningún filamento probado en la serie mencionada en el paso 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g y 0,6 g).
  2. Pruebe a los ratones diariamente al establecer los umbrales de abstinencia basales.
    1. Las pruebas permiten a los animales aclimatarse a las condiciones de prueba y a la presión de los filamentos von Frey.
    2. Si los ratones todavía son extremadamente hipersensibles después del tercer día de prueba, intente esperar 1 o 2 días antes de volver a probar.
      NOTA: Demasiado tiempo entre los días de prueba puede resultar en que el animal no se ajuste al peso del filamento en su región periorbitaria, por lo que no alcanza el umbral de retirada objetivo.
  3. Pruebe ratones durante aproximadamente 7 días antes de determinar qué animales no cumplen con los criterios de inclusión para un experimento.
    NOTA: Aproximadamente el 70% de los ratones alcanzarán el nivel basal objetivo.
    1. Antes de la estimulación dural, analice los datos de referencia para excluir a cualquier ratón que no haya alcanzado un valor basal de 0,5-0,6 gramos o superior.
    2. Después de la exclusión, asigne aleatoriamente cada ratón restante a un grupo de prueba. Logre esto sacando de una taza o escribiendo un guión en una hoja de cálculo para aleatorizar números a un grupo.

5. Análisis de los resultados de von Frey

  1. Una vez obtenidas las series de respuestas, determinar el valor delta, k, el umbral del 50% y el umbral de retirada en gramos según los métodos publicados previamente24.
  2. Calcule el umbral de retirada utilizando esta fórmula WT = 10(x*F+B),donde WT= umbral de retirada, F= umbral de retirada de pata calculado mediante el método de Chaplan, y B = regresión lineal de log (fuerza de flexión) = x*Número de filamento + B.
  3. Trace los datos como umbral de retiro del 50% o umbral de retiro promedio en gramos.

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Representative Results

Este método de inyección se utiliza para administrar estímulos en la duramadre de ratones para que puedan realizarse pruebas de comportamiento posteriores. La producción conductual más común medida con este modelo es la hipersensibilidad facial cutánea evaluada a través de von Frey 12,13,14. Aquí mostramos cómo se puede utilizar este modelo para evaluar las posibles contribuciones específicas del sexo a la patología de la migraña (Figura 3).

Este procedimiento se ha utilizado para examinar los efectos de la prolactina dural (PRL) en la hipersensibilidad facial evocada mecánicamente14 (Figura 3). Los resultados de este estudio demostraron que los ratones ICR hembra muestran umbrales de abstinencia facial significativamente reducidos en respuesta a 5 μg de prolactina dural (Figura 3A). Una dosis diez veces menor de 0,5 μg de prolactina (PRL) también mostró respuestas similares a una dosis alta de PRL (Figura 3B).

También se ha demostrado que estas inyecciones producen comportamientos espontáneos relacionados con el dolor evaluados a través de la mueca. Dural 0.5 μg de PRL causó muecas significativas en ratones hembra (Figura 3C), demostrando aún más un papel claro para la PRL dural en comportamientos similares a la migraña femenina. Realizamos ensayos de muecas antes de todas las pruebas con filamentos von Frey.

