Summary
O sintoma mais notável da enxaqueca é a dor severa na cabeça, e é supor que isso é mediado por neurônios sensoriais que inervam as meninges. Aqui, apresentamos um método para aplicar localmente substâncias à dura de forma minimamente invasiva ao usar a hipersensibilidade facial como saída.
Abstract
As meninges cranianas, compostas pela dura mater, aracnoide e pia mater, são pensadas para servir principalmente funções estruturais para o sistema nervoso. Por exemplo, eles protegem o cérebro do crânio e ancoram/organizam o suprimento vascular e neuronal do córtex. No entanto, as meninges também estão implicadas em distúrbios do sistema nervoso, como a enxaqueca, onde a dor experimentada durante uma enxaqueca é atribuída à inflamação estéril local e posterior ativação de aferentes nociceptivos locais. Das camadas nas meninges, a dura-mater é de particular interesse na fisiopatologia das enxaquecas. É altamente vascularizado, abriga neurônios nociceptivos locais, e abriga uma variedade diversificada de células residentes, como células imunes. Mudanças sutis no microambiente meningeal local podem levar à ativação e sensibilização dos nociceptores perivasculares durais, levando assim à dor da enxaqueca. Estudos têm procurado abordar como os aferentes durais se tornam ativados/sensibilizados usando eletrofisiologia in vivo, técnicas de imagem ou modelos comportamentais, mas estes geralmente requerem cirurgias muito invasivas. Este protocolo apresenta um método para aplicação comparativamente não invasiva de compostos na dura-idade em camundongos e um método adequado para medir a sensibilidade tátil semelhante à dor de cabeça usando testes periorbitais von Frey após a estimulação dural. Este método mantém a integridade da dura e do crânio e reduz os efeitos de confusão de técnicas invasivas ao injetar substâncias através de uma cânula modificada de 0,65 mm na junção de suturas sagicionais e lambdoides não afusadas. Este modelo pré-clínico permitirá que os pesquisadores investiguem uma ampla gama de estímulos duradouros e seu papel na progressão patológica da enxaqueca, como ativação de nociceptor, ativação de células imunes, alterações vasculares e comportamentos de dor, tudo isso mantendo condições livres de lesões no crânio e meninges.
Introduction
A dor da enxaqueca continua sendo um grande problema de saúde pública em todo o mundo. A Organização Mundial da Saúde classifica-a como a sexta doença mais prevalente no mundo, acometendo pouco menos de 15% da população da Terra1 e causando uma carga socioeconômica substancial sobre a sociedade 2,3. As opções de tratamento e sua eficácia têm sido subótimas e apenas proporcionam alívio sintomático e não modificam significativamente eventos fisiopatológicos que subjacentes à ocorrênciade enxaqueca 4,5. A falta de sucesso do tratamento deve-se provavelmente à enxaqueca ser uma doença multifatorial cuja patologia é mal compreendida, levando a um número limitado de alvos terapêuticos. A enxaqueca também é desafiadora para capturar totalmente em modelos animais, especialmente dado que o diagnóstico de enxaqueca é feito com base na comunicação verbal com pacientes que descrevem sua experiência com marcas de enxaqueca, como aura, dor de cabeça, fotofobia e aodynia. Não obstante, é importante notar que os recentes avanços nos tratamentos para enxaqueca estão atualmente superando os tratamentos para muitas condições neurológicas que foram bem validadas por modelos pré-clínicos. Por exemplo, anticorpos monoclonais e pequenas moléculas que visam o peptídeo relacionado à calcitonina, ou seu receptor têm sido muito bem sucedidos em melhorar a qualidade de vida dos portadores de enxaqueca e podem potencialmente transformar o manejo clínico da enxaqueca. Embora tenha havido avanço na compreensão desse transtorno, ainda não há muito a ser elucidado.
