Durale Stimulation und periorbitale von Frey-Tests bei Mäusen als präklinisches Modell von Kopfschmerzen

Summary

Das bemerkenswerteste Symptom der Migräne sind starke Kopfschmerzen, und es wird angenommen, dass dies durch sensorische Neuronen vermittelt wird, die die Hirnhäute innervieren. Hier stellen wir eine Methode vor, um Substanzen auf minimal-invasive Weise lokal auf die Dura aufzutragen, während die Überempfindlichkeit des Gesichts als Ausgang verwendet wird.

Abstract

Es wird angenommen, dass die kranialen Hirnhäute, bestehend aus Dura mater, Spinnentier und Pia mater, in erster Linie strukturelle Funktionen für das Nervensystem erfüllen. Sie schützen beispielsweise das Gehirn vor dem Schädel und verankern/organisieren die vaskuläre und neuronale Versorgung des Kortex. Die Hirnhäute sind jedoch auch an Erkrankungen des Nervensystems wie Migräne beteiligt, bei denen die während einer Migräne auftretenden Schmerzen auf lokale sterile Entzündungen und die anschließende Aktivierung lokaler nozizeptiver Afferenzen zurückzuführen sind. Von den Schichten in den Hirnhäuten ist die Dura mater von besonderem Interesse in der Pathophysiologie der Migräne. Es ist stark vaskularisiert, beherbergt lokale nozizeptive Neuronen und beherbergt eine Vielzahl von ansässigen Zellen wie Immunzellen. Subtile Veränderungen in der lokalen meningealen Mikroumgebung können zur Aktivierung und Sensibilisierung von duralen perivaskulären Nozizeptoren führen, was zu Migräneschmerzen führt. Studien haben versucht zu untersuchen, wie durale Afferenzen aktiviert / sensibilisiert werden, indem entweder in vivo Elektrophysiologie, bildgebende Verfahren oder Verhaltensmodelle verwendet werden, aber diese erfordern in der Regel sehr invasive Operationen. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur vergleichsweise nicht-invasiven Applikation von Verbindungen auf der Dura mater bei Mäusen und eine geeignete Methode zur Messung der kopfschmerzähnlichen taktilen Empfindlichkeit mittels periorbitaler von-Frey-Tests nach duraler Stimulation dar. Diese Methode erhält die Integrität der Dura und des Schädels und reduziert verwirrende Effekte von invasiven Techniken, indem Substanzen durch eine 0,65 mm modifizierte Kanüle an der Verbindung von unverschmolzenen sagittalen und lambdoiden Nähten injiziert werden. Dieses präklinische Modell wird es den Forschern ermöglichen, eine breite Palette von Duralreizen und ihre Rolle bei der pathologischen Progression von Migräne zu untersuchen, wie Nozizeptoraktivierung, Aktivierung von Immunzellen, Gefäßveränderungen und Schmerzverhalten, während gleichzeitig verletzungsfreie Bedingungen für den Schädel und die Hirnhäute aufrechterhalten werden.

Introduction

Migräneschmerzen bleiben weltweit ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit. Die Weltgesundheitsorganisation stuft sie als die sechsthäufigste Krankheit der Welt ein, die knapp 15% der Erdbevölkerung betrifft¹ und eine erhebliche sozioökonomische Belastung für die Gesellschaft verursacht ^2,3. Die Behandlungsmöglichkeiten und ihre Wirksamkeit waren suboptimal und bieten nur symptomatische Linderung und modifizieren nicht signifikant pathophysiologische Ereignisse, die dem Auftreten von Migräne zugrunde liegen ^4,5. Der Mangel an Behandlungserfolg ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass Migräne eine multifaktorielle Störung ist, deren Pathologie kaum verstanden wird und zu einer begrenzten Anzahl von therapeutischen Zielen führt. Migräne ist auch in Tiermodellen vollständig zu erfassen, insbesondere angesichts der Tatsache, dass die Migränediagnose auf der Grundlage verbaler Kommunikation mit Patienten gestellt wird, die ihre Erfahrungen mit Migränemerkmalen wie Aura, Kopfschmerzen, Photophobie und Allodynie beschreiben. Ungeachtet dessen ist es wichtig zu beachten, dass die jüngsten Fortschritte bei der Migränebehandlung derzeit die Behandlung vieler neurologischer Erkrankungen übertreffen, die durch präklinische Modelle gut validiert wurden. Zum Beispiel waren monoklonale Antikörper und kleine Moleküle, die auf Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid oder seinen Rezeptor abzielen, sehr erfolgreich bei der Verbesserung der Lebensqualität von Migränepatienten und können möglicherweise das klinische Management von Migräne verändern. Während es Fortschritte beim Verständnis dieser Störung gegeben hat, gibt es noch viel zu klären.