Figure 1
Figura 1: Infusor dural y colocación de inyección. (A) Los inyectores/infusores consisten en una cánula modificada ajustada a la longitud de ~0,5 mm- 0,65 mm y unida a una aguja cementada en una jeringa hermética al gas de 10 μL a través de tubos de tygon. (B) Vista aérea de la ubicación marcada del sitio de inyección en la cabeza del ratón. (C) (Panel izquierdo) Diagrama de la ubicación de la inyección dural. La colocación de la inyección es en la unión de las suturas lambdoide y sagital a aproximadamente 4,8 mm posteriores a bregma. (Panel central) Vista aérea post mortem de un cráneo de ratón después de la inyección dural de 5 μL de colorante azul inyectable. (Panel derecho) Separación de la escutelaria del ratón del cerebro. No hubo una fuga observable de tinte de inyección azul en el cerebro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cámaras de ensayo von Frey. (A) Cámara de ensayo von Frey compuesta por 3,5 pulgadas x 3,5 en cámaras acrílicas individuales con tapas colocadas en un estante de malla metálica. Estos están conectados a través de columnas de 10 cámaras organizadas en 2 filas. (B) Ejemplo de ratones en sus copas individuales alojadas dentro de las cámaras de prueba de von Frey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La aplicación dural de prolactina induce respuestas conductuales en ratones. Los umbrales de retirada mecánica se evaluaron después de la aplicación dural de PRL (5 μg o 0,5 μg) en ratones hembra. (A) La aplicación de 5 μg de PRL (n = 7 PRL, n = 6 vehículo) indujo hipersensibilidad facial en comparación con el vehículo. (B) La aplicación de 0,5 μg de PRL (n = 5 PRL, n = 4 vehículos) indujo hipersensibilidad facial de larga duración. (C) Grimace también se evaluó en los mismos ratones tratados con 0,5 μg de PRL en cada punto temporal. Estos ratones exhibieron puntuaciones de mueca significativamente más altas en comparación con los ratones tratados con vehículo. Estadísticas: ANOVA bidireccional seguido de análisis post-hoc de comparación múltiple de Bonferroni. Los datos se representan como medias ± SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los cambios desadaptativos en el sistema nociceptivo local en la duramadre se consideran un contribuyente clave a la fase de dolor de cabeza de los ataques de migraña a pesar de la falta de lesión tisular25,26. Aquí el estudio presenta un método por el cual la estimulación mínimamente invasiva de la duramadre puede inducir hipersensibilidad táctil facial. La elucidación de los mecanismos y eventos involucrados en la activación del nociceptor dural sin causar daño al cráneo y los tejidos puede reflejar con mayor precisión los mecanismos de la migraña en un modelo preclínico.

La craneotomía y la implantación de cánulas se han utilizado durante mucho tiempo para evaluar las funciones y los mecanismos que contribuyen al dolor de migraña11,12. Sin embargo, se ha reportado que una craneotomía puede inducir la activación de los mastocitos durales y aumentar la permeabilidad vascular pial en roedores27. Dado que la activación de los mastocitos en la duramadre está altamente implicada en la migraña 7,8,28,29, esta técnica tiene importantes advertencias que pueden sesgar la interpretación. La administración de sustancias a través de la unión de las suturas sagital y lambdoidal disminuye eficazmente la activación de los nociceptores mediados por la activación de los mastocitos inducida por la craneotomía. Además, la estimulación dural no invasiva no requiere recuperación postquirúrgica y administración de analgésicos que puedan alterar la interpretación de los resultados. La aplicación local de sustancias en la duramadre permite a los investigadores centrarse en este tejido diana específico, a diferencia de la administración sistémica de fármacos donde el sitio de acción no se determina fácilmente 12,13,14. Si bien la administración sistémica de sustancias como la nitroglicerina y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina desencadena ataques experimentales en humanos que son similares a las migrañas, no permiten evaluar la ubicación de la acción en modelos de roedores; los modelos específicos de tejido más específicos ofrecen un enfoque alternativo.

Esta técnica descrita aquí consiste en inyectar un medicamento u otra solución directamente sobre la duramadre de las meninges a través de la unión donde se encuentran las suturas sagital y lambdoidal del cráneo. Para obtener los mejores resultados, se deben utilizar ratones ICR (CD-1) o C57 / BL6 de 6 a 8 semanas de edad para estos experimentos. Se pueden usar ratones más jóvenes; sin embargo, no se recomienda el uso de ratones ICR (CD-1) que tengan más de 8 semanas de edad, ya que sus suturas de la placa del cráneo generalmente están completamente fusionadas a esta edad, lo que hace imposible inyectar sin dañar el cráneo. También es fundamental considerar el peso / tamaño de cada ratón que se someterá a este procedimiento. Se recomienda que estas inyecciones se realicen en animales que tengan un peso superior a 19 g, ya que el cráneo suele ser muy delgado con pesos más bajos y puede no soportar la presión aplicada durante la inyección. De importancia, también hay factores probables que contribuyen a la edad / peso a la que se produce la fusión de la placa del cráneo (por ejemplo, la composición del chow de laboratorio utilizado en las instalaciones de animales). Por lo tanto, los experimentadores pueden necesitar determinar el rango de edad / peso adecuado bajo sus propias condiciones. Se pueden requerir diferentes rangos de edad y pesos de animales para otras cepas o genotipos de ratón, dependiendo de cuándo se fusionen las placas del cráneo en esos animales, y también pueden requerir la optimización de la inyección en sí.