Com base em modelos de animais pré-clínicos e estudos humanos, é amplamente aceito que as dores de cabeça da enxaqueca são iniciadas pela ativação aberrante de fibras nociceptivas dentro das meninges que sinalizam através da gânglio dorsal trigêmeo e superior 6,7,8,9,10. Apesar dessa teoria, muitos estudos ainda utilizam a administração sistêmica de drogas para entender mecanismos subjacentes contribuintes na enxaqueca. Embora a dosagem sistêmica de drogas tenha reforçado substancialmente nosso entendimento, esses achados não avaliam diretamente se as ações locais dentro do tecido alvo de interesse desempenham um papel na enxaqueca. Por outro lado, vários estudos têm tomado uma abordagem para estimular a dura; no entanto, esses experimentos requerem implantação de cânula através de uma craniotomia invasiva erecuperação estendida vezes 11,12. Por causa dessas limitações, desenvolvemos uma abordagem minimamente invasiva para estimular localmente a dura duração onde a falta de uma craniotomia elimina a recuperação pós-cirúrgica e permite o teste imediato em animais acordados 12,13,14. Estas injeções são realizadas sob anestesia isoflurana leve e administradas na junção das suturas sagital e lambdoid em camundongos.
Várias abordagens foram desenvolvidas para avaliar respostas comportamentais nociceptivas em roedores15. A aodídia cutânea foi relatada em aproximadamente 80% dos portadores de enxaqueca16,17 e representa um ponto final translacional potencial para uso em roedores. Em modelos pré-clínicos, a aplicação de filamentos von Frey na região plantar da pata de roedor tem sido usada para avaliar comportamentos de dor em modelos de enxaqueca pré-clínico. A principal limitação dessa abordagem é que ela não testa a região cefálica. A pontuação da careta facial tem sido usada para capturar comportamentos de dor em roedores, analisando expressões faciais após a indução de estímulos de dor18,19. No entanto, suas limitações incluem apenas capturar respostas a estímulos agudos e não condições crônicas de dor orofacial. O preparo facial e a diminuição da criação também são considerados saídas de respostas comportamentais em modelos pré-clínicos de enxaqueca20,21. As limitações do primeiro incluem a dificuldade em diferenciar as respostas à dor do preparo normal da rotina e outras sensações, como coceira. No caso deste último, os comportamentos de criação normalmente diminuem rapidamente após a introdução de roedores em novos ambientes. Embora cada um desses pontos finais comportamentais seja valioso na compreensão de vários mecanismos que contribuem para as condições de dor, há uma necessidade crítica de modelos pré-clínicos de distúrbios da dor, como enxaqueca, para incluir pontos finais que capturam especificamente respostas de hiperssensibilidade cefálica. Avaliar a hipersensibilidade tátil da pele periorbital após a estimulação dura é um método que pode fornecer uma melhor visão dos mecanismos que contribuem para enxaquecas onde os sintomas sensoriais são predominantemente cefálicos na natureza. Aqui, descrevemos um método para administrar substâncias na dura do rato como um modelo pré-clínico de enxaqueca. Após a aplicação dural, também apresentamos um método detalhado para testar a hipersensibilidade tátil periorbital usando filamentos von Frey calibrados aplicados no método de up-down de Dixon.
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Protocol
Todos os procedimentos foram conduzidos com aprovação prévia do Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais na Universidade do Texas em Dallas. Foram utilizados neste estudo os camundongos ICR (CD-1) (30-35 g) e C57/BL6 (25-30 g) com idade entre 6 e 8 semanas.
1. Infusor dural
- Crie os infundadores/injetores do mouse modificando uma cânula interna e infusora disponível comercialmente para injeções unilaterais com uma tampa de plástico de sílica fundida não metálica que seja ajustável e insira em/se estende abaixo de uma cânula guia de 28 G com diâmetro interno (CID) de 0,18 mm e um diâmetro externo (O.D.) de 0,35 mm (Figura 1A).
- Use uma pinça ou outro dispositivo de medição para ajustar a tampa de plástico de sílica fundida no infusor a um comprimento de 0,6 mm; medido da ponta do infusor até a borda da tampa plástica de sílica.
- Tome cuidado para não dobrar ou embotar o infusor ao ajustar a tampa plástica.
- Para outras cepas de camundongos que não tenham sido usadas anteriormente para injeções durais, determine o comprimento ideal do infusor, definindo o comprimento para 0,6 mm e conduzindo injeções piloto com tinta ou corante, ajustando o comprimento do infusor até que se observe que o corante está apenas na dura-mater e não no cérebro ou no crânio.
