Summary
Het meest opvallende symptoom van migraine is ernstige hoofdpijn, en er wordt verondersteld dat dit wordt gemedieerd door sensorische neuronen die de hersenvliezen innerveren. Hier presenteren we een methode om stoffen lokaal op de dura toe te passen op een minimaal invasieve manier met behulp van gezichtsovergevoeligheid als output.
Abstract
Van de craniale hersenvliezen, bestaande uit de dura mater, arachnoid en pia mater, wordt gedacht dat ze voornamelijk structurele functies voor het zenuwstelsel dienen. Ze beschermen bijvoorbeeld de hersenen tegen de schedel en verankeren / organiseren de vasculaire en neuronale toevoer van de cortex. De hersenvliezen zijn echter ook betrokken bij aandoeningen van het zenuwstelsel zoals migraine, waarbij de pijn die wordt ervaren tijdens een migraine wordt toegeschreven aan lokale steriele ontsteking en daaropvolgende activering van lokale nociceptieve afferente stoffen. Van de lagen in de hersenvliezen is de dura mater van bijzonder belang in de pathofysiologie van migraine. Het is sterk gevasculariseerd, herbergt lokale nociceptieve neuronen en is de thuisbasis van een breed scala aan residente cellen zoals immuuncellen. Subtiele veranderingen in de lokale meningeale micro-omgeving kunnen leiden tot activering en sensibilisatie van durale perivasculaire nociceptoren, wat leidt tot migrainepijn. Studies hebben geprobeerd aan te pakken hoe durale afferente stoffen worden geactiveerd / gesensibiliseerd door gebruik te maken van in vivo elektrofysiologie, beeldvormingstechnieken of gedragsmodellen, maar deze vereisen vaak zeer invasieve operaties. Dit protocol presenteert een methode voor relatief niet-invasieve toepassing van verbindingen op de dura mater bij muizen en een geschikte methode voor het meten van hoofdpijnachtige tactiele gevoeligheid met behulp van periorbitale von Frey-testen na durale stimulatie. Deze methode handhaaft de integriteit van de dura en schedel en vermindert verstorende effecten van invasieve technieken door stoffen te injecteren via een gemodificeerde canule van 0,65 mm op de kruising van niet-toegediende sagittale en lambdoïde hechtingen. Dit preklinische model stelt onderzoekers in staat om een breed scala aan durale stimuli en hun rol in de pathologische progressie van migraine te onderzoeken, zoals nociceptoractivatie, immuuncelactivatie, vasculaire veranderingen en pijngedrag, allemaal met behoud van letselvrije omstandigheden aan de schedel en hersenvliezen.
Introduction
Migrainepijn blijft wereldwijd een groot probleem voor de volksgezondheid. De Wereldgezondheidsorganisatie rangschikt het als de zesde meest voorkomende ziekte ter wereld, die iets minder dan 15% van de wereldbevolking1 treft en een aanzienlijke sociaaleconomische last voor de samenleving veroorzaakt 2,3. Behandelingsopties en hun werkzaamheid zijn suboptimaal geweest en bieden alleen symptomatische verlichting en veranderen pathofysiologische gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan het optreden van migraine niet significant 4,5. Het gebrek aan succes van de behandeling is waarschijnlijk te wijten aan migraine als een multifactoriële aandoening waarvan de pathologie slecht wordt begrepen, wat leidt tot een beperkt aantal therapeutische doelen. Migraine is ook een uitdaging om volledig vast te leggen in diermodellen, vooral gezien het feit dat de diagnose migraine wordt gesteld op basis van verbale communicatie met patiënten die hun ervaring met migrainekenmerken zoals aura, hoofdpijn, fotofobie en allodynie beschrijven. Desondanks is het belangrijk op te merken dat recente ontwikkelingen in migrainebehandelingen momenteel beter presteren dan behandelingen voor veel neurologische aandoeningen die goed zijn gevalideerd door preklinische modellen. Monoklonale antilichamen en kleine moleculen die zich richten op calcitonine-gengerelateerd peptide of de receptor ervan zijn bijvoorbeeld zeer succesvol geweest in het verbeteren van de kwaliteit van leven van migrainepatiënten en kunnen mogelijk het klinische beheer van migraine transformeren. Hoewel er vooruitgang is geboekt in het begrijpen van deze aandoening, moet er nog veel worden opgehelderd.
Op basis van preklinische diermodellen en menselijke studies is het algemeen aanvaard dat migrainehoofdpijn wordt geïnitieerd door afwijkende activering van nociceptieve vezels in de hersenvliezen die door de trigeminus en bovenste cervicale dorsale wortelganglia 6,7,8,9,10 signaleren. Ondanks deze theorie gebruiken veel studies nog steeds systemische toediening van geneesmiddelen om onderliggende bijdragende mechanismen bij migraine te begrijpen. Hoewel systemische dosering van geneesmiddelen ons begrip aanzienlijk heeft versterkt, beoordelen deze bevindingen niet direct of lokale acties in het doelweefsel van belang een rol spelen bij migraine. Omgekeerd hebben verschillende studies een aanpak gekozen om de dura te stimuleren; deze experimenten vereisen echter canule-implantatie via een invasieve craniotomie en verlengde hersteltijden 11,12. Vanwege deze beperkingen hebben we een minimaal invasieve aanpak ontwikkeld om de dura lokaal te stimuleren, waarbij het ontbreken van een craniotomie postoperatief herstel elimineert en onmiddellijke testen bij wakkere dieren mogelijk maakt 12,13,14. Deze injecties worden uitgevoerd onder lichte isofluraan-anesthesie en toegediend op de kruising van de sagittale en lambdoïde hechtingen bij muizen.
Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om nociceptieve gedragsreacties bij knaagdieren te evalueren15. Cutane allodynie is gemeld bij ongeveer 80% van de migrainepatiënten16,17 en vertegenwoordigt een potentieel translationeel eindpunt voor gebruik bij knaagdieren. In preklinische modellen is de toepassing van von Frey-filamenten op het plantaire gebied van de knaagdierpoot gebruikt om pijngedrag te beoordelen in preklinische migrainemodellen. De belangrijkste beperking van deze aanpak is dat het het cefalische gebied niet test. Facial grimace scoring is gebruikt om pijngedrag bij knaagdieren vast te leggen door gezichtsuitdrukkingen te analyseren na inductie van pijnprikkels18,19. De beperkingen omvatten echter alleen het vastleggen van reacties op acute stimuli en niet chronische orofaciale pijnaandoeningen. Gezichtsverzorging en verminderde opvoeding worden ook beschouwd als outputs van gedragsreacties in preklinische modellen van migraine 20,21. Beperkingen van de eerste omvatten moeite met het onderscheiden van pijnreacties van normale routinematige verzorging en andere sensaties zoals jeuk. In het geval van de laatste neemt het opfokgedrag meestal snel af na de introductie van knaagdieren in nieuwe omgevingen. Hoewel elk van deze gedragseindpunten waardevol is voor het begrijpen van verschillende mechanismen die bijdragen aan pijnaandoeningen, is er een kritieke behoefte aan preklinische modellen van pijnstoornissen zoals migraine om eindpunten op te nemen die specifiek cefalische overgevoeligheidsreacties vastleggen. Het beoordelen van tactiele overgevoeligheid van de periorbitale huid na durale stimulatie is een methode die beter inzicht kan geven in mechanismen die bijdragen aan migraine waarbij sensorische symptomen overwegend cefalisch van aard zijn. Hier beschrijven we een methode om stoffen toe te dienen aan de dura van de muis als een preklinisch model van migraine. Na durale toepassing presenteren we ook een gedetailleerde methode voor het testen van periorbitale tactiele overgevoeligheid met behulp van gekalibreerde von Frey-filamenten toegepast in de Dixon up-down methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd met voorafgaande goedkeuring van de institutionele Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Texas in Dallas. ICR (CD-1) (30-35 g) en C57/BL6 (25-30 g) muizen van 6-8 weken werden gebruikt in deze studie.
1. Dural infuser
- Maak de muisinfusers/injectoren door een in de handel verkrijgbare interne canule en infuser te wijzigen voor eenzijdige injecties met een niet-metalen gesmolten silica plastic dop die verstelbaar is en in-/uitschuift onder een 28 G geleidecanule met binnendiameter (I.D.) van 0,18 mm en een buitendiameter (O.D.) van 0,35 mm (figuur 1A).
- Gebruik een remklauw of ander meetapparaat om de gesmolten silica plastic dop op de infuser aan te passen tot een lengte van 0,6 mm; gemeten vanaf de punt van de infuser tot aan de rand van de silica plastic dop.
- Wees voorzichtig om de infuser niet te buigen of te doven bij het afstellen van de plastic dop.
- Voor andere muizenstammen die niet eerder zijn gebruikt voor durale injecties, bepaalt u de optimale infuserlengte door de lengte in te stellen op 0,6 mm en pilot-injecties uit te voeren met inkt of kleurstof, waarbij de infuserlengte wordt aangepast totdat wordt waargenomen dat de kleurstof zich alleen in de dura mater bevindt en niet op de hersenen of schedel.
- Bevestig het lange uiteinde (of het uiteinde dat niet is gemeten op 0,6 mm) van de aangepaste infuser aan plastic buizen (pompbuizen, 2-stop, I.D. 0,19 mm, lengte 406 mm).
- Snijd de slang tot een minimale lengte van 8 inch om ervoor te zorgen dat er voldoende lijn is om een volume van 5 μL vast te houden.
- Zorg ervoor dat de slang het metalen deel en de bovenkant van de plastic stop op de infuser bedekt. Dit helpt voorkomen dat luchtbellen zich ophopen in de lijn.
- Bevestig het andere uiteinde van de buis opnieuw aan een glazen microsyringe van 10 μL (gasdicht; gecementeerde naald; 21 G met een projectie van 10 mm), en zorg ervoor dat het metalen deel van de spuit goed wordt afgesloten (figuur 1A).
- Zodra de lijn is aangesloten, vult u de spuit op met 5 μL fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS), synthetische interstitiële vloeistof (SIF) of andere voertuigen naar keuze om te voorkomen dat luchtbellen zich vormen.
- Als er luchtbellen in de lijn worden waargenomen, overstroomt u de lijn met het voertuig totdat de bellen zijn verdwenen.