Al aprender o practicar esta técnica, es muy recomendable que se obtenga un nivel de comodidad con la localización de la unión de sutura en ratones sacrificados. Puede ser mejor practicar primero con el cuero cabelludo extirpado o pelado en estos ratones y avanzar lentamente para localizar la unión a través de la piel. Una vez establecida la ubicación precisa, se pueden inyectar tintas y tintes en la duramadre para verificar la precisión de la ubicación y la profundidad de la inyección. Esta técnica fue desarrollada y optimizada utilizando ratones ICR (CD-1) (30-35 g) y ratones C57/BL6 (25-30 g). Una longitud del infusor de 0,5-0,6 mm es suficiente para inyectar un ratón que pesa dentro del rango de 25-35 g. Sin embargo, la longitud del infusor puede necesitar ser calibrada si se inyectan ratones que difieren significativamente de los ratones utilizados para optimizar esta técnica. Por ejemplo, un ratón de menos de 25 g probablemente resultaría en el uso de un infusor que tiene una longitud inferior a 0,5 mm. Al dominar esta técnica y cuando se realiza en ratones apropiados para su edad, la tasa de éxito de esta inyección puede ser cercana al 100%; sin embargo, las complicaciones con la inyección pueden provenir de problemas como romper el cráneo debido a la aplicación de demasiada fuerza para insertar el infusor, así como el sangrado anormal causado por el daño de los vasos sanguíneos meníngeos.

Las alteraciones en la sensibilidad táctil son una medida importante a la hora de evaluar los comportamientos de dolor en roedores. Aquí demostramos el uso de pruebas periorbitarias de von Frey para evaluar estos comportamientos en un modelo preclínico de migraña. Una gran ventaja de utilizar esta técnica en modelos de migraña es que podemos evaluar la hipersensibilidad de la cabeza, que tiene más relevancia que otras localizaciones no craneales como las patas. El paso crítico para garantizar resultados reproducibles es asegurarse de que los ratones estén completamente alineados. Esto requerirá un experimentador bien entrenado que pueda aplicar filamentos von Frey con precisión. Es probable que un animal tarde aproximadamente 7 días en alcanzar la línea de base. Sin embargo, es posible que no todos los animales alcancen la línea de base objetivo. En nuestra experiencia, después de aproximadamente 7 días de trabajo con ratones, solo el 60% -70% de los animales alcanzarán una línea de base de 0,6 g en la región periorbitaria, pero esto depende de la cohorte de animales. Este momento debe considerarse antes de comenzar un experimento para garantizar que se utilice un número suficiente para tener en cuenta la deserción y que los animales tengan la edad adecuada después de la línea de base para usar este método no invasivo para estimular la duramadre. Los pasos para determinar una línea de base se describen en la sección 4 del protocolo.

Una limitación de las pruebas de von Frey es que puede ser difícil distinguir entre las respuestas al dolor y el aseo / picazón de rutina. Para ayudar a distinguir el dolor del aseo, es importante notar la cantidad de tiempo que ocurre este comportamiento. Por lo general, una respuesta al dolor es un golpe después de la aplicación del filamento, mientras que los comportamientos de aseo tienden a prolongarse y pueden durar de varios segundos a minutos. Si el comportamiento de aseo / picazón no se puede distinguir de una respuesta hipersensible, es mejor no registrar esto como una respuesta. Además, la colocación inadecuada del filamento (por ejemplo, el deslizamiento del filamento) puede resultar en un aseo prolongado del animal, lo que dificulta la prueba adecuada. Si esto sucede, el experimentador debe esperar hasta que el aseo se haya detenido y el ratón esté lo suficientemente tranquilo como para probar. Continúe desde el mismo filamento utilizado antes del comienzo del comportamiento de aseo. Si el ratón continúa durante períodos de tiempo muy largos, vuelva a colocarlo en la cámara de prueba durante aproximadamente 5 minutos. Una vez que hayan pasado los 5 minutos, intente probar el mouse nuevamente. Si este comportamiento continúa sin resolución, los ratones deben ser retirados del estudio. De importancia, no se recomienda afeitarse el pelaje en la cara, ya que no está claro si la piel del ratón conserva la misma sensibilidad después de que se elimina el vello, y el proceso de depilación (afeitado, cremas depilatorias) también puede influir en la sensibilidad de la piel.