- Anexar a extremidade longa (ou a extremidade que não foi medida para ser 0,6 mm) do infusor ajustado ao tubo plástico (tubo de bomba, 2 paradas, 0,19 mm de identidade, comprimento de 406 mm).
- Corte a tubulação para um comprimento mínimo de 8 para garantir que haja linha suficiente para segurar um volume de 5 μL.
- Certifique-se de que o tubo cubra a parte metálica e a parte superior da rolha de plástico localizada no infusor. Isso ajudará a evitar que as bolhas de ar se acumulem na linha.
- Fixar a outra extremidade da tubulação a uma microseria de vidro de 10 μL (gás-apertado; agulha cimentada; 21 G com projeção de 10 mm), novamente, certificando-se de ter uma vedação apertada sobre a parte metálica da seringa (Figura 1A).
- Uma vez que a linha esteja conectada, enchimento de fundo a seringa com 5 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), fluido intersticial sintético (SIF) ou outros veículos de escolha para evitar a formação de bolhas de ar.
- Se as bolhas de ar forem observadas na linha, inunde a linha com o veículo até que as bolhas se dissipem.
NOTA: Pode ajudar a encher a seringa com o veículo antes de anexá-la à linha e, em seguida, empurrar o fluido através da linha uma vez conectado.
- Se as bolhas de ar forem observadas na linha, inunde a linha com o veículo até que as bolhas se dissipem.
- Depois que a linha estiver recheada com 5 μL do veículo e esteja funcionando de forma eficiente, carregue 5 μL da droga/solução na seringa Hamilton (tinta ou corante pode ser usado como alternativa à droga/solução se aprender ou praticar essa técnica).
- Certifique-se de que todas as soluções de veículos administradas na dura são mantidas em pH 7.4 e medidas a uma osmolalidade de 310. Isso reduz a ativação potencial de canais de íons de sensor de ácido e outros canais osmosensíveis dentro da dura.
- O volume máximo testado em camundongos que não causaram vazamento no cérebro é de aproximadamente 10 μL. Os efeitos comportamentais após injeções com este volume não foram testados. Por esta razão, administre apenas 5 μL da solução na dura.
NOTA: Estas observações são baseadas nas cepas/idades/pesos do camundongo de 6-8 semanas de idade CD1/ICR.
2. Injeções dural
- Uma vez que a seringa esteja preparada e a droga esteja carregada, posicione um rato plano em seu abdômen e anestesia-o sob breve isoflurane de 3% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,5-1 L/min via nariz.
- Depois que o mouse não exibir mais um reflexo de pinça, ajuste a anestesia e sustente-a a um isoflurane de 1,5%.
- Uma vez anestesiado, aplique pomada opthalmic estéril nos olhos e raspe a cabeça do animal, em seguida, desinfete a pele com povidone-iodo e etanol. Depois disso, fique em uma posição propícia a uma injeção bem sucedida.
- Use uma mão para estabilizar a cabeça do animal e segure o infusor com a outra mão.
- Teste cuidadosamente e localize a junção das suturas sagital e lambdoidal no crânio do rato (Figura 1B, C).
- Para localizar esta discreta junção através da pele, use as características topográficas do crânio e teste suavemente a localização geral da junção com o infusor.
- Verifique a posição da junção ree posicionando o infusor ao longo do crânio e sentindo a localização exata.
- Uma vez que a sutura esteja localizada e o infusor esteja no lugar, muito lentamente e suavemente, mova o infusor para frente e para trás até perfurar a pele e cair na junção até a rolha de plástico.
NOTA: Certifique-se de inserir toda a ponta de 0,6 mm do infusor na junção. - Para verificar a precisão, use tinta ou corante como solução de injeção e eutanize e decapite o mouse.
- Remova a tampa do crânio para visualizar o corante dentro da dura-mater (Figura 1C).
NOTA: O corante não deve ser observado no cérebro ou no exterior do crânio. Da mesma forma, os camundongos em qualquer experimento devem ser verificados após a morte para verificar a precisão da injeção, bem como para garantir que a integridade do dura mater não tenha sido danificada.
- Remova a tampa do crânio para visualizar o corante dentro da dura-mater (Figura 1C).
- Após a injeção, remova o rato da anestesia, espere que ele recupere a consciência e depois retorne à sua gaiola ou coloque-o em uma câmara de testes para iniciar os ensaios desejados.