OPMERKING: Het kan helpen om de spuit met het medium te vullen voordat u deze aan de lijn bevestigt en vervolgens de vloeistof door de lijn duwt zodra deze is aangesloten.
- Als er luchtbellen in de lijn worden waargenomen, overstroomt u de lijn met het voertuig totdat de bellen zijn verdwenen.
- Nadat de lijn is gevuld met 5 μL van het voertuig en efficiënt werkt, laadt u 5 μL van het geneesmiddel / de oplossing in hamiltonspuit (inkt of kleurstof kan worden gebruikt als alternatief voor het medicijn / de oplossing als u deze techniek leert of beoefent).
- Zorg ervoor dat alle voertuigoplossingen die op de dura worden toegediend, op pH 7,4 worden gehouden en worden gemeten tot een osmolaliteit van 310. Dit vermindert de potentiële activering van zuurgevoelige ionkanalen en andere osmosensitieve kanalen in de dura.
- Het maximale volume dat is getest bij muizen die geen lekkage in de hersenen hebben veroorzaakt, is ongeveer 10 μL. De gedragseffecten na injecties met dit volume zijn niet getest. Dien daarom slechts 5 μL van de oplossing toe aan de dura.
OPMERKING: Deze waarnemingen zijn gebaseerd op de muizenstammen/leeftijden/gewichten van 6-8 weken oude CD1/ICR muizen.
2. Dural injecties
- Zodra de spuit is klaargemaakt en het medicijn is geladen, plaatst u een muis plat op zijn buik en verdooft u deze onder korte 3% isofluraan met een zuurstofstroomsnelheid van 0,5-1 l / min via neuskegel.
- Nadat de muis geen knijpreflex meer vertoont, past u de anesthesie aan en houdt u deze vast aan een isofluraan van 1,5%.
- Eenmaal verdoofd, breng steriele oogzalf aan op de ogen en scheer het hoofd van het dier en desinfecteer vervolgens de huid met povidon-jodium en ethanol. Ga hierna in een positie die bevorderlijk is voor een succesvolle injectie.
- Gebruik één hand om het hoofd van het dier vast te houden en houd de infuser met de andere hand vast.
- Onderzoek en lokaliseer zorgvuldig de kruising van de sagittale en lambdoïdale hechtingen op de schedel van de muis (figuur 1B, C).
- Om deze discrete overgang door de huid te lokaliseren, gebruikt u de topografische kenmerken van de schedel en onderzoekt u voorzichtig de algemene locatie van de kruising met de infuser.
- Controleer de positie van de kruising door de infuser langs de schedel te plaatsen en de exacte locatie te voelen.
- Zodra de hechting is gelokaliseerd en de infuser op zijn plaats is, wiebelt u de infuser heel langzaam en voorzichtig heen en weer totdat deze door de huid prikt en helemaal tot aan de plastic stop in de kruising valt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de volledige 0,6 mm punt van de infuser in de junctie steekt. - Om de nauwkeurigheid te controleren, gebruikt u inkt of kleurstof als injectieoplossing en euthanaseert en onthoofdt u de muis.
- Verwijder de schedelkap om de kleurstof in de dura mater te visualiseren (figuur 1C).
OPMERKING: Kleurstof mag niet worden waargenomen op de hersenen of de buitenkant van de schedel. Evenzo moeten muizen in elk experiment postmortem worden gecontroleerd om de nauwkeurigheid van de injectie te verifiëren en om ervoor te zorgen dat de integriteit van de dura mater onbeschadigd was.
- Verwijder de schedelkap om de kleurstof in de dura mater te visualiseren (figuur 1C).
- Verwijder na de injectie de muis uit de anesthesie, wacht tot hij weer bij bewustzijn is en keer dan terug naar zijn kooi of plaats hem in een testkamer om de gewenste testen te starten.
OPMERKING: Laat de muis minimaal 30 minuten herstellen van anesthesie voordat u gedragsexperimenten uitvoert.
3. Periorbitale von Frey
- Begin de studie met een cohort van ongeveer 16-20 muizen.
- Een de dag voorafgaand aan de gewenning, behandel elke muis gedurende ten minste 5 minuten.
- Laat de muizen ongeveer 24 uur na hantering wennen aan de omstandigheden in de testruimte en het von Frey-testapparaat (figuur 2A).
OPMERKING: Het acryl testapparaat bestaat uit individuele compartimenten met deksels die ongeveer 3 in x 3,5 in x 5 in (B x H x D) zijn en worden ondersteund door aluminium standaards verbonden via 0,25 in 19 G vierkant gegalvaniseerd staalgaasdraad.- Plaats de muizen in een horizontaal geplaatste 4-oz witte papieren beker die geurloos is en geen polytheen of paraffine bevat.
OPMERKING: Dit soort kopjes hebben de voorkeur omdat het gastro-intestinale overstuur bij de muizen vermindert als het wordt ingenomen (figuur 2B).
- Plaats de muizen in een horizontaal geplaatste 4-oz witte papieren beker die geurloos is en geen polytheen of paraffine bevat.
- Terwijl de dieren zich in hun respectieve kamers bevinden, plaatst u een pellet van het normale chow-dieet in de individuele kamer van elke muis om de dieren te kalmeren en onnodige stress voor de dieren te voorkomen. Doe dit gedurende 3 dagen voorafgaand aan een von Frey gedragstest.
