Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dural stimulering och periorbital von Frey-testning hos möss som en preklinisk modell av huvudvärk

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62867
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1School of Brain and Behavioral Sciences and Center for Advanced Pain Studies, University of Texas at Dallas

Summary

Det mest anmärkningsvärda symptomet på migrän är svår huvudsmärta, och det antas att detta förmedlas av sensoriska neuroner som innerverar hjärnhinnorna. Här presenterar vi en metod för att lokalt applicera ämnen på dura på ett minimalt invasivt sätt samtidigt som man använder ansiktsöverkänslighet som utgång.

Abstract

Kranialmeningarna, som består av dura mater, araknoid och pia mater, tros främst tjäna strukturella funktioner för nervsystemet. Till exempel skyddar de hjärnan från skallen och förankrar / organiserar den vaskulära och neuronala tillförseln av cortex. Hjärnhinnorna är emellertid också inblandade i nervsystemet störningar såsom migrän, där smärtan som upplevs under migrän tillskrivs lokal steril inflammation och efterföljande aktivering av lokala nociceptiva afferenter. Av skikten i hjärnhinnorna är dura mater av särskilt intresse för patofysiologin hos migrän. Det är mycket vaskulariserat, har lokala nociceptiva neuroner och är hem för ett varierat utbud av bosatta celler som immunceller. Subtila förändringar i den lokala meningeala mikromiljön kan leda till aktivering och sensibilisering av durala perivaskulära nociceptorer, vilket leder till migränsmärta. Studier har försökt ta itu med hur durala afferenter aktiveras / sensibiliseras genom att använda antingen in vivo elektrofysiologi, bildteknik eller beteendemodeller, men dessa kräver vanligtvis mycket invasiva operationer. Detta protokoll presenterar en metod för jämförelsevis icke-invasiv applicering av föreningar på dura mater hos möss och en lämplig metod för att mäta huvudvärkliknande taktil känslighet med hjälp av periorbital von Frey-testning efter dural stimulering. Denna metod upprätthåller integriteten hos dura och skalle och minskar förvirrande effekter från invasiva tekniker genom att injicera ämnen genom en 0,65 mm modifierad kanyl vid korsningen av osmälta sagittala och lambdoidsuturer. Denna prekliniska modell kommer att göra det möjligt för forskare att undersöka ett brett spektrum av durala stimuli och deras roll i den patologiska utvecklingen av migrän, såsom nociceptoraktivering, immuncellsaktivering, vaskulära förändringar och smärtbeteenden, samtidigt som skadefria tillstånd för skallen och hjärnhinnorna upprätthålls.

Introduction

Migränsmärta är fortfarande ett stort folkhälsoproblem över hela världen. Världshälsoorganisationen rankar den som den sjätte vanligaste sjukdomen i världen, som drabbar knappt 15% av jordens befolkning1 och orsakar en betydande socioekonomisk börda för samhället 2,3. Behandlingsalternativ och deras effekt har varit suboptimala och ger endast symtomatisk lindring och modifierar inte signifikant patofysiologiska händelser som under migrän förekommer 4,5. Bristen på behandlingsframgång beror sannolikt på att migrän är en multifaktoriell störning vars patologi är dåligt förstådd, vilket leder till ett begränsat antal terapeutiska mål. Migrän är också utmanande att fullt ut fånga i djurmodeller, särskilt med tanke på att migrändiagnos görs baserat på verbal kommunikation med patienter som beskriver sin erfarenhet av migränkännetecken som aura, huvudvärk, fotofobi och allodyni. Trots detta är det viktigt att notera att de senaste framstegen inom migränbehandlingar för närvarande överträffar behandlingar för många neurologiska tillstånd som har validerats väl av prekliniska modeller. Till exempel har monoklonala antikroppar och små molekyler som riktar sig mot kalcitoningenrelaterad peptid eller dess receptor varit mycket framgångsrika för att förbättra livskvaliteten hos migränpatienter och kan potentiellt förändra den kliniska hanteringen av migrän. Även om det har skett framsteg när det gäller att förstå denna sjukdom, fortsätter det att finnas mycket kvar att belysa.