NOTA: Deixe o rato se recuperar da anestesia por um mínimo de 30 minutos antes de fazer qualquer experimento comportamental.
3. Periorbital von Frey
- Comece o estudo com uma coorte de aproximadamente 16-20 camundongos.
- Um dia antes da habituação, manuseie cada rato por pelo menos 5 minutos.
- Aproximadamente 24 horas após o manuseio, habituar os ratos às condições da sala de testes e ao aparelho de teste von Frey (Figura 2A).
NOTA: O aparelho de teste acrílico consiste em compartimentos individuais com tampas que são aproximadamente 3 em x 3,5 em x 5 em (W x H x D) e são suportados por suportes de alumínio conectados através de 0,25 em 19 G de fio de malha de aço galvanizado quadrado.- Coloque os ratos dentro de um copo de papel branco de 4 oz horizontalmente colocado que é inodoro e não contém cera de polietileno ou parafina.
NOTA: Esses tipos de xícaras são preferidas porque reduz a perturbação gastrointestinal nos camundongos se ingeridos (Figura 2B).
- Coloque os ratos dentro de um copo de papel branco de 4 oz horizontalmente colocado que é inodoro e não contém cera de polietileno ou parafina.
- Enquanto os animais estão em suas respectivas câmaras, coloque uma pelota da dieta normal da comida na câmara individual de cada rato para acalmar os animais e evite qualquer estresse desnecessário para os animais. Faça isso por 3 dias antes de qualquer teste de comportamento von Frey.
- Certifique-se de que toda vez que os ratos estiverem na câmara que há acesso a alimentos.
- Número e atribuir cada animal ao mesmo espaço no rack de teste. Coloque o mouse no mesmo copo todos os dias do período de teste para garantir que cada animal se aclimata ao seu ambiente de teste.
NOTA: Os ratos roem as xícaras e, posteriormente, destruirão os copos. Se isso acontecer, substitua o copo e rotule-o pelo número correspondente do mouse.
- Após os 3 dias iniciais de habituação, coloque os ratos em suas câmaras individuais.
- Permita que os animais se aclimatar à sala de testes e câmaras por pelo menos 1 h antes de qualquer teste von Frey para permitir que os ratos se acalmem e, posteriormente, são mais fáceis de testar.
- Após a aclimatação para a sala no dia do teste, remova um rato enquanto estiver ainda em seu copo de sua respectiva câmara.
- Mantenha o copo na posição horizontal para que o mouse esteja em ambas as patas dianteiras e traseiras para ajudar a manter seu peso distribuído uniformemente.
NOTA: A distribuição desigual do peso pode alterar as respostas dos animais e até impedir que os animais respondam.
- Mantenha o copo na posição horizontal para que o mouse esteja em ambas as patas dianteiras e traseiras para ajudar a manter seu peso distribuído uniformemente.
- Coloque o copo com o mouse dentro da mesa abaixo do rack de teste na almofada absorvente.
- Para testes periorbitais von Frey, coloque o filamento de 0,07 g von Frey diretamente no centro do rosto e entre os olhos.
- Aplique pressão suficiente sobre o filamento para fazer com que o cabelo von Frey se dobre em uma formação em forma de "C".
- Mantenha contato com a região pelo menos 3 s, mas não mais do que 5 s ou até que o mouse retire a cabeça e deslize no filamento com a pata.
NOTA: Se o filamento escorregar ou mais do que a ponta do filamento tocar o animal durante o teste, quaisquer respostas não devem ser contadas. Essas respostas podem ser em resposta ao pincel que são ativados por diferentes mecanooreceptores e, portanto, podem não refletir resultados precisos. - Aplique filamentos von Frey de acordo com o método "up-down" de Dixon22,23.
- Inicialmente, aplique o filamento von Frey que tem um peso de 0,07 g. O filamento mais baixo possível e o filamento mais alto testado neste estudo são filamentos com pesos de 0,008 g e 0,6 g, respectivamente.
- Use os filamentos de peso 0,008 g, 0,02 g, 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g e 0,6 g para realizar este ensaio.
- Neste método, se um animal não apresentar uma resposta ao filamento, aplique o filamento do próximo peso grama mais alto.