- Zorg ervoor dat elke keer dat de muizen in de kamer zijn, er toegang is tot voedsel.
- Nummer en wijs elk dier toe aan dezelfde ruimte in het testrek. Plaats de muis elke dag van de testperiode in dezelfde beker om ervoor te zorgen dat elk dier gewend raakt aan zijn testomgeving.
OPMERKING: Muizen zullen aan de kopjes knagen en vervolgens de kopjes vernietigen. Als dit gebeurt, vervangt u de beker en labelt u deze met het bijbehorende muisnummer.
- Na de eerste 3 dagen van gewenning, plaats de muizen in hun individuele kamers.
- Laat de dieren ten minste 1 uur voorafgaand aan een von Frey-test wennen aan de testruimte en -kamers, zodat de muizen kunnen kalmeren en vervolgens gemakkelijker te testen zijn.
- Na het wennen aan de kamer op de testdag, verwijdert u één muis terwijl deze nog in zijn kopje zit uit de betreffende kamer.
- Houd de cup in de horizontale positie, zodat de muis zich op zowel voorpoten als achterpoten bevindt om hun gewicht gelijkmatig verdeeld te houden.
OPMERKING: Ongelijke gewichtsverdeling kan de reacties van dieren veranderen en zelfs voorkomen dat dieren reageren.
- Houd de cup in de horizontale positie, zodat de muis zich op zowel voorpoten als achterpoten bevindt om hun gewicht gelijkmatig verdeeld te houden.
- Plaats de beker met de muis erin op de tafel onder het testrek op het absorberende pad.
- Voor periorbitale von Frey-tests plaatst u de 0,07 g von Frey-filament direct in het midden van het gezicht en tussen de ogen.
- Oefen voldoende druk uit op de gloeidraad om het von Frey-haar in een "C" -vormige formatie te laten buigen.
- Houd contact met het gebied ten minste 3 s maar niet meer dan 5 s of totdat de muis zijn kop terugtrekt en met zijn poot naar de gloeidraad veegt.
OPMERKING: Als de gloeidraad tijdens de test wegglijdt of meer dan de punt van de gloeidraad het dier raakt, mogen eventuele reacties niet worden geteld. Deze reacties kunnen een reactie zijn op de borstel die door verschillende mechanoreceptoren wordt geactiveerd en daarom mogelijk geen nauwkeurige resultaten weergeeft. - Breng von Frey filamenten aan volgens de Dixon "up-down" methode 22,23.
- Breng in eerste instantie het von Frey-filament aan dat een gewicht van 0,07 g heeft. Het laagst mogelijke filament en het hoogst geteste filament in deze studie zijn filamenten met een gewicht van respectievelijk 0,008 g en 0,6 g.
- Gebruik de filamenten met een gewicht van 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g en 0,6 g om deze test uit te voeren.
- Als een dier bij deze methode geen reactie op het filament vertoont, brengt u het filament van het volgende hogere gramgewicht aan.
- Als de muis reageert op een filament, overweeg dan dat die muis reageert op dat filament. Als dit het geval is, breng dan het filament van het volgende lagere gramgewicht aan.
- Herhaal dit patroon totdat het dier 4 keer na de eerste reactie is getest of totdat is vastgesteld dat het dier niet reageert op filamenten die in de test zijn getest.
OPMERKING: Oefen geen extra druk uit die afkomstig is van de arm of pols. Een schaal kan worden gebruikt om de toepassing van de gloeidraad te oefenen.
- Houd contact met het gebied ten minste 3 s maar niet meer dan 5 s of totdat de muis zijn kop terugtrekt en met zijn poot naar de gloeidraad veegt.
4. Toetsing van de drempelwaarden voor het opnemen van producten
- Voordat u in een experiment wordt opgenomen, moet u ervoor zorgen dat de muizen een basisonttrekkingsdrempel tussen 0,5-0,6 g bereiken.
- Een muis bereikt de basislijn als hij niet reageert op een filament dat is getest in de reeks die is vermeld in stap 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g en 0,6 g).
- Test muizen dagelijks bij het vaststellen van baseline terugtrekkingsdrempels.
- Testen stelt dieren in staat om te wennen aan de testomstandigheden en de druk van de von Frey filamenten.
- Als de muizen na de derde testdag nog steeds extreem overgevoelig zijn, probeer dan 1 of 2 dagen te wachten voordat ze opnieuw testen.
OPMERKING: Te veel tijd tussen de testdagen kan ertoe leiden dat het dier zich niet aanpast aan het gewicht van de gloeidraad op zijn periorbitale gebied, waardoor de beoogde terugtrekkingsdrempel niet wordt bereikt.
- Test muizen gedurende ongeveer 7 dagen voordat wordt bepaald welke dieren niet voldoen aan de inclusiecriteria voor een experiment.
OPMERKING: Ongeveer 70% van de muizen zal het beoogde basisniveau bereiken.- Analyseer voorafgaand aan durale stimulatie de basislijngegevens om elke muis uit te sluiten die geen basislijnwaarde van 0,5-0,6 gram of hoger heeft bereikt.
- Wijs na uitsluiting willekeurig elke resterende muis toe aan een testgroep. Bereik dit door uit een kopje te trekken of een script op een spreadsheet te schrijven om getallen naar een groep te randomiseren.