Baserat på prekliniska djurmodeller och mänskliga studier är det allmänt accepterat att migränhuvudvärk initieras av avvikande aktivering av nociceptiva fibrer i hjärnhinnorna som signalerar genom trigeminus- och övre cervikala dorsalrotganglierna 6,7,8,9,10. Trots denna teori använder många studier fortfarande systemisk administrering av läkemedel för att förstå underliggande bidragande mekanismer vid migrän. Medan systemisk dosering av läkemedel har stärkt vår förståelse väsentligt, bedömer dessa resultat inte direkt om lokala åtgärder inom målvävnaden av intresse spelar en roll i migrän. Omvänt har flera studier tagit ett tillvägagångssätt för att stimulera dura; Dessa experiment kräver emellertid kanylimplantation via en invasiv kraniotomi och förlängd återhämtning gånger 11,12. På grund av dessa begränsningar utvecklade vi ett minimalt invasivt tillvägagångssätt för att lokalt stimulera dura där bristen på kraniotomi eliminerar postkirurgisk återhämtning och möjliggör omedelbar testning på vakna djur 12,13,14. Dessa injektioner utförs under lätt isoflurananestesi och administreras vid korsningen av sagittal- och lambdoidsuturerna hos möss.

Flera metoder har utvecklats för att utvärdera nociceptiva beteendemässiga svar hos gnagare15. Kutan allodyni har rapporterats hos cirka 80 % av migränpatienterna16,17 och utgör ett potentiellt translationellt effektmått för användning hos gnagare. I prekliniska modeller har appliceringen av von Frey-filament på plantarregionen hos gnagaretassen använts för att bedöma smärtbeteenden i prekliniska migränmodeller. Den primära begränsningen av detta tillvägagångssätt är att det inte testar den cefaliska regionen. Ansikts grimaspoäng har använts för att fånga smärtbeteenden hos gnagare genom att analysera ansiktsuttryck efter induktion av smärtstimuli18,19. Dess begränsningar inkluderar emellertid endast att fånga svar på akuta stimuli och inte kroniska orofaciala smärttillstånd. Ansiktsvård och minskad uppfödning betraktas också som resultat av beteendemässiga svar i prekliniska modeller av migrän20,21. Begränsningar av den förra inkluderar svårigheter att skilja smärtsvar från normal rutinmässig grooming och andra känslor som klåda. När det gäller det senare minskar uppfödningsbeteenden vanligtvis snabbt efter införandet av gnagare till nya miljöer. Även om var och en av dessa beteendemässiga slutpunkter är värdefulla för förståelsen av olika mekanismer som bidrar till smärttillstånd, finns det ett kritiskt behov av prekliniska modeller av smärtstörningar som migrän för att inkludera slutpunkter som specifikt fångar cefaliska överkänslighetssvar. Att bedöma taktil överkänslighet hos periorbital hud efter dural stimulering är en metod som kan ge bättre insikt i mekanismer som bidrar till migrän där sensoriska symtom är övervägande cefaliska till sin natur. Här beskriver vi en metod för att administrera ämnen på musdera som en preklinisk modell av migrän. Efter dural applicering presenterar vi också en detaljerad metod för att testa periorbital taktil överkänslighet med hjälp av kalibrerade von Frey-filament som tillämpas i Dixon upp-ner-metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden genomfördes med förhandsgodkännande av den institutionella djurvårds- och användningskommittén vid University of Texas i Dallas. ICR (CD-1) (30-35 g) och C57/BL6 (25-30 g) möss i åldern 6-8 veckor användes i denna studie.