- Se o mouse responder a um filamento, considere o mouse responsivo a esse filamento. Se este for o caso, aplique o filamento do próximo peso inferior.
- Repita este padrão até que o animal seja testado 4 vezes após a resposta inicial ou o animal esteja sem resposta a quaisquer filamentos testados no ensaio.
NOTA: Evite aplicar qualquer pressão adicional decorrente do braço ou pulso. Uma escala pode ser usada para praticar a aplicação do filamento.
- Mantenha contato com a região pelo menos 3 s, mas não mais do que 5 s ou até que o mouse retire a cabeça e deslize no filamento com a pata.
4. Teste para limiares de retirada de linha de base
- Antes da inclusão em um experimento, certifique-se de que os ratos atinjam um limite de retirada da linha de base entre 0,5-0,6 g.
- Um mouse atinge a linha de base se não responder a nenhum filamento testado na série mencionada na etapa 3.9.2.2 (0,07 g, 0,16 g, 0,4 g e 0,6 g).
- Teste os ratos diariamente ao estabelecer limites de retirada da linha de base.
- O teste permite que os animais se aclimatam às condições de teste e à pressão dos filamentos von Frey.
- Se os camundongos ainda estiverem extremamente hipersensíveis após o terceiro dia de testes, tente esperar 1 ou 2 dias antes de testar novamente.
NOTA: Muito tempo entre os dias de teste pode resultar na não adaptação do animal ao peso do filamento em sua região periorbital, não atingindo assim o limiar de retirada direcionado.
- Teste camundongos por aproximadamente 7 dias antes de determinar quais animais não atendem aos critérios de inclusão de um experimento.
NOTA: Aproximadamente 70% dos camundongos atingirão o nível de linha de base visado.- Antes da estimulação dural, analise os dados da linha de base para excluir qualquer mouse que não tenha atingido um valor de linha de base de 0,5-0,6 gramas ou superior.
- Após a exclusão, aloque aleatoriamente cada mouse restante em um grupo de teste. Consiga isso tirando um copo ou escrevendo um script em uma planilha para randomizar números para um grupo.
5. Análise dos resultados de von Frey
- Uma vez obtida a série de respostas, determine o valor delta, k, o limiar de 50% e o limiar de retirada em gramas de acordo com os métodospublicados anteriormente 24.
- Calcule o limiar de retirada utilizando esta fórmula WT = 10 (x*F+B), onde WT= limiar de retirada, F = limiar de retirada da pata calculado através do método Chaplan, e B = regressão linear de tronco (força de dobra) = x*Número de filamento + B.
- Plote os dados como limite de retirada de 50% ou limite médio de retirada em gramas.
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Representative Results
Este método de injeção é usado para administrar estímulos na duração de camundongos para que testes comportamentais subsequentes possam ocorrer. A saída comportamental mais comum medida com este modelo é a hipersensibilidade facial cutânea avaliada via von Frey 12,13,14. Aqui mostramos como esse modelo pode ser usado para avaliar potenciais contribuições específicas do sexo para a patologia da enxaqueca (Figura 3).
Este procedimento tem sido usado para examinar os efeitos da prolactina dural (PRL) na hipersensibilidade facial mecanicamente evocada14 (Figura 3). Os resultados deste estudo demonstraram que os camundongos ICR femininos mostram limiares de abstinência facial significativamente reduzidos em resposta a 5 μg de prolactina dural (Figura 3A). Uma dose dez vezes menor de 0,5 μg de prolactina (PRL) também apresentou respostas semelhantes à alta dose de PRL (Figura 3B).
Essas injeções também têm sido demonstradas para produzir comportamentos espontâneos relacionados à dor avaliados via careta. Dural 0,5 μg de PRL causou grimacing significativo em camundongos fêmeas (Figura 3C), demonstrando ainda um papel claro para a PRL dural em comportamentos femininos semelhantes à enxaqueca. Fizemos ensaios de careta antes de todos os testes com filamentos von Frey.