5. Analyse van de resultaten van von Frey
- Zodra de reeks reacties is verkregen, bepaalt u de delta, k-waarde, de drempel van 50% en de opnamedrempel in grammen volgens eerder gepubliceerde methoden24.
- Bereken de opnamedrempel met behulp van deze formule WT = 10(x*F+B), waarbij WT= onttrekkingsdrempel, F = pootophouddrempel berekend volgens de Chaplan-methode, en B = lineaire regressie van log (buigkracht) = x*Filamentgetal + B.
- Plot de gegevens als 50% opnamedrempel of gemiddelde opnamedrempel in grammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze injectiemethode wordt gebruikt om stimuli toe te dienen op de dura van muizen, zodat daaropvolgende gedragstests kunnen plaatsvinden. De meest voorkomende gedragsoutput gemeten met dit model is cutane gezichtsovergevoeligheid beoordeeld via von Frey 12,13,14. Hier laten we zien hoe dit model kan worden gebruikt om potentiële geslachtsspecifieke bijdragen aan migrainepathologie te beoordelen (figuur 3).
Deze procedure is gebruikt om de effecten van duraal prolactine (PRL) op mechanisch opgewekte gezichtsovergevoeligheid14 te onderzoeken (figuur 3). De resultaten van deze studie toonden aan dat vrouwelijke ICR-muizen significant verlaagde gezichtsontwenningsdrempels vertonen als reactie op 5 μg durale prolactine (figuur 3A). Een tienvoudig lagere dosis van 0,5 μg prolactine (PRL) vertoonde ook reacties die vergelijkbaar waren met een hoge dosis PRL (figuur 3B).
Van deze injecties is ook aangetoond dat ze spontaan pijngerelateerd gedrag produceren dat wordt beoordeeld via grimas. Dural 0,5 μg PRL veroorzaakte significante grimassen bij vrouwelijke muizen (figuur 3C), wat verder een duidelijke rol aantoont voor durale PRL bij vrouwelijk migraine-achtig gedrag. We voerden grimastests uit voorafgaand aan alle tests met von Frey-filamenten.
Figuur 1: Durale infuser en injectieplaatsing. (A) De injectoren/infusers bestaan uit een aangepaste canule aangepast aan de lengte van ~0,5 mm- 0,65 mm en bevestigd aan een naald die via tygonbuizen op een 10 μL gasdichte spuit is gecementeerd. (B) Luchtfoto van de gemarkeerde plaats van de injectieplaats op de kop van de muis. (C) (Linkerpaneel) Diagram van de plaats van de durale injectie. Plaatsing van de injectie is op de kruising van de lambdoïde en sagittale hechtingen op ongeveer 4,8 mm na bregma. (Middelste paneel) Post-mortem luchtfoto van een muizenschedel na durale injectie van 5 μL blauwe injectiekleurstof. (Rechter paneel) Scheiding van het keppeltje van de muis van de hersenen. Er was geen waarneembare lekkage van blauwe injectiekleurstof op de hersenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: von Frey Testkamers. (A) von Frey testkamer bestaande uit 3,5 x 3,5 in afzonderlijke acrylkamers met deksels geplaatst op een gaasrek. Deze zijn verbonden via kolommen van 10 kamers georganiseerd in 2 rijen. (B) Voorbeeld van muizen in hun individuele bekers gehuisvest in de von Frey-testkamers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Durale toepassing van prolactine induceert gedragsreacties bij muizen. Mechanische ontwenningsdrempels werden beoordeeld na durale toepassing van PRL (5 μg of 0,5 μg) bij vrouwelijke muizen. (A) Toepassing van 5 μg PRL (n = 7 PRL, n = 6 medium) veroorzaakte overgevoeligheid van het gezicht in vergelijking met het medium. (B) Toepassing van 0,5 μg PRL (n = 5 PRL, n = 4 vehiculeerde) veroorzaakte langdurige overgevoeligheid van het gezicht. (C) Grimas werd ook beoordeeld bij dezelfde muizen die op elk tijdstip met 0,5 μg PRL werden behandeld. Deze muizen vertoonden significant hogere grimasscores in vergelijking met de muizen die met een voertuig werden behandeld. Statistieken: Tweerichtings-ANOVA gevolgd door Bonferroni meervoudige vergelijking post-hoc analyse. Gegevens worden weergegeven als middelen ± SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onaangepaste veranderingen in het lokale nociceptieve systeem in de dura worden beschouwd als een belangrijke bijdrage aan de hoofdpijnfase van migraineaanvallen ondanks een gebrek aan weefselbeschadiging 25,26. Hier presenteert de studie een methode waarbij minimaal invasieve stimulatie van de dura tactiele overgevoeligheid van het gezicht kan induceren. Het ophelderen van de mechanismen en gebeurtenissen die betrokken zijn bij durale nociceptoractivatie zonder schade aan de schedel en weefsels te veroorzaken, kan migrainemechanismen nauwkeuriger weergeven in een preklinisch model.