1. Dural infuserare

  1. Skapa musinfuserare/injektorer genom att modifiera en kommersiellt tillgänglig inre kanyl och infusionsflock för ensidiga injektioner med ett icke-metalliskt smält kiseldioxidplastlock som är justerbart och sätts in i/sträcker sig under en 28 G styrkant med en innerdiameter (I.D.) på 0,18 mm och en ytterdiameter (O.D.) på 0,35 mm (Figur 1A).
  2. Använd en bromsok eller annan mätanordning för att justera det smälta kiseldioxidplastlocket på infusionsenheten till en längd av 0,6 mm; mätt från infusionsörens spets till kanten av kiseldioxidplastlocket.
    1. Var försiktig så att du inte böjer eller slöar infusionsugnen när du justerar plastlocket.
    2. För andra musstammar som inte tidigare har använts för duralinjektioner, bestäm den optimala infusionslängden genom att ställa in längden till 0,6 mm och genomföra pilotinjektioner med bläck eller färgämne, justera infusionslängden tills det observeras att färgämnet endast finns i dura mater och inte på hjärnan eller skallen.
  3. Fäst den långa änden (eller änden som inte mättes vara 0,6 mm) på den justerade infusionsören på plaströr (pumprör, 2-stopp, I.D. 0,19 mm, längd 406 mm).
    1. Skär slangen till en minsta längd av 8 in för att säkerställa att det finns tillräckligt med linje för att hålla en volym på 5 μL.
    2. Se till att slangen täcker metalldelen och toppen av plastproppen som ligger på infusionsören. Detta hjälper till att förhindra att luftbubblor ackumuleras i linjen.
  4. Fäst den andra änden av slangen på en 10 μL glasmikrosyring (gastät; cementerad nål; 21 G med en 10 mm projektion), igen, se till att ha en tät tätning över sprutans metalldel (figur 1A).
  5. När linjen är ansluten, fyll på sprutan med 5 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS), syntetisk interstitiell vätska (SIF) eller andra valfria fordon för att förhindra att luftbubblor bildas.
    1. Om luftbubblor observeras i linjen, översvämma linjen med fordonet tills bubblorna har försvunnit.
      OBS: Det kan hjälpa att fylla sprutan med fordonet innan du fäster den på linjen och sedan trycka vätskan genom linjen när den är ansluten.
  6. Efter att linjen har fyllts på med 5 μL av fordonet och fungerar effektivt, ladda 5 μL av läkemedlet / lösningen i Hamilton-sprutan (bläck eller färgämne kan användas som ett alternativ till läkemedlet / lösningen om du lär dig eller övar denna teknik).
    1. Se till att alla fordonslösningar som administreras på dura hålls vid pH 7,4 och mäts till en osmolalitet på 310. Detta minskar den potentiella aktiveringen av syraavkännande jonkanaler och andra osmoskänsliga kanaler inom dura.
  7. Den maximala volymen som testats på möss som inte orsakade läckage i hjärnan är ungefär 10 μL. Beteendeeffekterna efter injektioner med denna volym har inte testats. Av denna anledning administrera endast 5 μL av lösningen på dura.
    OBS: Dessa observationer är baserade på musstammarna / åldrarna / vikterna hos 6-8 veckor gamla CD1 / ICR-möss.

2. Dural injektioner

  1. När sprutan är beredd och läkemedlet är laddat, placera en mus platt på buken och bedöva den under kort 3% isofluran med en syreflödeshastighet på 0,5-1 L / min via nosecone.
    1. När musen inte längre visar en nypa reflex, justera anestesin och upprätthålla den vid en 1,5% isofluran.
  2. När du har bedövat, applicera steril optalmisk salva på ögonen och raka djurets huvud och desinficera sedan huden med povidonjod och etanol. Efter detta, kom i en position som bidrar till en framgångsrik injektion.
  3. Använd ena handen för att stabilisera djurets huvud och håll infuseraren med den andra handen.
  4. Undersök försiktigt och lokalisera korsningen mellan sagittala och lambdoidala suturer på musens skalle (figur 1B, C).
    1. För att lokalisera denna diskreta korsning genom huden, använd de topografiska egenskaperna hos skallen och försiktigt undersöka den allmänna platsen för korsningen med infusionsören.
    2. Kontrollera korsningens position genom att placera infusionsören längs skallen och känna efter den exakta platsen.
  5. När suturen är placerad och infusionsern är på plats, vicka mycket långsamt och försiktigt infuseraren fram och tillbaka tills den tränger igenom huden och faller ner i korsningen hela vägen upp till plastproppen.
    OBS: Se till att sätta in hela 0,6 mm spetsen på infusionsören i korsningen.
  6. För att verifiera noggrannheten, använd bläck eller färgämne som injektionslösning och avliva och halshugg musen.
    1. Ta bort skalllocket för att visualisera färgämnet i dura mater (Figur 1C).
      OBS: Färgämne bör inte observeras på hjärnan eller utsidan av skallen. På samma sätt bör möss i alla experiment kontrolleras post-mortem för att verifiera injektionens noggrannhet samt för att säkerställa att integriteten hos dura mater var oskadad.
  7. Efter injektionen, ta bort musen från anestesi, vänta tills den återfår medvetandet och återgår sedan till sin bur eller placera den i en testkammare för att påbörja de önskade analyserna.
    OBS: Låt musen återhämta sig från anestesi i minst 30 minuter innan du gör några beteendeexperiment.