Basierend auf präklinischen Tiermodellen und Humanstudien ist es allgemein anerkannt, dass Migränekopfschmerzen durch eine abweichende Aktivierung von nozizeptiven Fasern in den Hirnhäuten ausgelöst werden, die durch die Trigeminus- und oberen zervikalen Dorsalwurzelganglien 6,7,8,9,10 signalisieren. Trotz dieser Theorie verwenden viele Studien immer noch die systemische Verabreichung von Medikamenten, um die zugrunde liegenden beitragenden Mechanismen bei Migräne zu verstehen. Während die systemische Dosierung von Medikamenten unser Verständnis erheblich gestärkt hat, beurteilen diese Ergebnisse nicht direkt, ob lokale Aktionen innerhalb des Zielgewebes von Interesse eine Rolle bei Migräne spielen. Umgekehrt haben mehrere Studien einen Ansatz zur Stimulierung der Dura verfolgt; Diese Experimente erfordern jedoch eine Kanülenimplantation über eine invasive Kraniotomie und verlängerte Erholungszeiten^11,12. Aufgrund dieser Einschränkungen haben wir einen minimalinvasiven Ansatz entwickelt, um die Dura lokal zu stimulieren, wobei das Fehlen einer Kraniotomie die postoperative Genesung eliminiert und sofortige Tests an wachen Tieren^{ermöglicht 12,13,14}. Diese Injektionen werden unter leichter Isoflurananästhesie durchgeführt und an der Verbindung der sagittalen und lambdoiden Nähte bei Mäusen verabreicht.

Es wurden mehrere Ansätze entwickelt, um nozizeptive Verhaltensreaktionen bei Nagetieren^{zu bewerten 15}. Kutane Allodynie wurde bei etwa 80^% der Migränepatienten^16,17 berichtet und stellt einen potenziellen translationalen Endpunkt für die Anwendung bei Nagetieren dar. In präklinischen Modellen wurde die Anwendung von Von-Frey-Filamenten auf die Plantarregion der Nagetierpfote verwendet, um das Schmerzverhalten in präklinischen Migränemodellen zu beurteilen. Die Haupteinschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass er die Kopfregion nicht testet. Die Gesichtsgrimassenbewertung wurde verwendet, um das Schmerzverhalten bei Nagetieren durch die Analyse von Gesichtsausdrücken nach der Induktion von Schmerzreizen^{zu erfassen 18,19}. Zu den Einschränkungen gehört jedoch, dass nur Reaktionen auf akute Reize und nicht chronische orofaziale Schmerzzustände erfasst werden. Gesichtspflege und verminderte Aufzucht werden auch als Ergebnisse von Verhaltensreaktionen in präklinischen Modellen der Migräne betrachtet^20,21. Zu den Einschränkungen der ersteren gehören Schwierigkeiten bei der Unterscheidung von Schmerzreaktionen von normaler Routinepflege und anderen Empfindungen wie Juckreiz. Im letzteren Fall nimmt das Aufzuchtverhalten nach der Einführung von Nagetieren in neuartigen Umgebungen typischerweise schnell ab. Obwohl jeder dieser Verhaltensendpunkte für das Verständnis verschiedener Mechanismen, die zu Schmerzzuständen beitragen, wertvoll ist, besteht ein kritischer Bedarf an präklinischen Modellen von Schmerzstörungen wie Migräne, um Endpunkte einzubeziehen, die spezifisch cephalische Überempfindlichkeitsreaktionen erfassen. Die Beurteilung der taktilen Überempfindlichkeit der periorbitalen Haut nach duraler Stimulation ist eine Methode, die einen besseren Einblick in Mechanismen geben kann, die zu Migräne beitragen, bei denen sensorische Symptome überwiegend cephalischer Natur sind. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verabreichung von Substanzen auf die Mausdura als präklinisches Modell der Migräne. Im Anschluss an die durale Anwendung präsentieren wir auch eine detaillierte Methode zum Testen der periorbitalen taktilen Überempfindlichkeit mit kalibrierten Von-Frey-Filamenten, die in der Dixon-Up-Down-Methode angewendet werden.

Protocol

Alle Verfahren wurden mit vorheriger Genehmigung des institutionellen Animal Care and Use Committee an der University of Texas in Dallas durchgeführt. ICR (CD-1) (30-35 g) und C57/BL6 (25-30 g) Mäuse im Alter von 6-8 Wochen wurden in dieser Studie verwendet.