Craniotomie en canule-implantatie worden al lang gebruikt om functies en mechanismen te beoordelen die bijdragen aan migrainepijn11,12. Er is echter gemeld dat een craniotomie activering van durale mestcellen kan induceren en de piale vasculaire permeabiliteit bij knaagdieren kan verhogen27. Gezien het feit dat mestcelactivering in de dura sterk betrokken is bij migraine 7,8,28,29, heeft deze techniek belangrijke kanttekeningen die de interpretatie kunnen vertekenen. Het toedienen van stoffen via de kruising van de sagittale en lambdoïdale hechtingen vermindert effectief de activering van nociceptoren gemedieerd door craniotomie-geïnduceerde mestcelactivatie. Bovendien vereist niet-invasieve durale stimulatie geen postoperatief herstel en toediening van analgetica die de interpretatie van de resultaten kunnen veranderen. Lokale toepassing van stoffen op de dura stelt onderzoekers in staat zich te concentreren op dit specifieke doelweefsel, in tegenstelling tot systemische toediening van geneesmiddelen waarbij de plaats van actie niet gemakkelijk kan worden bepaald 12,13,14. Hoewel systemische toediening van stoffen zoals nitroglycerine en calcitonine-gengerelateerde peptide experimentele aanvallen bij mensen veroorzaken die vergelijkbaar zijn met migraine, laten ze geen beoordeling toe van de locatie van actie in knaagdiermodellen; meer gerichte weefselspecifieke modellen bieden een alternatieve aanpak.
Deze hier beschreven techniek omvat het injecteren van een geneesmiddel of andere oplossing rechtstreeks op de dura mater van de hersenvliezen door de kruising waar de sagittale en lambdoïdale hechtingen van de schedel elkaar ontmoeten. Voor de beste resultaten moeten ICR (CD-1) of C57/BL6 muizen van 6-8 weken worden gebruikt voor deze experimenten. Jongere muizen kunnen worden gebruikt; het gebruik van ICR (CD-1) muizen die ouder zijn dan 8 weken worden echter niet aanbevolen, omdat hun schedelplaatnaden meestal volledig zijn gefuseerd door deze leeftijd, waardoor het onmogelijk is om te injecteren zonder de schedel te beschadigen. Het is ook van cruciaal belang om rekening te houden met het gewicht / de grootte van elke muis die deze procedure zal ondergaan. Het wordt aanbevolen dat deze injecties worden uitgevoerd bij dieren met een gewicht van meer dan 19 g, omdat de schedel meestal erg dun is bij lagere gewichten en mogelijk niet bestand is tegen de druk die tijdens de injectie wordt uitgeoefend. Van belang zijn er ook waarschijnlijke factoren die bijdragen aan de leeftijd / het gewicht waarop schedelplaatfusie optreedt (bijvoorbeeld de samenstelling van laboratorium chow die wordt gebruikt in dierenfaciliteiten). Daarom moeten experimentatoren mogelijk het leeftijds- / gewichtsbereik bepalen dat geschikt is onder hun eigen omstandigheden. Verschillende leeftijdscategorieën en diergewichten kunnen nodig zijn voor andere muizenstammen of genotypen, afhankelijk van wanneer de schedelplaten bij die dieren samensmelten, en kunnen ook optimalisatie van de injectie zelf vereisen.
Bij het leren of oefenen van deze techniek wordt het ten zeerste aanbevolen dat een niveau van comfort wordt verkregen met het lokaliseren van de hechtingsverbinding bij geëuthanaseerde muizen. Het kan het beste zijn om eerst te oefenen met de hoofdhuid weggesneden of geschild in deze muizen en langzaam door te gaan naar het lokaliseren van de kruising door de huid. Zodra de precieze locatie is vastgesteld, kunnen inkten en kleurstoffen in de dura worden geïnjecteerd om de locatienauwkeurigheid en diepte van de injectie te verifiëren. Deze techniek werd ontwikkeld en geoptimaliseerd met behulp van ICR (CD-1) muizen (30-35 g) en C57/BL6 muizen (25-30 g). Een infuserlengte van 0,5-0,6 mm is voldoende om een muis met een gewicht binnen het bereik van 25-35 g te injecteren. De lengte van de infuser moet echter mogelijk worden gekalibreerd als muizen worden geïnjecteerd die aanzienlijk verschillen van de muizen die worden gebruikt om deze techniek te optimaliseren. Een muis kleiner dan 25 g zou bijvoorbeeld waarschijnlijk resulteren in het gebruik van een infuser met een lengte van minder dan 0,5 mm. Bij het beheersen van deze techniek en wanneer uitgevoerd bij leeftijdsgeschikte muizen, kan het slagingspercentage van deze injectie dicht bij 100% liggen; complicaties met de injectie kunnen echter het gevolg zijn van problemen zoals het breken van de schedel als gevolg van het toepassen van te veel kracht om de infuser in te brengen, evenals abnormale bloedingen veroorzaakt door beschadiging van meningeale bloedvaten.