3. Periorbital von Frey

  1. Börja studien med en kohort av cirka 16-20 möss.
  2. En dagen före tillvänjning, hantera varje mus i minst 5 min.
  3. Cirka 24 timmar efter hantering, vana mössen till testrumsförhållandena och von Frey-testapparaten (figur 2A).
    OBS: Akryltestapparaten består av enskilda fack med lock som är ungefär 3 i x 3,5 i x 5 in (B x H x D) och stöds av aluminiumstativ anslutna via 0,25 i 19 G kvadratisk galvaniserad stålnättråd.
    1. Placera mössen i en horisontellt placerad 4-oz vit papperskopp som är luktfri och inte innehåller polythen eller paraffinvax.
      OBS: Dessa typer av koppar är att föredra eftersom det minskar gastrointestinal upprördhet hos mössen vid intag (Figur 2B).
  4. Medan djuren är i sina respektive kamrar, placera en pellets av den normala chowdieten i den enskilda kammaren hos varje mus för att lugna djuren och undvika onödig stress för djuren. Gör detta i 3 dagar före någon von Frey beteendetest.
    1. Se till att varje gång mössen är i kammaren att det finns tillgång till mat.
    2. Numredera och tilldela varje djur till samma utrymme i teststället. Placera musen i samma kopp varje dag under testperioden för att säkerställa att varje djur acklimatiseras till sin testmiljö.
      OBS: Möss kommer att gnaga på kopparna och därefter förstöra kopparna. Om detta skulle hända, byt ut koppen och märk den med motsvarande musnummer.
  5. Efter de första 3 dagarna av tillvänjning, placera mössen i sina enskilda kamrar.
    1. Låt djuren acklimatisera sig till testrummet och kamrarna i minst 1 timme före eventuella von Frey-tester så att mössen kan lugna sig och därefter är lättare att testa.
  6. Efter acklimatisering till rummet på testdagen, ta bort en mus medan den fortfarande är i sin kopp från respektive kammare.
    1. Håll koppen i horisontellt läge så att musen är på både framtassar och baktassar för att hålla vikten jämnt fördelad.
      OBS: Ojämn viktfördelning kan förändra djurets svar och till och med förhindra att djur svarar.
  7. Placera koppen med musen inuti på bordet under teststället på den absorberande dynan.
  8. För periorbital von Frey-testning, placera 0,07 g von Frey-filamentet direkt i mitten av ansiktet och mellan ögonen.
  9. Applicera tillräckligt med tryck på glödtråden för att få von Frey-håret att böja sig till en "C" -formad formation.
    1. Håll kontakten med regionen minst 3 s men inte mer än 5 s eller tills musen drar tillbaka huvudet och sveper mot filamentet med sin tass.
      OBS: Om filamentet glider eller mer än filamentets spets berör djuret under testningen, bör inga svar räknas. Dessa svar kan vara som svar på borsten som aktiveras av olika mekanoreceptorer och därför kanske inte återspeglar exakta resultat.
    2. Applicera von Frey-filament enligt Dixon "upp-ner" -metoden 22,23.
      1. Applicera ursprungligen von Frey-filamentet som har en vikt av 0,07 g. Det lägsta möjliga filamentet och det högsta testade filamentet i denna studie är filament med vikter på 0,008 g respektive 0,6 g.
      2. Använd filamenten med vikt 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g och 0,6 g för att utföra denna analys.
      3. I denna metod, om ett djur inte uppvisar ett svar på filamentet, applicera filamentet av nästa högre gramvikt.
      4. Om musen svarar på en glödtråd, tänk på att musen svarar på det filamentet. Om så är fallet, applicera filamentet av nästa lägre gramvikt.
      5. Upprepa detta mönster tills djuret har testats 4 gånger efter det första svaret eller djuret har fastställts inte svara på filament som testats i analysen.
        OBS: Avstå från att applicera ytterligare tryck som härrör från armen eller handleden. En skala kan användas för att öva appliceringen av filamentet.

4. Testning av tröskelvärden för uttag vid baslinjen

  1. Innan du ingår i ett experiment, se till att mössen når en baslinjeuttagströskel mellan 0,5-0,6 g.
    1. En mus når baslinjen om den inte svarar på något filament som testats i serien som nämns i steg 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g och 0,6 g).
  2. Testa möss dagligen när du fastställer tröskelvärden för uttag vid baslinjen.
    1. Testning gör det möjligt för djur att acklimatisera sig till testförhållandena och trycket från von Frey-filamenten.
    2. Om mössen fortfarande är extremt överkänsliga efter den tredje testdagen, försök vänta 1 eller 2 dagar innan du testar igen.
      OBS: För mycket tid mellan testdagarna kan leda till att djuret inte anpassar sig till filamentets vikt på sin periorbitala region och därmed inte når den riktade uttagströskeln.
  3. Testa möss i cirka 7 dagar innan du fastställer vilka djur som inte uppfyller inklusionskriterierna för ett experiment.
    OBS: Cirka 70% av mössen kommer att nå den riktade baslinjenivån.
    1. Före dural stimulering, analysera baslinjedata för att utesluta alla musar som inte har nått ett baslinjevärde på 0,5-0,6 gram eller högre.
    2. Efter uteslutning allokerar du slumpmässigt varje återstående mus till en testgrupp. Uppnå detta genom att rita ur en kopp eller skriva ett skript på ett kalkylblad för att slumpa siffror till en grupp.