1. Dural-Infuser

1. Erstellen Sie die Maus-Infusers / Injektoren, indem Sie eine handelsübliche interne Kanüle und einen Infuser für einseitige Injektionen mit einer nichtmetallischen Quarzglas-Kunststoffkappe modifizieren, die verstellbar ist und in eine 28-G-Führungskanüle mit einem Innendurchmesser (I.D.) von 0,18 mm und einem Außendurchmesser (O.D.) von 0,35 mm eingesetzt wird (Abbildung 1A).
2. Verwenden Sie einen Bremssattel oder ein anderes Messgerät, um die Kappe aus Quarzglas am Infuser auf eine Länge von 0,6 mm einzustellen; Gemessen von der Spitze des Infusers bis zum Rand der Silica-Kunststoffkappe.
   1. Achten Sie darauf, den Infuser beim Einstellen der Kunststoffkappe nicht zu verbiegen oder zu stumpf zu machen.
   2. Für andere Mausstämme, die zuvor nicht für durale Injektionen verwendet wurden, bestimmen Sie die optimale Infusionslänge, indem Sie die Länge auf 0,6 mm einstellen und Pilotinjektionen mit Tinte oder Farbstoff durchführen, wobei Sie die Infusionskörperlänge anpassen, bis beobachtet wird, dass sich der Farbstoff nur in der Dura mater und nicht auf dem Gehirn oder Schädel befindet.
3. Befestigen Sie das lange Ende (oder das Ende, das nicht auf 0,6 mm gemessen wurde) des eingestellten Schlauchs an Kunststoffschläuchen (Pumpenschläuche, 2 Stufen, I.D. 0,19 mm, Länge 406 mm).
   1. Schneiden Sie den Schlauch auf eine Mindestlänge von 8 Zoll, um sicherzustellen, dass genügend Leine vorhanden ist, um ein Volumen von 5 μL aufzunehmen.
   2. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch das Metallteil und die Oberseite des Kunststoffstopfens am Infuser bedeckt. Dies verhindert, dass sich Luftblasen in der Leitung ansammeln.
4. Befestigen Sie das andere Ende des Schlauches an einer 10-μL-Glas-Mikrospritze (gasdicht; zementierte Nadel; 21 G mit einem 10-mm-Vorsprung), wobei Sie erneut darauf achten, dass der Metallteil der Spritze fest abgedichtet ist (Abbildung 1A).
5. Sobald die Leitung angeschlossen ist, füllen Sie die Spritze mit 5 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), synthetischer Interstitialflüssigkeit (SIF) oder anderen Fahrzeugen der Wahl, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.
   1. Wenn Luftblasen in der Leitung beobachtet werden, überfluten Sie die Leitung mit dem Fahrzeug, bis sich die Blasen aufgelöst haben.
      HINWEIS: Es kann hilfreich sein, die Spritze mit dem Fahrzeug zu füllen, bevor sie an der Leitung befestigt wird, und dann die Flüssigkeit durch die Leitung zu drücken, sobald sie angeschlossen ist.
6. Nachdem die Leitung mit 5 μL des Fahrzeugs verfüllt ist und effizient arbeitet, laden Sie 5 μL des Arzneimittels / der Lösung in die Hamilton-Spritze (Tinte oder Farbstoff kann als Alternative zum Medikament / zur Lösung verwendet werden, wenn Sie diese Technik erlernen oder üben).
   1. Stellen Sie sicher, dass alle Fahrzeuglösungen, die auf die Dura verabreicht werden, bei einem pH-Wert von 7,4 gehalten und auf eine Osmolalität von 310 gemessen werden. Dies reduziert die potenzielle Aktivierung von säureempfindlichen Ionenkanälen und anderen osmosensitiven Kanälen innerhalb der Dura.
7. Das maximale Volumen, das an Mäusen getestet wurde, die kein Austreten in das Gehirn verursachten, beträgt ungefähr 10 μL. Die Verhaltenseffekte nach Injektionen mit diesem Volumen wurden nicht getestet. Aus diesem Grund nur 5 μL der Lösung auf die Dura geben.
   HINWEIS: Diese Beobachtungen basieren auf den Mausstämmen / -alter / -gewichten von 6-8 Wochen alten CD1 / ICR-Mäusen.

2. Durale Injektionen

1. Sobald die Spritze vorbereitet und das Medikament geladen ist, positionieren Sie eine Maus flach auf ihrem Bauch und betäuben Sie sie unter kurzem 3% Isofluran mit einer Sauerstoffflussrate von 0,5-1 l / min über den Nasenkonus.
   1. Nachdem die Maus keinen Quetschreflex mehr anzeigt, passen Sie die Anästhesie an und halten Sie sie bei einem Isofluran von 1,5% aufrecht.
2. Nach der Betäubung sterile opthalmische Salbe auf die Augen auftragen und den Kopf des Tieres rasieren, dann desinfizieren Sie die Haut mit Povidon-Jod und Ethanol. Danach gelangen Sie in eine Position, die einer erfolgreichen Injektion förderlich ist.
3. Verwenden Sie eine Hand, um den Kopf des Tieres zu stabilisieren und halten Sie den Infuser mit der anderen Hand.
4. Sondieren und lokalisieren Sie vorsichtig die Verbindung der sagittalen und lambdoidalen Nähte am Schädel der Maus (Abbildung 1B, C).
   1. Um diese diskrete Verbindung durch die Haut zu lokalisieren, verwenden Sie die topographischen Merkmale des Schädels und untersuchen Sie vorsichtig die allgemeine Position der Verbindung mit dem Infuser.
   2. Überprüfen Sie die Position der Verbindung, indem Sie den Infuser entlang des Schädels neu positionieren und nach der genauen Position suchen.
5. Sobald sich die Naht befindet und der Infuser an Ort und Stelle ist, wackeln Sie den Infuser sehr langsam und sanft hin und her, bis er durch die Haut dringt und in die Verbindung bis zum Kunststoffstopfen fällt.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die gesamte 0,6-mm-Spitze des Infusers in die Verbindung einführen.
6. Um die Genauigkeit zu überprüfen, verwenden Sie Tinte oder Farbstoff als Injektionslösung und euthanasieren und enthaupten Sie die Maus.
   1. Entfernen Sie die Totenkopfkappe, um den Farbstoff in der Dura mater sichtbar zu machen (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Farbstoff sollte nicht am Gehirn oder an der Außenseite des Schädels beobachtet werden. Ebenso sollten Mäuse in jedem Experiment post mortem überprüft werden, um die Genauigkeit der Injektion zu überprüfen und sicherzustellen, dass die Integrität der Dura mater unbeschädigt war.
7. Entfernen Sie nach der Injektion die Maus aus der Narkose, warten Sie, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt hat, und kehren Sie dann in ihren Käfig zurück oder legen Sie sie in eine Testkammer, um mit den gewünschten Assays zu beginnen.
   HINWEIS: Erlauben Sie der Maus, sich mindestens 30 Minuten lang von der Anästhesie zu erholen, bevor Sie Verhaltensexperimente durchführen.