Veranderingen in tactiele gevoeligheid zijn een belangrijke meting bij het beoordelen van pijngedrag bij knaagdieren. Hier demonstreren we het gebruik van periorbitale von Frey-testen om dit gedrag te beoordelen in een preklinisch migrainemodel. Een groot voordeel van het gebruik van deze techniek in migrainemodellen is dat we overgevoeligheid van het hoofd kunnen beoordelen, die meer relevantie heeft dan andere niet-craniale locaties zoals poten. De cruciale stap om reproduceerbare resultaten te garanderen, is ervoor te zorgen dat de muizen volledig worden gebufferd. Dit vereist een goed getrainde experimentator die von Frey-filamenten precies kan toepassen. Het is waarschijnlijk dat het ongeveer 7 dagen duurt voordat een dier de basislijn bereikt. Het is echter mogelijk dat niet elk dier de beoogde basislijn zal bereiken. In onze ervaring zal na ongeveer 7 dagen werken met muizen slechts 60% -70% van de dieren een basislijn van 0,6 g bereiken in het periorbitale gebied, maar dit is afhankelijk van het cohort dieren. Deze timing moet worden overwogen voordat met een experiment wordt begonnen om ervoor te zorgen dat voldoende aantallen worden gebruikt om rekening te houden met uitval en dat dieren de juiste leeftijd hebben na baseline voor het gebruik van deze niet-invasieve methode om de dura te stimuleren. De stappen voor het bepalen van een basislijn worden beschreven in protocolsectie 4.
Een beperking van von Frey-testen is dat het moeilijk kan zijn om onderscheid te maken tussen pijnreacties en routinematige verzorging / jeuk. Om pijn van verzorging te helpen onderscheiden, is het belangrijk om op te merken hoe lang dit gedrag optreedt. Meestal is een pijnreactie één veeg na de filamenttoepassing, terwijl het verzorgingsgedrag meestal langdurig is en enkele seconden tot minuten kan duren. Als het verzorgings-/jeukgedrag niet te onderscheiden is van een overgevoelige reactie, kun je dit het beste niet als reactie registreren. Bovendien kan onjuiste plaatsing van het filament (bijv. filament dat wegglijdt) resulteren in langdurige verzorging van het dier, waardoor het moeilijk wordt om goed te testen. Als dit gebeurt, moet de experimentator wachten tot de verzorging is gestopt en de muis kalm genoeg is om te testen. Ga verder met hetzelfde filament dat vóór het begin van het verzorgingsgedrag werd gebruikt. Als de muis zeer lang aanhoudt, plaatst u de muis ongeveer 5 minuten terug in de testkamer. Zodra de 5 minuten zijn verstreken, probeert u de muis opnieuw te testen. Als dit gedrag zonder oplossing doorgaat, moeten de muizen uit het onderzoek worden verwijderd. Van belang is dat het niet wordt aanbevolen om de vacht op het gezicht te scheren, omdat het onduidelijk is of de huid van muizen dezelfde gevoeligheid behoudt nadat het haar is verwijderd, en het proces van ontharing (scheren, ontharingscrèmes) kan ook de gevoeligheid van de huid beïnvloeden.
In de meeste situaties is het ideaal voor het toedienen van stoffen op de dura niet meer dan 24 uur nadat de muis de basislijn heeft bereikt. Het wordt aanbevolen dat muizen eenmaal per uur worden onderworpen aan von Frey filamenttests. Indien mogelijk geeft het testen om het uur voldoende tijd voor de dieren om te kalmeren na het testen. Bovendien moeten experimenten worden getimed om hun circadiane patronen niet te verstoren. Veranderingen in het circadiane ritme bij muizen kunnen gedragsfenotypen veranderen en uiteindelijk resulteren in onherleidbare resultaten.
Periorbitale von Frey-testen kunnen worden gebruikt in combinatie met andere gedragstests om experimentele conclusies te versterken. De grimasschaal is gebaseerd op spontane gezichtsuitdrukkingen bij knaagdieren in plaats van opgeroepen reacties18,19. Deze methode heeft een hoge nauwkeurigheid en betrouwbaarheid bij het beoordelen en kwantificeren van acuut pijngedrag en is gebruikt in veel preklinische modellen van migraine12,30. Bij het gebruik van zowel grimas- als periorbitale von Frey-assays moet de experimentator overwegen om te scoren op grimas voordat von Frey-filamenten op het periorbitale gebied van de muis worden aangebracht. Dit zorgt ervoor dat het grimassende gedrag spontaan is en niet wordt opgeroepen door filamenttoepassing. Hindpaw mechanische overgevoeligheid kan ook worden gebruikt in combinatie met periorbitale von Frey-testen. In tegenstelling tot grimasscores, is het het beste om gezichtsovergevoeligheid te testen voordat de overgevoeligheid van de achterpoot wordt beoordeeld. Hindpaw-testen vereisen dat de muis zonder de cup terug in de kamer wordt geplaatst nadat de periorbitale von Frey-tests zijn voltooid.