5. Analys av von Frey-resultat

  1. När svarsserien har erhållits, bestäm delta-, k-värdet, 50% -tröskeln och uttagströskeln i gram enligt tidigare publicerade metoder24.
  2. Beräkna uttagströskeln med denna formel WT = 10 (x * F + B), där WT = uttagströskel, F = tassuttagströskel beräknad via Chaplan-metoden och B = linjär regression av logg (böjkraft) = x * Filamentnummer + B.
  3. Plotta data som antingen 50% uttagströskel eller genomsnittlig uttagsgräns i gram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna injektionsmetod används för att administrera stimuli på dura av möss så att efterföljande beteendetestning kan inträffa. Den vanligaste beteendeproduktionen som mäts med denna modell är kutan ansiktsöverkänslighet bedömd via von Frey 12,13,14. Här visar vi hur denna modell kan användas för att bedöma potentiella könsspecifika bidrag till migränpatologi (Figur 3).

Denna procedur har använts för att undersöka effekterna av dural prolaktin (PRL) på mekaniskt framkallad ansiktsöverkänslighet14 (Figur 3). Resultaten av denna studie visade att kvinnliga ICR-möss visar signifikant minskade tröskelvärden för ansiktsuttag som svar på 5 μg dural prolaktin (figur 3A). En tio gånger lägre dos på 0,5 μg prolaktin (PRL) visade också svar som liknade hög dos PRL (figur 3B).

Dessa injektioner har också visat sig producera spontana smärtrelaterade beteenden bedömda via grimas. Dural 0,5 μg PRL orsakade signifikant grimasering hos kvinnliga möss (figur 3C), vilket ytterligare visar en tydlig roll för dural PRL i kvinnliga migränliknande beteenden. Vi utförde grimasanalyser före alla tester med von Frey-filament.

Figure 1
Figur 1: Dural infuserare och injektionsplacering. (A) Injektorerna/infusatorerna består av en modifierad kanyl justerad till längden ~ 0,5 mm- 0,65 mm och fäst vid en nål cementerad på en 10 μL gastät spruta via tygonrör. (B) Flygbild av markerad placering på injektionsstället på musens huvud. (C) (Vänster panel) Diagram över platsen för dural injektionen. Placeringen av injektionen sker vid korsningen av lambdoid- och sagittalsuturerna vid ungefär 4,8 mm bakre delen av bregma. (Mittpanel) Post-mortem flygfoto av en musskalle efter dural injektion av 5 μL blått injektionsfärgämne. (Höger panel) Separation av musskalotten från hjärnan. Det fanns inget observerbart läckage av blått injektionsfärgämne på hjärnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: von Frey Testkammare. (A) von Frey testkammare bestående av 3,5 i x 3,5 i enskilda akrylkammare med lock placerade på ett trådnätställ. Dessa är anslutna via kolumner med 10 kamrar organiserade i 2 rader. (B) Exempel på möss i sina enskilda koppar inrymda i von Frey-testkamrarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Dural applicering av prolaktin inducerar beteendemässiga svar hos möss. Mekaniska uttagströsklar bedömdes efter dural applicering av PRL (5 μg eller 0,5 μg) hos honmöss. A) Applicering av 5 μg PRL (n = 7 PRL, n = 6 fordon) inducerade ansiktsöverkänslighet jämfört med fordonet. (B) Applicering av 0,5 μg PRL (n = 5 PRL, n = 4 fordon) inducerade långvarig överkänslighet i ansiktet. (C) Grimas bedömdes också hos samma möss som behandlades med 0,5 μg PRL vid varje tidpunkt. Dessa möss uppvisade signifikant högre grimaspoäng jämfört med mössen som behandlades med fordon. Statistik: Tvåvägs ANOVA följt av Bonferroni multipel jämförelse post-hoc analys. Data representeras som medel ± SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Maladaptiva förändringar i det lokala nociceptiva systemet i dura anses vara en viktig bidragsgivare till huvudvärksfasen av migränattacker trots brist på vävnadsskada 25,26. Här presenterar studien en metod där minimalt invasiv stimulering av dura kan inducera ansiktstaktil överkänslighet. Att belysa de mekanismer och händelser som är involverade i dural nociceptoraktivering utan att orsaka skador på kraniet och vävnaderna kan mer exakt återspegla migränmekanismer i en preklinisk modell.