3. Periorbital von Frey

1. Beginnen Sie die Studie mit einer Kohorte von etwa 16-20 Mäusen.
2. Behandeln Sie am Tag vor der Gewöhnung jede Maus mindestens 5 Minuten lang.
3. Etwa 24 h nach der Handhabung gewöhnen sich die Mäuse an die Prüfraumbedingungen und die von Frey-Prüfapparatur (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Die Acrylprüfvorrichtung besteht aus einzelnen Fächern mit Deckeln, die ungefähr 3 Zoll x 3,5 Zoll x 5 Zoll (B x H x T) sind und von Aluminiumständern getragen werden, die über 0,25 in 19 G quadratverzinktem Stahlgewebedraht verbunden sind.
   1. Legen Sie die Mäuse in einen horizontal platzierten weißen 4-Unzen-Pappbecher, der geruchlos ist und kein Polyethylen oder Paraffinwachs enthält.
      HINWEIS: Diese Arten von Tassen werden bevorzugt, da sie bei Einnahme Magen-Darm-Störungen bei den Mäusen reduzieren (Abbildung 2B).
4. Während sich die Tiere in ihren jeweiligen Kammern befinden, legen Sie ein Pellet der normalen Chow-Diät in die einzelne Kammer jeder Maus, um die Tiere zu beruhigen und unnötigen Stress für die Tiere zu vermeiden. Tun Sie dies 3 Tage lang vor einem von Frey-Verhaltenstest.
   1. Stellen Sie sicher, dass jedes Mal, wenn die Mäuse in der Kammer sind, Zugang zu Nahrung besteht.
   2. Nummerieren und weisen Sie jedes Tier dem gleichen Platz im Testrack zu. Legen Sie die Maus jeden Tag des Testzeitraums in dieselbe Tasse, um sicherzustellen, dass sich jedes Tier an seine Testumgebung gewöhnt.
      HINWEIS: Mäuse nagen an den Bechern und zerstören anschließend die Tassen. Sollte dies der Fall sein, ersetzen Sie die Tasse und beschriften Sie sie mit der entsprechenden Mausnummer.
5. Nach den ersten 3 Tagen der Gewöhnung legen Sie die Mäuse in ihre einzelnen Kammern.
   1. Lassen Sie die Tiere sich vor einem von Frey-Test mindestens 1 Stunde lang an den Testraum und die Kammern gewöhnen, damit sich die Mäuse beruhigen können und anschließend leichter zu testen sind.
6. Nachdem Sie sich am Testtag an den Raum gewöhnt haben, entfernen Sie eine Maus, während sie sich noch in ihrer Tasse befindet, aus der jeweiligen Kammer.
   1. Halten Sie die Tasse in der horizontalen Position, so dass die Maus sowohl auf Vorderpfoten als auch auf Hinterpfoten ist, um ihr Gewicht gleichmäßig verteilt zu halten.
      HINWEIS: Eine ungleiche Gewichtsverteilung kann die Reaktionen der Tiere verändern und sogar verhindern, dass Tiere reagieren.
7. Stellen Sie die Tasse mit der Maus drinnen auf den Tisch unter dem Testrack auf dem saugfähigen Pad.
8. Für periorbitale von-Frey-Tests legen Sie das 0,07 g Von-Frey-Filament direkt in die Mitte des Gesichts und zwischen die Augen.
9. Üben Sie genügend Druck auf das Filament aus, damit sich das von Frey-Haar zu einer "C" -förmigen Formation biegt.
   1. Halten Sie den Kontakt mit der Region mindestens 3 s, aber nicht mehr als 5 s aufrecht oder bis die Maus ihren Kopf zieht und mit ihrer Pfote auf das Filament streift.
      HINWEIS: Wenn das Filament während des Tests verrutscht oder mehr als die Spitze des Filaments das Tier berührt, sollten Antworten nicht gezählt werden. Diese Reaktionen können als Reaktion auf den Pinsel erfolgen, der von verschiedenen Mechanorezeptoren aktiviert wird und daher möglicherweise keine genauen Ergebnisse widerspiegelt.
   2. Von Frey Filamente nach der Dixon "up-down" Methode^22,23 auftragen.
      1. Tragen Sie zunächst das von Frey-Filament auf, das ein Gewicht von 0,07 g hat. Das niedrigstmögliche Filament und das am höchsten getestete Filament in dieser Studie sind Filamente mit Gewichten von 0,008 g bzw. 0,6 g.
      2. Verwenden Sie die Filamente mit einem Gewicht von 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g und 0,6 g, um diesen Assay durchzuführen.
      3. Wenn bei dieser Methode ein Tier nicht auf das Filament reagiert, wenden Sie das Filament des nächsthöheren Grammgewichts an.
      4. Wenn die Maus auf ein Filament reagiert, betrachten Sie diese Maus als Reaktion auf dieses Filament. Wenn dies der Fall ist, tragen Sie das Filament des nächstniedrigeren Grammgewichts auf.
      5. Wiederholen Sie dieses Muster, bis das Tier 4 Mal nach dem ersten Ansprechen getestet wurde oder festgestellt wird, dass das Tier nicht auf die im Assay getesteten Filamente anspricht.
         HINWEIS: Verzichten Sie auf zusätzlichen Druck, der vom Arm oder Handgelenk ausgeht. Eine Skala kann verwendet werden, um die Anwendung des Filaments zu üben.

4. Prüfung der Ausgangsentnahmeschwellen

1. Stellen Sie vor dem Einschluss in ein Experiment sicher, dass die Mäuse eine Ausgangsentnahmeschwelle zwischen 0,5 und 0,6 g erreichen.
   1. Eine Maus erreicht den Ausgangswert, wenn sie nicht auf ein Filament reagiert, das in der in Schritt 3.9.2.2 genannten Serie getestet wurde (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g und 0,6 g).
2. Testen Sie Mäuse täglich, wenn Sie Ausgangsentnahmeschwellen festlegen.
   1. Tests ermöglichen es den Tieren, sich an die Testbedingungen und den Druck der von Frey-Filamente zu gewöhnen.
   2. Wenn die Mäuse nach dem dritten Testtag immer noch extrem überempfindlich sind, warten Sie 1 oder 2 Tage, bevor Sie erneut testen.
      HINWEIS: Zu viel Zeit zwischen den Testtagen kann dazu führen, dass sich das Tier nicht an das Gewicht des Filaments in seiner periorbitalen Region anpasst und somit die angestrebte Entnahmeschwelle nicht erreicht.
3. Testen Sie Mäuse etwa 7 Tage lang, bevor Sie feststellen, welche Tiere die Einschlusskriterien für einen Versuch nicht erfüllen.
   HINWEIS: Ungefähr 70% der Mäuse werden das angestrebte Ausgangsniveau erreichen.
   1. Analysieren Sie vor der duralen Stimulation die Ausgangsdaten, um Maus auszuschließen, die keinen Ausgangswert von 0,5 bis 0,6 Gramm oder höher erreicht hat.
   2. Ordnen Sie nach dem Ausschluss jede verbleibende Maus nach dem Zufallsprinzip einer Testgruppe zu. Erreichen Sie dies, indem Sie aus einer Tasse ziehen oder ein Skript in eine Tabelle schreiben, um Zahlen für eine Gruppe randomisieren zu lassen.

5. Analyse der von Frey Ergebnisse

1. Sobald die Reihe der Antworten erhalten wurde, bestimmen Sie das Delta, den k-Wert, den 50%-Schwellenwert und die Entnahmeschwelle in Gramm gemäß den zuvor veröffentlichten Methoden²⁴.
2. Berechnen Sie die Auszahlungsschwelle mit dieser Formel WT = 10(x*^F+B), wobei WT= Auszahlungsschwelle, F = Pfotenentnahmeschwelle, berechnet nach der Chaplan-Methode und B = lineare Regression von log (Biegekraft) = x*Filamentzahl + B.
3. Zeichnen Sie die Daten entweder als Auszahlungsschwelle von 50 % oder als durchschnittliche Auszahlungsschwelle in Gramm auf.

Representative Results

Diese Injektionsmethode wird verwendet, um Stimuli auf die Dura von Mäusen zu verabreichen, so dass nachfolgende Verhaltenstests auftreten können. Der häufigste mit diesem Modell gemessene Verhaltensoutput ist die kutane Gesichtsüberempfindlichkeit, die mit von Frey 12,13,14 beurteilt wurde. Hier zeigen wir, wie dieses Modell verwendet werden kann, um mögliche geschlechtsspezifische Beiträge zur Migränepathologie zu bewerten (Abbildung 3).

Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Auswirkungen von duralem Prolaktin (PRL) auf die mechanisch evozierte Überempfindlichkeit des Gesichts^{zu untersuchen 14} (Abbildung 3). Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass weibliche ICR-Mäuse signifikant reduzierte Gesichtsentzugsschwellen als Reaktion auf 5 μg durales Prolaktin zeigen (Abbildung 3A). Eine zehnfach niedrigere Dosis von 0,5 μg Prolaktin (PRL) zeigte ebenfalls ähnliche Reaktionen wie eine hohe PRL-Dosis (Abbildung 3B).

Es wurde auch gezeigt, dass diese Injektionen spontane schmerzbedingte Verhaltensweisen hervorrufen, die über Grimassen beurteilt werden. Dural 0,5 μg PRL verursachten signifikante Grimassen bei weiblichen Mäusen (Abbildung 3C), was eine klare Rolle für durale PRL bei weiblichen migräneähnlichen Verhaltensweisen zeigt. Wir haben vor allen Tests mit von Frey-Filamenten Grimassenanalysen durchgeführt.

Abbildung 1: Duraler Infuser und Injektionsplatzierung . (A) Die Injektoren/Infuser bestehen aus einer modifizierten Kanüle, die auf die Länge von ~0,5 mm- 0,65 mm eingestellt und an einer Nadel befestigt ist, die über einen Tygonschlauch auf einer gasdichten 10-μL-Spritze zementiert ist. (B) Luftaufnahme der markierten Position der Injektionsstelle auf dem Kopf der Maus. (C) (Linkes Feld) Diagramm der Stelle der duralen Injektion. Die Platzierung der Injektion erfolgt an der Verbindung der Lambdoid- und Sagittalnähte an etwa 4,8 mm posteriore zu Bregma . (Mittlere Tafel) Postmortale Luftaufnahme eines Mausschädels nach duraler Injektion von 5 μL blauem Injektionsfarbstoff. (Rechtes Feld) Trennung der Maus-Schädeldecke vom Gehirn. Es gab kein beobachtbares Austreten von blauem Injektionsfarbstoff im Gehirn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: von Frey Prüfkammern. (A) von Frey Prüfkammer, bestehend aus 3,5 Zoll x 3,5 in einzelnen Acrylkammern mit Deckeln auf einem Drahtgeflechtgestell. Diese sind über Spalten von 10 Kammern verbunden, die in 2 Reihen organisiert sind. (B) Beispiel von Mäusen in ihren einzelnen Tassen, die in den von Frey-Testkammern untergebracht sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Durale Anwendung von Prolaktin induziert Verhaltensreaktionen bei Mäusen. Mechanische Entzugsschwellen wurden nach der duralen Anwendung von PRL (5 μg oder 0,5 μg) bei weiblichen Mäusen bewertet. (A) Anwendung von 5 μg PRL (n = 7 PRL, n = 6 Vehikel) induzierter Gesichtsüberempfindlichkeit im Vergleich zum Vehikel. (B) Anwendung von 0,5 μg PRL (n = 5 PRL, n = 4 Vehikel) induzierte lang anhaltende Gesichtsüberempfindlichkeit. (C) Die Grimasse wurde auch bei denselben Mäusen beurteilt, die zu jedem Zeitpunkt mit 0,5 μg PRL behandelt wurden. Diese Mäuse wiesen im Vergleich zu den mit dem Fahrzeug behandelten Mäusen signifikant höhere Grimassenwerte auf. Statistik: Zwei-Wege-ANOVA gefolgt von Bonferroni Mehrfachvergleich Post-hoc-Analyse. Die Daten werden als Mittel ± REM dargestellt. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Maladaptive Veränderungen im lokalen nozizeptiven System in der Dura gelten als Schlüsselfaktor für die Kopfschmerzphase von Migräneattacken trotz fehlender Gewebeverletzung^25,26. Hier stellt die Studie eine Methode vor, mit der eine minimal-invasive Stimulation der Dura eine taktile Überempfindlichkeit des Gesichts auslösen kann. Die Aufklärung der Mechanismen und Ereignisse, die an der Aktivierung des duralen Nozizeptors beteiligt sind, ohne den Schädel und das Gewebe zu schädigen, kann Migränemechanismen in einem präklinischen Modell genauer widerspiegeln.

Kraniotomie und Kanülenimplantation werden seit langem verwendet, um Funktionen und Mechanismen zu beurteilen, die zu Migräneschmerzen beitragen^11,12. Es wurde jedoch berichtet, dass eine Kraniotomie die Aktivierung von Duralmastzellen induzieren und die piale vaskuläre Permeabilität bei Nagetieren erhöhen^{kann 27}. Angesichts der Tatsache, dass die Aktivierung von Mastzellen in der^{Dura stark} mit Migräne 7,8,28,29 in Verbindung gebracht wird, hat diese Technik große Vorbehalte^, die die Interpretation verzerren können. Die Verabreichung von Substanzen durch die Verbindung der sagittalen und lambdoidalen Nähte verringert effektiv die Aktivierung von Nozizeptoren, die durch kraniotomie-induzierte Mastzellaktivierung vermittelt werden. Darüber hinaus erfordert die nicht-invasive durale Stimulation keine postoperative Genesung und Verabreichung von Analgetika, die die Interpretation der Ergebnisse verändern können. Die lokale Anwendung von Substanzen auf die Dura ermöglicht es den Forschern, sich auf dieses spezifische Zielgewebe zu konzentrieren, im Gegensatz zur systemischen Verabreichung von Arzneimitteln, bei der der Wirkungsort nicht leicht bestimmt werden^{kann 12,13,14}. Während die systemische Verabreichung von Substanzen wie Nitroglycerin und Calcitonin-Gen-bezogenem Peptid experimentelle Angriffe beim Menschen auslöst, die Migräne ähneln, erlauben sie keine Beurteilung des Wirkungsortes in Nagetiermodellen; Gezieltere gewebespezifische Modelle bieten einen alternativen Ansatz.

Diese hier beschriebene Technik beinhaltet die Injektion eines Arzneimittels oder einer anderen Lösung direkt auf die Dura mater der Hirnhäute durch die Verbindung, an der sich die sagittalen und lambdoidalen Nähte des Schädels treffen. Für beste Ergebnisse sollten ICR (CD-1) oder C57/BL6 Mäuse im Alter von 6-8 Wochen für diese Experimente verwendet werden. Jüngere Mäuse können verwendet werden; Die Verwendung von ICR (CD-1) -Mäusen, die älter als 8 Wochen sind, wird jedoch nicht empfohlen, da ihre Schädelplattennähte in diesem Alter typischerweise vollständig verschmolzen sind, was eine Injektion ohne Beschädigung des Schädels unmöglich macht. Es ist auch wichtig, das Gewicht / die Größe jeder Maus zu berücksichtigen, die diesem Verfahren unterzogen wird. Es wird empfohlen, diese Injektionen bei Tieren mit einem Gewicht von mehr als 19 g durchzuführen, da der Schädel bei niedrigeren Gewichten typischerweise sehr dünn ist und dem während der Injektion ausgeübten Druck möglicherweise nicht standhält. Von Bedeutung ist, dass es auch wahrscheinliche Faktoren gibt, die zu dem Alter / Gewicht beitragen, in dem die Schädelplattenfusion stattfindet (z. B. die Zusammensetzung von Labor-Chow, das in Tiereinrichtungen verwendet wird). Daher müssen Experimentatoren möglicherweise den Alters- / Gewichtsbereich bestimmen, der unter ihren eigenen Bedingungen geeignet ist. Für andere Mausstämme oder Genotypen können unterschiedliche Altersgruppen und Tiergewichte erforderlich sein, je nachdem, wann die Schädelplatten bei diesen Tieren verschmelzen, und es kann auch eine Optimierung der Injektion selbst erforderlich sein.

Beim Erlernen oder Üben dieser Technik wird dringend empfohlen, dass ein gewisses Maß an Komfort bei der Lokalisierung der Nahtverbindung bei euthanasierten Mäusen erreicht wird. Es kann am besten sein, zuerst mit der herausgeschnittenen oder geschälten Kopfhaut in diesen Mäusen zu üben und langsam fortzufahren, um die Verbindung durch die Haut zu lokalisieren. Sobald die genaue Position festgelegt ist, können Tinten und Farbstoffe in die Dura injiziert werden, um die Genauigkeit der Position und Tiefe der Injektion zu überprüfen. Diese Technik wurde mit ICR (CD-1) Mäusen (30-35 g) und C57/BL6 (25-30 g) entwickelt und optimiert. Eine Schlauchbeutellänge von 0,5-0,6 mm reicht aus, um eine Maus mit einem Gewicht von 25-35 g zu injizieren. Die Länge des Infusers muss jedoch möglicherweise kalibriert werden, wenn Mäuse injiziert werden, die sich erheblich von den Mäusen unterscheiden, die zur Optimierung dieser Technik verwendet werden. Zum Beispiel würde eine Maus, die kleiner als 25 g ist, wahrscheinlich zur Verwendung eines Infusers führen, der eine Länge von weniger als 0,5 mm hat. Nach der Beherrschung dieser Technik und bei altersgerechten Mäusen kann die Erfolgsrate dieser Injektion nahe bei 100% liegen; Komplikationen bei der Injektion können jedoch von Problemen wie dem Brechen des Schädels aufgrund von zu viel Kraft zum Einsetzen des Infusers sowie abnormalen Blutungen, die durch die Schädigung der meningealen Blutgefäße verursacht werden, herrühren.

Veränderungen der taktilen Empfindlichkeit sind eine wichtige Messung bei der Beurteilung des Schmerzverhaltens bei Nagetieren. Hier demonstrieren wir die Verwendung von periorbitalen von-Frey-Tests zur Beurteilung dieser Verhaltensweisen in einem präklinischen Migränemodell. Ein großer Vorteil der Verwendung dieser Technik in Migränemodellen besteht darin, dass wir die Überempfindlichkeit des Kopfes beurteilen können, die relevanter ist als andere nicht-kraniale Orte wie Pfoten. Der entscheidende Schritt, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten, besteht darin, sicherzustellen, dass die Mäuse vollständig basisbasiert sind. Dies erfordert einen gut ausgebildeten Experimentator, der von Frey-Filamente präzise anwenden kann. Es ist wahrscheinlich, dass es ungefähr 7 Tage dauern wird, bis ein Tier den Ausgangswert erreicht hat. Es ist jedoch möglich, dass nicht jedes Tier die angestrebte Ausgangslinie erreicht. Nach unserer Erfahrung erreichen nach etwa 7 Tagen Arbeit mit Mäusen nur 60%-70% der Tiere eine Ausgangslinie von 0,6 g in der periorbitalen Region, was jedoch von der Kohorte der Tiere abhängt. Dieser Zeitpunkt sollte vor Beginn eines Versuchs in Betracht gezogen werden, um sicherzustellen, dass ausreichende Zahlen verwendet werden, um den Abbruch zu berücksichtigen, und dass die Tiere das richtige Alter nach dem Ausgangswert für die Verwendung dieser nicht-invasiven Methode zur Stimulation der Dura haben. Die Schritte zum Bestimmen einer Baseline sind in Protokollabschnitt 4 beschrieben.

Eine Einschränkung der von Frey-Tests besteht darin, dass es schwierig sein kann, zwischen Schmerzreaktionen und routinemäßiger Pflege / Juckreiz zu unterscheiden. Um Schmerzen von der Pflege zu unterscheiden, ist es wichtig, die Dauer dieses Verhaltens zu beachten. Normalerweise ist eine Schmerzreaktion ein Wisch nach der Filamentanwendung, während das Pflegeverhalten tendenziell verlängert wird und mehrere Sekunden bis Minuten dauern kann. Wenn das Grooming/Juckreizverhalten nicht von einer überempfindlichen Reaktion unterschieden werden kann, ist es am besten, dies nicht als Reaktion aufzuzeichnen. Darüber hinaus kann eine unsachgemäße Platzierung des Filaments (z. B. Filamentrutschen) zu einer längeren Pflege des Tieres führen, was es schwierig macht, es richtig zu testen. Wenn dies geschieht, sollte der Experimentator warten, bis die Pflege aufgehört hat und die Maus ruhig genug ist, um zu testen. Fahren Sie mit dem gleichen Filament fort, das vor Beginn des Pflegeverhaltens verwendet wurde. Wenn die Maus sehr lange anhält, legen Sie die Maus für ca. 5 Minuten zurück in die Testkammer. Sobald die 5 Minuten vergangen sind, versuchen Sie, die Maus erneut zu testen. Wenn dieses Verhalten ohne Lösung anhält, müssen die Mäuse aus der Studie entfernt werden. Von Bedeutung ist, dass es nicht empfohlen wird, das Fell im Gesicht zu rasieren, da unklar ist, ob die Maushaut nach dem Entfernen der Haare die gleiche Empfindlichkeit beibehält und der Prozess der Haarentfernung (Rasur, Enthaarungscremes) auch die Hautempfindlichkeit beeinflussen kann.

In den meisten Situationen ist es ideal, um Substanzen auf die Dura nicht mehr als 24 h nach Erreichen des Ausgangswerts der Maus zu verabreichen. Es wird empfohlen, Mäuse einmal pro Stunde einem von Frey-Filamenttest zu unterziehen. Wenn möglich, gibt das Testen alle zwei Stunden genügend Zeit, damit sich die Tiere nach dem Test beruhigen können. Darüber hinaus sollten Experimente zeitlich so abgestimmt sein, dass sie ihre zirkadianen Muster nicht stören. Veränderungen des circadianen Rhythmus bei Mäusen können Verhaltensphänotypen verändern und letztendlich zu irreproduzierbaren Ergebnissen führen.

Periorbitale von-Frey-Tests können in Kombination mit anderen Verhaltensassays verwendet werden, um experimentelle Schlussfolgerungen zu stärken. Die Grimassenskala stützt sich eher auf spontane Gesichtsausdrücke bei Nagetieren als auf hervorgerufene Reaktionen^18,19. Diese Methode hat eine hohe Genauigkeit und Zuverlässigkeit bei der Beurteilung und Quantifizierung des akuten Schmerzverhaltens und wurde in vielen präklinischen Modellen der Migräne^12,30 verwendet. Bei der Verwendung von Grimassen- und periorbitalen von-Frey-Assays sollte der Experimentator in Betracht ziehen, vor der Anwendung von Von-Frey-Filamenten auf die periorbitale Region der Maus eine Grimasse zu erzielen. Dadurch wird sichergestellt, dass das Grimassengefühl spontan ist und nicht durch Filamentapplikation hervorgerufen wird. Die mechanische Überempfindlichkeit von Hindpaw kann auch in Verbindung mit periorbitalen von-Frey-Tests verwendet werden. Im Gegensatz zur Grimassenbewertung ist es am besten, die Überempfindlichkeit des Gesichts zu testen, bevor die Überempfindlichkeit der Hinterpfote beurteilt wird. Hindpaw-Tests erfordern, dass die Maus nach Abschluss des periorbitalen von-Frey-Tests ohne Becher wieder in die Kammer gestellt wird.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass periorbitale von-Frey-Tests und nicht-invasive durale Stimulation an Mäusen dem aktuellen Spektrum präklinischer Migränemodelle wertvolle Optionen hinzufügen. Bei richtiger Ausführung stellt diese Technik einen verfeinerten Ansatz zur Erzeugung eines kopfschmerzähnlichen Phänotyps bei Nagetieren dar, da keine chirurgische Implantation einer Kanüle erforderlich ist. Bei Ratten sind Kanülen anfällig für bakterielle Infektionen, können verstopft werden, abfallen und erfordern, dass jedes Tier einhausig ist, was zu unnötigem Stress für das Tier führt. Darüber hinaus kann das Duralstimulationsprotokoll leicht modifiziert werden, um es mit verschiedenen Arzneimittelanwendungen zu verwenden. Periorbitale von Frey-Testparadigmen können auch modifiziert werden, um den experimentellen Spezifikationen am besten zu entsprechen. Darüber hinaus können periorbitale von-Frey-Tests bei anderen orofazialen Schmerzerkrankungen eingesetzt werden. Diese Techniken sind ein wichtiges Werkzeug, um die komplexen zugrunde liegenden Mechanismen von Migräneschmerzen besser zu verstehen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 oz Hot Paper Cups	Choice Paper Company	5004W	https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html
Absorbent Underpads	Fisherbrand	14-206-65	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula	P1 Technologies (formerly Plastics One)	8IC313ISPCXC	I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes	Hamilton	80008	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm	Cole-Palmer	EW-96460-10	https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire	Custom		The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers	Custom		Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments	Touch test/Stoelting	58011	https://www.stoeltingco.com/touch-test.html