Figura 1: Infusor dural e colocação de injeção. (A) Os injetores/infundadores consistem em uma cânula modificada ajustada ao comprimento de ~0,5 mm- 0,65 mm e presa a uma agulha cimentada em uma seringa de 10 μL a gás-apertada através de tubos de tygon. (B) Vista aérea do local do local da injeção marcada na cabeça do mouse. (C) (Painel esquerdo) Diagrama da localização da injeção dural. A colocação da injeção é na junção das suturas lambdoid e sagital a aproximadamente 4,8 mm posteriores ao bregma. (Painel do meio) Visão aérea pós-morte de um crânio de rato após injeção dural de 5 μL de corante de injeção azul. (Painel direito) Separação da caveira do rato do cérebro. Não houve vazamento observável de corante de injeção azul no cérebro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: von Frey Câmaras de teste. (A) von Frey câmara de teste composta de 3,5 em x 3,5 em câmaras de acrílico individuais com tampas colocadas em um rack de malha de arame. Estes estão conectados através de colunas de 10 câmaras organizadas em 2 linhas. (B) Exemplo de ratos em seus copos individuais alojados dentro das câmaras de teste von Frey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A aplicação dura da prolactina induz respostas comportamentais em camundongos. Os limiares de abstinência mecânica foram avaliados após a aplicação dural de PRL (5 μg ou 0,5 μg) em camundongos fêmeas. (A) Aplicação de 5 μg de PRL (n = 7 PRL, n = 6 veículo) induzida hipersensibilidade facial em relação ao veículo. (B) Aplicação de 0,5 μg de PRL (n = 5 PRL, n = 4 veículo) induzida hipersensibilidade facial de longa duração. (C) A careta também foi avaliada nos mesmos camundongos tratados com 0,5 μg de PRL em cada ponto de tempo. Estes camundongos apresentaram escores de careta significativamente maiores em comparação com os camundongos tratados com veículo. Estatísticas: ANOVA bidirecional seguida pela análise pós-hoc de comparação múltipla de Bonferroni. Os dados são representados como meios ± SEM. *p < 0,05, ****p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As alterações maladaptivas no sistema nociceptivo local na dura são consideradas um dos principais contribuintes para a fase de dor de cabeça dos ataques de enxaqueca, apesar da falta de lesão tecidual25,26. Aqui o estudo apresenta um método pelo qual a estimulação minimamente invasiva da dura dura pode induzir hipersensibilidade tátil facial. Elucidar os mecanismos e eventos envolvidos na ativação do nociceptor dural sem causar danos ao crânio e tecidos pode refletir com mais precisão os mecanismos de enxaqueca em um modelo pré-clínico.
A craniotomia e a implantação de cânulas têm sido utilizadas há muito tempo para avaliar funções e mecanismos que contribuem para a dor da enxaqueca11,12. No entanto, foi relatado que uma craniotomia pode induzir a ativação de células de mastro dural e aumentar a permeabilidade vascular de pial em roedores27. Dado que a ativação de células de mastro na dura é altamente implicada na enxaqueca 7,8,28,29, essa técnica tem grandes ressalvas que podem distorcer a interpretação. A administração de substâncias através da junção das suturas sagita e lambdoidal diminui efetivamente a ativação de nociceptores mediados pela ativação de células de mastrotomia induzidas por craniotomia. Além disso, a estimulação dural não invasiva não requer recuperação pós-cirúrgica e administração de analgésicos que podem alterar a interpretação dos resultados. A aplicação local de substâncias na dura permite que os pesquisadores se concentrem neste tecido alvo específico, em oposição à administração sistêmica de drogas onde o local de ação não é facilmente determinado 12,13,14. Embora a administração sistêmica de substâncias como nitroglicerina e peptídeo relacionado ao gene de calcitonina desencadeie ataques experimentais em humanos semelhantes às enxaquecas, eles não permitem a avaliação da localização da ação em modelos de roedores; modelos mais específicos de tecido direcionados oferecem uma abordagem alternativa.