Kraniotomi och kanylimplantation har länge använts för att bedöma funktioner och mekanismer som bidrar till migränsmärta11,12. Det har emellertid rapporterats att en kraniotomi kan inducera aktivering av duralmastceller och öka pial vaskulär permeabilitet hos gnagare27. Med tanke på att mastcellaktivering i dura är mycket inblandad i migrän 7,8,28,29, har denna teknik stora försiktighetsåtgärder som kan snedvrida tolkningen. Administrering av substanser genom korsningen av sagittala och lambdoidala suturer minskar effektivt aktiveringen av nociceptorer medierade genom kraniotomiinducerad mastcellsaktivering. Dessutom kräver icke-invasiv duralstimulering inte postkirurgisk återhämtning och administrering av smärtstillande medel som kan förändra tolkningen av resultaten. Lokal applicering av ämnen på dura gör det möjligt för forskare att fokusera på denna specifika målvävnad, i motsats till systemisk administrering av läkemedel där verkningsstället inte lättbestäms 12,13,14. Medan systemisk administrering av ämnen som nitroglycerin och kalcitoningenrelaterad peptid utlöser experimentella attacker hos människor som liknar migrän, tillåter de inte bedömning av verkningsplatsen i gnagarmodeller. mer riktade vävnadsspecifika modeller erbjuder ett alternativt tillvägagångssätt.

Denna teknik som beskrivs här innebär att man injicerar ett läkemedel eller annan lösning direkt på hjärnhinnornas dura mater genom korsningen där skallens sagittala och lambdoidala suturer möts. För bästa resultat bör ICR (CD-1) eller C57/BL6 möss i åldern 6-8 veckor användas för dessa experiment. Yngre möss kan användas; Användningen av ICR (CD-1) möss som är äldre än 8 veckor rekommenderas dock inte eftersom deras skalleplattsuturer vanligtvis är helt smälta av denna ålder, vilket gör det omöjligt att injicera utan att skada skallen. Det är också viktigt att överväga vikten / storleken på varje mus som kommer att genomgå denna procedur. Det rekommenderas att dessa injektioner utförs på djur som har en vikt större än 19 g eftersom skallen vanligtvis är mycket tunn vid lägre vikter och kanske inte tål det tryck som appliceras under injektionen. Av betydelse finns det också sannolika faktorer som bidrar till den ålder / vikt vid vilken skalleplattfusion sker (t.ex. sammansättningen av lab chow som används i djuranläggningar). Därför kan experimenter behöva bestämma ålders- / viktintervallet som är lämpligt under sina egna förhållanden. Olika åldersintervall och djurvikter kan krävas för andra musstammar eller genotyper, beroende på när skallplattorna smälter samman i dessa djur, och kan också kräva optimering av själva injektionen.

När man lär sig eller övar denna teknik rekommenderas det starkt att en nivå av komfort erhålls med lokalisering av suturkorsningen hos avlivade möss. Det kan vara bäst att först öva med hårbotten utskuren eller skalad tillbaka i dessa möss och långsamt gå vidare för att lokalisera korsningen genom huden. När du har fastställt den exakta platsen kan bläck och färgämnen injiceras i dura för att verifiera platsnoggrannhet och injektionsdjup. Denna teknik utvecklades och optimerades med ICR (CD-1) möss (30-35 g) och C57 / BL6 möss (25-30 g). En infusionslängd på 0,5-0,6 mm är tillräcklig för att injicera en mus som väger inom intervallet 25-35 g. Infuserarens längd kan dock behöva kalibreras om man injicerar möss som skiljer sig avsevärt från mössen som används för att optimera denna teknik. Till exempel skulle en mus mindre än 25 g sannolikt resultera i användning av en infusionsmedel som har en längd mindre än 0,5 mm. Vid mastering av denna teknik och när den utförs i åldersanpassade möss kan framgångsgraden för denna injektion vara nära 100%; Komplikationer med injektionen kan dock bero på problem som att bryta skallen på grund av att man applicerar för mycket kraft för att sätta in infusionsern samt onormal blödning orsakad av skadliga meningeala blodkärl.

Förändringar i taktil känslighet är ett viktigt mått vid bedömning av smärtbeteenden hos gnagare. Här demonstrerar vi användningen av periorbital von Frey-testning för att bedöma dessa beteenden i en preklinisk migränmodell. En stor fördel med att använda denna teknik i migränmodeller är att vi kan bedöma överkänslighet hos huvudet, vilket har mer relevans än andra icke-kraniella platser som tassar. Det kritiska steget för att säkerställa reproducerbara resultat är att se till att mössen är helt baslinjerade. Detta kommer att kräva en välutbildad experimenter som kan applicera von Frey-filament exakt. Det är troligt att det kommer att ta cirka 7 dagar för ett djur att nå baslinjen. Det är dock möjligt att inte alla djur kommer att nå den riktade baslinjen. Enligt vår erfarenhet, efter cirka 7 dagars arbete med möss, kommer endast 60% -70% av djuren att nå en baslinje på 0,6 g i periorbitalregionen, men detta är beroende av kohorten av djur. Denna tidpunkt bör övervägas innan ett experiment påbörjas för att säkerställa att tillräckligt många används för att ta hänsyn till bortfall och att djur är rätt ålder efter baslinjen för att använda denna icke-invasiva metod för att stimulera dura. Stegen för att fastställa en baslinje beskrivs i protokollavsnitt 4.