En la mayoría de las situaciones, es ideal para administrar sustancias en la duramadre no más de 24 h después de que el ratón haya alcanzado la línea de base. Se recomienda que los ratones se sometan a pruebas de filamento von Frey una vez por hora. Si es posible, las pruebas cada dos horas dan tiempo suficiente para que los animales se calmen después de las pruebas. Además, los experimentos deben programarse para no interferir con sus patrones circadianos. Las alteraciones del ritmo circadiano en ratones pueden alterar los fenotipos de comportamiento y, en última instancia, dar lugar a resultados irreproducibles.

Las pruebas periorbitarias de von Frey se pueden usar en combinación con otros ensayos conductuales para fortalecer las conclusiones experimentales. La escala de muecas se basa en expresiones faciales espontáneas en roedores en lugar de respuestas evocadas18,19. Este método tiene una alta precisión y fiabilidad a la hora de evaluar y cuantificar los comportamientos de dolor agudo y se ha utilizado en muchos modelos preclínicos de migraña12,30. Al usar ensayos de grimace y periorbital de von Frey, el experimentador debe considerar la puntuación de la mueca antes de la aplicación de filamentos de von Frey a la región periorbitaria del ratón. Esto asegura que el comportamiento de la mueca sea espontáneo y no evocado por la aplicación de filamentos. La hipersensibilidad mecánica de la pata trasera también se puede utilizar junto con las pruebas periorbitarias de von Frey. Contrariamente a la puntuación de mueca, es mejor probar la hipersensibilidad facial antes de evaluar la hipersensibilidad de la pata trasera. La prueba de pata trasera requiere que el ratón se coloque de nuevo en la cámara sin la copa después de que se complete la prueba periorbitaria de von Frey.

En conclusión, las pruebas periorbitarias de von Frey y la estimulación dural no invasiva en ratones agregan opciones valiosas a la gama actual de modelos preclínicos de migraña. Cuando se realiza correctamente, esta técnica presenta un enfoque refinado para generar un fenotipo similar al dolor de cabeza en roedores, ya que no requiere la implantación quirúrgica de una cánula. En las ratas, las cánulas son propensas a la infección bacteriana, pueden obstruirse, pueden caerse y requieren que cada animal sea de una sola casa, creando un estrés innecesario en el animal. Además, el protocolo de estimulación dural se puede modificar fácilmente para usarlo con varias aplicaciones de medicamentos. Los paradigmas de prueba de von Frey periorbital también se pueden modificar para adaptarse mejor a las especificaciones experimentales. Además, las pruebas periorbitarias de von Frey se pueden usar en otros trastornos del dolor orofacial. Estas técnicas son una herramienta importante para ayudar a comprender mejor los complejos mecanismos subyacentes del dolor de migraña.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NS104200 y NS072204 a GD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 oz Hot Paper Cups Choice Paper Company 5004W https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads Fisherbrand 14-206-65 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula P1 Technologies (formerly Plastics One) 8IC313ISPCXC I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes Hamilton 80008 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm Cole-Palmer EW-96460-10 https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire Custom The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers Custom Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments Touch test/Stoelting 58011 https://www.stoeltingco.com/touch-test.html

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Neurociencia Número 173 migraña duramadre hipersensibilidad facial estimulación no invasiva comportamiento
Estimulación dural y pruebas periorbitarias de von Frey en ratones como modelo preclínico de dolor de cabeza
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Mason, B. N., Avona, A., Lackovic, J., Dussor, G. Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache. J. Vis. Exp. (173), e62867, doi:10.3791/62867 (2021).

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