Esta técnica descrita aqui envolve injetar uma droga ou outra solução diretamente na dura-secúrie das meninges através da junção onde as suturas sagital e lambdoidal do crânio se encontram. Para obter melhores resultados, devem ser usados os camundongos ICR (CD-1) ou C57/BL6 com idade entre 6 e 8 semanas para esses experimentos. Podem ser usados camundongos mais jovens; no entanto, o uso de camundongos ICR (CD-1) com mais de 8 semanas não são recomendados, pois suas suturas de placas de crânio são tipicamente completamente fundidas por esta idade, tornando impossível injetar sem danificar o crânio. Também é fundamental considerar o peso/tamanho de cada rato que será submetido a este procedimento. Recomenda-se que essas injeções sejam realizadas em animais que tenham um peso superior a 19 g, pois o crânio é tipicamente muito fino em pesos mais baixos e pode não suportar a pressão aplicada durante a injeção. De importância, há também fatores prováveis que contribuem para a idade/peso em que ocorre a fusão da placa do crânio (por exemplo, a composição da chow de laboratório usada em instalações animais). Portanto, os experimentadores podem precisar determinar a faixa etária/peso adequada em suas próprias condições. Diferentes faixas etárias e pesos animais podem ser necessários para outras cepas de camundongos ou genótipos, dependendo de quando as placas do crânio se fundem nesses animais, e também podem exigir otimização da própria injeção.
Ao aprender ou praticar essa técnica, é altamente recomendável que um nível de conforto seja obtido com a localização da junção de sutura em camundongos eutanizados. Pode ser melhor praticar pela primeira vez com o couro cabeludo extirpado ou descascado para trás nestes camundongos e avançar lentamente para localizar a junção através da pele. Uma vez que estabelecer a localização precisa, tintas e corantes podem ser injetados na dura para verificar a precisão do local e a profundidade da injeção. Esta técnica foi desenvolvida e otimizada utilizando camundongos ICR (CD-1) (30-35 g) e camundongos C57/BL6 (25-30 g). Um comprimento infusor de 0,5-0,6 mm é suficiente para injetar um rato pesando dentro da faixa de 25-35 g. No entanto, o comprimento do infusor pode precisar ser calibrado se injetar camundongos que diferem significativamente dos camundongos usados para otimizar essa técnica. Por exemplo, um mouse menor que 25 g provavelmente resultaria no uso de um infusor que tem um comprimento inferior a 0,5 mm. Ao dominar essa técnica e quando realizada em camundongos apropriados para a idade, a taxa de sucesso desta injeção pode ser próxima de 100%; no entanto, complicações com a injeção podem decorrer de problemas como quebrar o crânio devido à aplicação de muita força para inserir o infusor, bem como sangramento anormal causado por danificar vasos sanguíneos meningeais.
Alterações na sensibilidade tátil são uma medida importante na avaliação de comportamentos de dor em roedores. Aqui demonstramos o uso de testes periorbital von Frey para avaliar esses comportamentos em um modelo de enxaqueca pré-clínico. Uma grande vantagem do uso dessa técnica em modelos de enxaqueca é que podemos avaliar a hipersensibilidade da cabeça, que tem mais relevância do que outros locais não-cranianos, como patas. O passo crítico para garantir resultados reprodutíveis é garantir que os ratos estejam totalmente inclinados. Isso exigirá um experimentador bem treinado que pode aplicar filamentos von Frey com precisão. É provável que leve aproximadamente 7 dias para um animal chegar à linha de base. No entanto, é possível que nem todos os animais atinjam a linha de base alvo. Em nossa experiência, após cerca de 7 dias trabalhando com camundongos, apenas 60%-70% dos animais atingirão uma linha de base de 0,6 g na região periorbital, mas isso depende da coorte de animais. Esse tempo deve ser considerado antes do início de um experimento para garantir que números suficientes sejam usados para explicar a evasão e que os animais são a idade adequada pós-base para o uso deste método não invasivo para estimular a dura. As etapas para determinar uma linha de base estão descritas na seção de protocolo 4.