En begränsning för von Frey-testning är att det kan vara svårt att skilja mellan smärtsvar och rutinmässig grooming / klåda. För att skilja smärta från grooming är det viktigt att märka hur länge detta beteende inträffar. Vanligtvis är ett smärtsvar ett svep efter filamentapplikationen, medan groomingbeteenden tenderar att förlängas och kan pågå i flera sekunder till minuter. Om grooming/klåda-beteendet inte kan särskiljas från ett överkänsligt svar är det bäst att inte registrera detta som ett svar. Dessutom kan felaktig filamentplacering (t.ex. filamentglidning) leda till långvarig grooming av djuret, vilket gör det svårt att testa ordentligt. Om detta händer bör experimenteraren vänta tills grooming har slutat och musen är lugn nog att testa. Fortsätt från samma filament som användes före början av groomingbeteendet. Om musen fortsätter under mycket långa anfall, placera musen tillbaka i testkammaren i cirka 5 minuter. När de 5 minuterna har gått, försök testa musen igen. Om detta beteende fortsätter utan någon lösning måste mössen tas bort från studien. Av betydelse rekommenderas det inte att raka pälsen i ansiktet eftersom det är oklart om mushuden behåller samma känslighet efter att håret har tagits bort, och processen för hårborttagning (rakning, hårborttagningskrämer) kan också påverka hudens känslighet.

I de flesta situationer är den idealisk för administrering av ämnen på dura högst 24 timmar efter att musen har nått baslinjen. Det rekommenderas att möss utsätts för von Frey-filamenttestning en gång i timmen. Om möjligt ger testning varannan timme tillräckligt med tid för djuren att lugna sig efter testningen. Dessutom bör experiment tidsenseras för att inte störa deras cirkadiska mönster. Förändringar i dygnsrytmen hos möss kan förändra beteendefenotyper och i slutändan resultera i irreproducerbara resultat.

Periorbital von Frey-testning kan användas i kombination med andra beteendeanalyser för att stärka experimentella slutsatser. Grimasskalan bygger på spontana ansiktsuttryck hos gnagare snarare än framkallade svar 18,19. Denna metod har hög noggrannhet och tillförlitlighet vid bedömning och kvantifiering av akuta smärtbeteenden och har använts i många prekliniska modeller av migrän12,30. Vid användning av både grimas och periorbital von Frey-analyser bör experimenteraren överväga att göra poäng för grimas innan von Frey-filament tillämpas på musens periorbitala region. Detta säkerställer att det grimaserande beteendet är spontant och inte framkallas av filamentapplikation. Hindpaw mekanisk överkänslighet kan också användas i samband med periorbital von Frey-testning. I motsats till grimaspoäng är det bäst att testa ansiktsöverkänslighet innan man bedömer överkänslighet i baktassen. Hindpaw-testning kräver att musen placeras tillbaka i kammaren utan koppen efter att periorbital von Frey-testningen är klar.