Kortom, periorbitale von Frey-testen en niet-invasieve durale stimulatie bij muizen voegen waardevolle opties toe aan het huidige scala aan preklinische modellen van migraine. Wanneer correct uitgevoerd, presenteert deze techniek een verfijnde benadering voor het genereren van een hoofdpijnachtig fenotype bij knaagdieren, omdat het geen chirurgische implantatie van een canule vereist. Bij ratten zijn canules gevoelig voor bacteriële infecties, kunnen ze verstopt raken, kunnen ze afvallen en moeten ze elk dier in één huis hebben, waardoor onnodige stress op het dier ontstaat. Bovendien kan het durale stimulatieprotocol eenvoudig worden aangepast voor gebruik met verschillende medicijntoepassingen. Periorbitale von Frey-testparadigma's kunnen ook worden aangepast om het beste aan de experimentele specificaties te voldoen. Bovendien kunnen periorbitale von Frey-tests worden gebruikt bij andere orofaciale pijnstoornissen. Deze technieken zijn een belangrijk hulpmiddel om de complexe onderliggende mechanismen van migrainepijn verder te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NS104200 en NS072204 tot GD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 oz Hot Paper Cups | Choice Paper Company | 5004W | https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html |
| Absorbent Underpads | Fisherbrand | 14-206-65 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048 |
| C313I/SPC Internal 28 G cannula | P1 Technologies (formerly Plastics One) | 8IC313ISPCXC | I.D. 18 mm, O.D. 35 mm |
| Gastight Model 1701 SN Syringes | Hamilton | 80008 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008 |
| Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm | Cole-Palmer | EW-96460-10 | https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010 |
| Stand with chicken wire | Custom | The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge | |
| Testing Rack with individual Chambers | Custom | Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup. | |
| von Frey Filaments | Touch test/Stoelting | 58011 | https://www.stoeltingco.com/touch-test.html |
References
- GBD 2016 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Woldeamanuel, Y. W., Cowan, R. P. Migraine affects 1 in 10 people worldwide featuring recent rise: A systematic review and meta-analysis of community-based studies involving 6 million participants. Journal of the Neurological Sciences. 372, 307-315 (2017).
- Burch, R. C., Loder, S., Loder, E., Smitherman, T. A. The prevalence and burden of migraine and severe headache in the United States: updated statistics from government health surveillance studies. Headache. 55 (1), 21-34 (2015).
- Ashina, M.
- Ashina, M., et al. Migraine: integrated approaches to clinical management and emerging treatments. Lancet. 397 (10283), 1505-1518 (2021).
- Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: Moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
- Koyuncu Irmak, D., Kilinc, E., Tore, F. Shared Fate of Meningeal Mast Cells and Sensory Neurons in Migraine. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 136 (2019).
- Levy, D. Migraine pain, meningeal inflammation, and mast cells. Current Pain and Headache Reports. 13 (3), 237-240 (2009).
- Levy, D., Labastida-Ramirez, A., MaassenVanDenBrink, A. Current understanding of meningeal and cerebral vascular function underlying migraine headache. Cephalalgia. 39 (13), 1606-1622 (2019).
- Phebus, L. A., Johnson, K. W. Dural inflammation model of migraine pain. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
- Fried, N. T., Maxwell, C. R., Elliott, M. B., Oshinsky, M. L. Region-specific disruption of the blood-brain barrier following repeated inflammatory dural stimulation in a rat model of chronic trigeminal allodynia. Cephalalgia. 38 (4), 674-689 (2018).
- Avona, A., et al. Dural calcitonin gene-related peptide produces female-specific responses in rodent migraine models. The Journal of Neuroscience. 39 (22), 4323-4331 (2019).
- Burgos-Vega, C. C., et al. Non-invasive dural stimulation in mice: A novel preclinical model of migraine. Cephalalgia. 39 (1), 123-134 (2019).
- Avona, A., et al. Meningeal CGRP-Prolactin interaction evokes female-specific migraine behavior. Annals of Neurology. 89 (6), 1129-1144 (2021).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Lipton, R. B., et al.
- Goadsby, P. J. Migraine, allodynia, sensitisation and all of that. European Neurology. 53, Suppl 1 10-16 (2005).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
- Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
- Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 11 (2019).
- Mason, B. N., et al. Induction of migraine-like photophobic behavior in mice by both peripheral and central CGRP mechanisms. The journal of Neuroscience. 37 (1), 204-216 (2017).
- Dixon, W. J., Mood, A. M. A method for obtaining and analyzing sensitivity data. The Journal of the American Statistical Association. 43 (241), 109-126 (1948).
- Dixon, W. The up-and-down method for small samples. The Journal of the American Statistical Association. 60, (1965).
- Bonin, R. P., Bories, C., De Koninck, Y. A simplified up-down method (SUDO) for measuring mechanical nociception in rodents using von Frey filaments. Molecular Pain. 10, 26 (2014).
- Ramachandran, R. Neurogenic inflammation and its role in migraine. Seminars in Immunopathology. 40 (3), 301-314 (2018).
- Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K. Does inflammation have a role in migraine. Nature Reviews Neurology. 15 (8), 483-490 (2019).
- Stokely, M. E., Orr, E. L. Acute effects of calvarial damage on dural mast cells, pial vascular permeability, and cerebral cortical histamine levels in rats and mice. Journal of Neurotrauma. 25 (1), 52-61 (2008).
- Theoharides, T. C., Donelan, J., Kandere-Grzybowska, K., Konstantinidou, A. The role of mast cells in migraine pathophysiology. Brain Research Reviews. 49 (1), 65-76 (2005).
- Conti, P., et al. Progression in migraine: Role of mast cells and pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. European Journal of Pharmacology. 844, 87-94 (2019).
- Rea, B. J., et al. Peripherally administered calcitonin gene-related peptide induces spontaneous pain in mice: implications for migraine. Pain. 159 (11), 2306-2317 (2018).