Uma limitação ao teste de von Frey é que pode ser difícil distinguir entre respostas de dor e preparação/coceira de rotina. Para ajudar a distinguir a dor do preparo, é importante notar o tempo que esse comportamento ocorre. Normalmente, uma resposta à dor é um deslize após a aplicação do filamento, enquanto comportamentos de preparação tendem a ser prolongados e podem durar vários segundos a minutos. Se o comportamento de preparação/coceira não pode ser distinguido de uma resposta hipersensível, é melhor não registrar isso como uma resposta. Além disso, a colocação inadequada do filamento (por exemplo, deslizamento de filamento) pode resultar em um preparo prolongado do animal, dificultando o teste adequado. Se isso acontecer, o experimentador deve esperar até que o preparo tenha parado e o mouse esteja calmo o suficiente para testar. Continue do mesmo filamento usado antes do início do comportamento de preparação. Se o mouse continuar por longos períodos de tempo, coloque o mouse de volta na câmara de testes por aproximadamente 5 minutos. Uma vez que os 5 minutos passaram, tente testar o mouse novamente. Se esse comportamento continuar sem determinação, os camundongos devem ser removidos do estudo. De importância, não é recomendável raspar a pele no rosto, pois não está claro se a pele do rato mantém a mesma sensibilidade após a remoção do cabelo, e o processo de depilação (depilação, cremes depilatórios) também pode influenciar a sensibilidade da pele.
Na maioria das situações, é ideal para administrar substâncias na dura não mais do que 24 h depois que o mouse atingiu a linha de base. Recomenda-se que os camundongos sejam submetidos a testes de filamento von Frey uma vez por hora. Se possível, testar a cada duas horas dá tempo suficiente para os animais se acalmarem após os testes. Além disso, os experimentos devem ser cronometrados para não interferir em seus padrões circadianos. Alterações no ritmo circadiano em camundongos podem alterar fenótipos comportamentais e, em última instância, resultar em resultados irreprodutíveis.
Os testes periorbital von Frey podem ser usados em combinação com outros ensaios comportamentais para fortalecer conclusões experimentais. A escala de careta se baseia em expressões faciais espontâneas em roedores em vez de respostas evocadas18,19. Este método tem alta precisão e confiabilidade ao avaliar e quantificar comportamentos agudos de dor e tem sido usado em muitos modelos pré-clínicos de enxaqueca12,30. Ao usar tanto caretas quanto ensaios periorbitais von Frey, o experimentador deve considerar a pontuação para careta antes da aplicação de filamentos von Frey na região periorbital do mouse. Isso garante que o comportamento grimacing seja espontâneo e não evocado pela aplicação de filamentos. A hipersensibilidade mecânica hindpaw também pode ser usada em conjunto com testes periorbitais von Frey. Ao contrário da pontuação da careta, é melhor testar a hipersensibilidade facial antes de avaliar a hipersensibilidade da pata traseira. O teste de hindpaw requer que o mouse seja colocado de volta na câmara sem o copo após o teste periorbital von Frey ser concluído.
Em conclusão, os testes periorbitais von Frey e a estimulação dura não invasiva em camundongos adicionam opções valiosas à gama atual de modelos pré-clínicos de enxaqueca. Quando realizada corretamente, esta técnica apresenta uma abordagem refinada para gerar um fenótipo parecido com dor de cabeça em roedores, pois não requer implantação cirúrgica de uma cânula. Em ratos, as cânulas são propensas a infecções bacterianas, podem ficar entupidas, podem cair e exigir que cada animal seja alojado sozinho, criando estresse desnecessário no animal. Além disso, o protocolo de estimulação dural pode ser facilmente modificado para uso com várias aplicações de medicamentos. Paradigmas de teste periorbital von Frey também podem ser modificados para melhor se adequar às especificações experimentais. Além disso, o teste periorbital von Frey pode ser usado em outros distúrbios de dor orofacial. Essas técnicas são uma ferramenta importante para ajudar a entender melhor os complexos mecanismos subjacentes da dor da enxaqueca.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NS104200 e NS072204 para ODS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 oz Hot Paper Cups | Choice Paper Company | 5004W | https://www.webstaurantstore.com/choice-4-oz-white-poly-paper-hot-cup-case/5004W.html |
| Absorbent Underpads | Fisherbrand | 14-206-65 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048 |
| C313I/SPC Internal 28 G cannula | P1 Technologies (formerly Plastics One) | 8IC313ISPCXC | I.D. 18 mm, O.D. 35 mm |
| Gastight Model 1701 SN Syringes | Hamilton | 80008 | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008 |
| Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm | Cole-Palmer | EW-96460-10 | https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010 |
| Stand with chicken wire | Custom | The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge | |
| Testing Rack with individual Chambers | Custom | Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup. | |
| von Frey Filaments | Touch test/Stoelting | 58011 | https://www.stoeltingco.com/touch-test.html |
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