Sammanfattningsvis lägger periorbital von Frey-testning och icke-invasiv duralstimulering hos möss värdefulla alternativ till det nuvarande utbudet av prekliniska modeller av migrän. När den utförs korrekt presenterar denna teknik ett förfinat tillvägagångssätt för att generera en huvudvärkliknande fenotyp hos gnagare, eftersom den inte kräver kirurgisk implantation av en kanyl. Hos råttor är kanyler utsatta för bakteriell infektion, kan bli igensatta, kan falla av och kräver att varje djur är enhus, vilket skapar onödig stress på djuret. Dessutom kan duralstimuleringsprotokollet enkelt modifieras för att användas med flera läkemedelsapplikationer. Periorbital von Frey testparadigmer kan också modifieras för att bäst passa de experimentella specifikationerna. Dessutom kan periorbital von Frey-testning användas vid andra orofaciala smärtstörningar. Dessa tekniker är ett viktigt verktyg för att ytterligare förstå de komplexa underliggande mekanismerna för migränsmärta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NS104200 och NS072204 till GD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 oz Hot Paper Cups Choice Paper Company 5004W https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads Fisherbrand 14-206-65 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula P1 Technologies (formerly Plastics One) 8IC313ISPCXC I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes Hamilton 80008 https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm Cole-Palmer EW-96460-10 https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire Custom The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers Custom Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments Touch test/Stoelting 58011 https://www.stoeltingco.com/touch-test.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD 2016 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Woldeamanuel, Y. W., Cowan, R. P. Migraine affects 1 in 10 people worldwide featuring recent rise: A systematic review and meta-analysis of community-based studies involving 6 million participants. Journal of the Neurological Sciences. 372, 307-315 (2017).
  3. Burch, R. C., Loder, S., Loder, E., Smitherman, T. A. The prevalence and burden of migraine and severe headache in the United States: updated statistics from government health surveillance studies. Headache. 55 (1), 21-34 (2015).
  4. Ashina, M. Migraine. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1866-1876 (2020).
  5. Ashina, M., et al. Migraine: integrated approaches to clinical management and emerging treatments. Lancet. 397 (10283), 1505-1518 (2021).
  6. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: Moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  7. Koyuncu Irmak, D., Kilinc, E., Tore, F. Shared Fate of Meningeal Mast Cells and Sensory Neurons in Migraine. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 136 (2019).
  8. Levy, D. Migraine pain, meningeal inflammation, and mast cells. Current Pain and Headache Reports. 13 (3), 237-240 (2009).
  9. Levy, D., Labastida-Ramirez, A., MaassenVanDenBrink, A. Current understanding of meningeal and cerebral vascular function underlying migraine headache. Cephalalgia. 39 (13), 1606-1622 (2019).
  10. Phebus, L. A., Johnson, K. W. Dural inflammation model of migraine pain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  11. Fried, N. T., Maxwell, C. R., Elliott, M. B., Oshinsky, M. L. Region-specific disruption of the blood-brain barrier following repeated inflammatory dural stimulation in a rat model of chronic trigeminal allodynia. Cephalalgia. 38 (4), 674-689 (2018).
  12. Avona, A., et al. Dural calcitonin gene-related peptide produces female-specific responses in rodent migraine models. The Journal of Neuroscience. 39 (22), 4323-4331 (2019).
  13. Burgos-Vega, C. C., et al. Non-invasive dural stimulation in mice: A novel preclinical model of migraine. Cephalalgia. 39 (1), 123-134 (2019).
  14. Avona, A., et al. Meningeal CGRP-Prolactin interaction evokes female-specific migraine behavior. Annals of Neurology. 89 (6), 1129-1144 (2021).
  15. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  16. Lipton, R. B., et al. Cutaneous allodynia in the migraine population. Annals of Neurology. 63 (2), 148-158 (2008).
  17. Goadsby, P. J. Migraine, allodynia, sensitisation and all of that. European Neurology. 53, Suppl 1 10-16 (2005).
  18. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  19. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  20. Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 11 (2019).
  21. Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central CGRP mechanisms. The journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
  22. Dixon, W. J., Mood, A. M. A method for obtaining and analyzing sensitivity data. The Journal of the American Statistical Association. 43 (241), 109-126 (1948).
  23. Dixon, W. The up-and-down method for small samples. The Journal of the American Statistical Association. 60, (1965).
  24. Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Molecular Pain. 10, 26 (2014).
  25. Ramachandran, R. Neurogenic inflammation and its role in migraine. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 301-314 (2018).
  26. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K. Does inflammation have a role in migraine. Nature Reviews Neurology. 15 (8), 483-490 (2019).
  27. Stokely, M. E., Orr, E. L. Acute effects of calvarial damage on dural mast cells, pial vascular permeability, and cerebral cortical histamine levels in rats and mice. Journal of Neurotrauma. 25 (1), 52-61 (2008).
  28. Theoharides, T. C., Donelan, J., Kandere-Grzybowska, K., Konstantinidou, A. The role of mast cells in migraine pathophysiology. Brain Research Reviews. 49 (1), 65-76 (2005).
  29. Conti, P., et al. Progression in migraine: Role of mast cells and pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. European Journal of Pharmacology. 844, 87-94 (2019).
  30. Rea, B. J., et al. Peripherally administered calcitonin gene-related peptide induces spontaneous pain in mice: implications for migraine. Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).

Tags

Neurovetenskap nummer 173 migrän dura mater ansiktsöverkänslighet icke-invasiv stimulering beteende
Dural stimulering och periorbital von Frey-testning hos möss som en preklinisk modell av huvudvärk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mason, B. N., Avona, A., Lackovic,… More

Mason, B. N., Avona, A., Lackovic, J., Dussor, G. Dural Stimulation and Periorbital von Frey Testing in Mice As a Preclinical Model of Headache. J. Vis. Exp. (173), e62867, doi:10.3791/62867 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter