Summary
斑马鱼是了解肾脏发育的重要模型。在这里， 对原位 杂交方案进行了优化，以检测斑马鱼幼虫和幼鱼在中胚层发育过程中的基因表达。
Abstract
斑马鱼在其一生中形成两个肾脏结构。前发肾（胚胎肾）在胚胎发育过程中形成，并在受精后2天开始发挥作用。前发肾上腺仅由两个肾单位组成，在幼虫存活期间充当唯一的肾脏，直到由于体重增加而需要更多的肾功能。为了应对这种更高的需求，中胚层（成人肾脏）在蜕变过程中开始形成。新的初级肾单位融合到前静脉并形成连接的管腔。然后，次级肾单位融合到初级肾单位（依此类推）以在中胚层中形成分支网络。绝大多数研究都集中在前驱虫上，因为使用胚胎很容易。因此，有必要开发技术来研究较老和较大的幼虫和幼鱼，以更好地了解中胚层的发育。在这里，用于基因表达分析 的原位 杂交方案针对探针穿透，探针和抗体的洗涤以及色素的漂白进行了优化，以更好地可视化中胚层。 Tg（lhx1a-EGFP） 转基因系用于标记新生肾单位的祖细胞和远端肾小管。该协议填补了中胚层研究的空白。它是了解新肾组织如何形成并与现有肾单位整合并提供再生疗法见解的关键模型。
Introduction
斑马鱼胚胎是研究组织发育的重要模型，因为它的尺寸小，透明度，可用的工具，并且在不进食的情况下存活长达五天1，2。它极大地促进了对肾脏发育的理解以及斑马鱼和哺乳动物之间的保护3，4，5。肾脏在维持液体稳态、过滤血液和排泄废物方面起着至关重要的作用6。肾单位是肾脏的功能单位，包括连接到长小管的血液过滤器。在斑马鱼中，两个肾脏结构在其一生中形成。前发肾（临时胚胎肾）在早期发育期间首先形成。它由两个沿前后轴运行的肾单位组成，并在受精后约2天（dpf）变得功能性。前静脉的效用在于其简单性，只有两个肾单位，它们大多是线性的，易于观察（尽管近端卷曲的小管开始以三 dpf的速度盘绕）3。这不仅促进了从中间中胚层对其早期发展的研究，还促进了分割模式和小管修复的研究7，8。
斑马鱼的用处在五分后变得有限，此时蛋黄减少，幼虫依靠水生系统中的觅食9。在大约2周龄时，幼虫蜕变为幼体，形成新组织，旧组织丢失和/或重组9。这也是中胚层（永久成人肾脏）形成10，11，12的时候。第一个成年肾单位在第六个体参体附近形成，并与前发性肾病的远端早期小管融合。额外的肾单位最初向后添加到该位置，但稍后也向前部添加。第一波中的主肾单位融合到前发管的小管中，并共享一个共同的腔来沉积它们的废物。次级肾单位在下一波中形成并融合到初级肾单位。这种重复过程会产生一个分支的中胚层，有点类似于哺乳动物的肾脏。据推测，前驱肾小管最终会失去其小管特性，并成为两个主要的收集管，所有肾单位都排出废物13。
在第一个成体肾单位形成之前，单个祖细胞开始出现在〜4毫米（总长度）幼虫（〜10 dpf）中。这些细胞在 Tg（lhx1a-EGFP） 转基因系中标记，粘附在前发细胞上，似乎迁移到未来的肾病发生部位。单个细胞合并成簇，分化成新的肾单位12。目前尚不清楚这些细胞位于何处，也不清楚它们在介子发生发生之前表达的基因。
了解中胚层发育可以以前肾无法实现的方式深入了解哺乳动物肾脏。这些包括从单个祖细胞形成肾源聚集体，新肾单位与现有肾单位的功能整合以及分支形态发生。然而，研究胚胎后发育存在局限性。幼虫由于其体型较大且具有色素沉着而不太透明。个体动物之间的发育时间表不同步，并且高度依赖于环境因素，例如进食和拥挤9，14。虽然存在敲低试剂，但与胚胎相比，它们在幼虫中的效果较差15。在该协议中，描述了一种 原位 杂交方法，以确定斑马鱼中胚层发育过程中的基因表达。优化了几个步骤，以提高中胚层的可视化以及探针和抗体的穿透和洗涤。 Tg（lhx1a-EGFP） 转基因系与EGFP探针一起使用，以标记单个祖细胞，肾源聚集体和新生肾单位的远端小管。这种方法将提供对中胚层发育的更深入理解和对再生疗法的见解。
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Protocol
斑马鱼幼体和幼鱼的使用已获得IUP IACUC的批准（协议#02-1920，#08-1920）。解决方案内容的详细信息列在 材料表中。
1. 培育幼虫
注意：将幼虫和幼体提升到感兴趣的阶段最多需要21天或更长时间。
- 在最后一顿饭后的傍晚，通过在交配池中加入1条雄性和1条雌性鱼来设置成年斑马鱼进行交配。
注意：并非所有的鱼对都会交配。首先设置20对，以确定配对速率，并在未来的实验中进行相应的调整。 - 在鱼完成交配后的第二天（下午1点左右），在培养皿中收集含有E3培养基的胚胎。
- 确保每块板不超过30个胚胎。
- 从培养皿中除去碎屑（如粪便），并加入20 mL的E3培养基。
- 在28.5°C下孵育1天。
- 将成年斑马鱼放回水生系统中。
- 在 1 dpf 时，将 E3 培养基替换为新鲜的 E3。
- 在28.5°C下孵育4天，直到5 dpf。
- 将400μm的筛网放入2.8 L水箱中，并用2厘米的系统水填充。
- 从1个板中加入5 dpf幼虫（最多30个幼虫）。
- 将水箱放入水生系统中，但不要启动水流。
- 每天两次给幼虫喂食4毫升粉末状食物，直到14分培。
- 在 6 dpf 时，以每秒 1 滴的速度启动水流。
注意：每天检查水流并进行相应调整。 - 在 8 dpf 时，将水流增加到缓慢、稳定的水流。
- 在14 dpf下，除粉状食物外，还给活盐水虾喂食。
2. 第1 - 2天：固定幼虫
- 在所需的时间点取出一罐幼虫。
- 在培养皿中加入 20 mL 系统水。
- 使用细网网轻轻舀取幼虫并将其带到水面。
- 切断移液器的尖端以提供更宽的开口，并将幼虫转移到培养皿中。较大的移液器口允许同时转移几个小幼虫或几个较大的幼虫。
- 加入2毫升三卡因（2%，pH 7储备）以固定幼虫。
- 幼虫停止移动后，除去大部分水，加入10毫升三卡因。等待15分钟，让幼虫被安乐死。
- 可选：对于长度超过8毫米的幼体，在解剖显微镜下用剃须刀片（安乐死后）切掉头部和尾部，以提高固定溶液的穿透力。在切掉头和尾巴之前，一定要记录每只动物的总长度，并将每只动物隔离在自己的培养皿中。有关如何测量动物的信息，请参阅步骤 3。
- 用20mL固定溶液（4%多聚甲醛，1%DMSO）代替三卡因。将盖子放回培养皿上，在通风橱中缓慢摇晃。
注意：使用摇摆平台非常重要。具有圆周运动的摇晃平台将导致动物轴线弯曲。仅使用新鲜（非预制冷冻）固定溶液。
注意：固定溶液含有多聚甲醛，这是一种可能的致癌物质。使用通风橱（或面罩）和手套测量粉末。 - 30分钟后，用新鲜的固定溶液代替固定溶液。
- 将用过的固定溶液收集在单独的废物容器中以进行适当处理。
- 将幼虫转移到含有25 mL新鲜固定溶液的50 mL管中。
- 确保盖子紧固，并在4°C下缓慢摇晃2天。为了方便起见，可以孵育更长时间。
3. 第3天：测量幼虫
- 在通风橱中，用 20 mL PBST 替换固定溶液。
- 将幼虫转移到培养皿中。
- 将平尺放在解剖显微镜上，将培养皿放在尺子的顶部。
- 使用睫毛操纵器将每个幼虫移动到尺子上以测量其总长度（从鼻子到尾鳍的尖端）（图1）。
- 将几个长度相似的幼虫（例如，5.0毫米和5.1毫米）混合到一个5.5毫升的玻璃小瓶中，每个小瓶最多10个幼虫。
4. 第3 - 4天：脱水
- 用4 mL 100%甲醇代替PBST。在室温下摇动小瓶5分钟。
- 用新鲜的甲醇和岩石代替甲醇5分钟。再重复一次。
- 将小瓶在-20°C下储存2天。为了方便起见，可以孵育更长时间。
5. 第5天：补液
- 将小瓶加热至室温。
- 用4毫升75%甲醇/ 25%PBST代替甲醇。在室温下摇晃5分钟。
- 将步骤5.2中的溶液替换为4 mL的50%甲醇/ 50%PBST和岩石5分钟。
- 将步骤5.3中的溶液替换为4 mL的25%甲醇/ 75%PBST和岩石5分钟。
- 将步骤5.4中的溶液替换为4 mL PBST并摇动10分钟。
- 将 PBST 与 4 mL 新鲜 PBST 和岩石取 10 分钟。再重复一次。
6. 第5天：蛋白酶K消化
- 用2mL蛋白酶K溶液（20μg/ mL，PBST中的1%DMSO终浓度）代替PBST，并在室温下摇30分钟。
注意：长度超过6毫米的幼虫需要更长的孵育时间和/或更高的蛋白酶K浓度。确切的时间和浓度需要根据经验来确定。首先将孵育时间增加10分钟，每0.5毫米长于6毫米。 - 用4 mL PBST和岩石代替蛋白酶K溶液10分钟。
- 将 PBST 与 4 mL 新鲜 PBST 和岩石取 10 分钟。再重复一次。
- 将PBST换成4 mL新鲜固定溶液和岩石1小时。为方便起见，可以在4°C下孵育更长时间。
7. 第5天：漂白
- 用4 mL PBST代替固定溶液，并在室温下摇动10分钟。
- 将 PBST 与 4 mL 新鲜 PBST 和岩石取 10 分钟。再重复一次。
- 将幼虫转移到6孔板（每孔最多10个幼虫）。
- 用 3 mL 新鲜漂白溶液代替 PBST。
- 在室温下摇动，每5分钟在解剖显微镜下监测色素沉着。寻找沿中胚层（游泳膀胱和肠道背侧）色素沉着的消失。
注意：对于长达6毫米的幼虫，漂白中胚层周围的色素沉着需要长达20分钟。漂白时间不要超过必要的时间，以保持幼虫的完整性。 - 将幼虫移回玻璃瓶中。
- 用4毫升PBST代替漂白溶液。摇滚10分钟。
- 将 PBST 与 4 mL 新鲜 PBST 和岩石取 10 分钟。再重复一次。
- 将PBST换成4 mL新鲜固定溶液和岩石1小时。为方便起见，可以在4°C下孵育更长时间。
8. 第5天：预杂交
注意：对于在70°C下完成的步骤，重要的是要快速工作以尽量减少小瓶冷却。
- 用4 mL PBST代替固定溶液，并在室温下摇动10分钟。
- 将 PBST 与 4 mL 新鲜 PBST 和岩石取 10 分钟。再重复一次。
- 用4 mL的Hyb-溶液代替PBST，并在室温下摇动10分钟。
注意：Hyb-、Hyb+和探针溶液含有甲酰胺，会刺激皮肤。使用手套来处理这些解决方案。 - 将 Hyb- 更换为 4 mL 新鲜 Hyb- 和岩石 10 分钟。再重复一次。
- 将用过的 Hyb-、Hyb+ 和探针溶液收集在单独的废物容器中，以便妥善处理。
- 将 Hyb- 更换为 4 mL 的 Hyb+ 溶液。
- 将小瓶在70°C孵育过夜。
- 将EGFP-荧光素探针以1：100稀释在500μL Hyb +中，并在70°C下孵育O / N。
注：请遵循制造商的说明进行探针合成。
9. 第6天：探针杂交
- 用预热的探针替换小瓶中的Hyb +溶液，并在70°C下孵育过夜。
注意：长度超过6毫米的幼虫需要孵育2天。 - 将洗涤缓冲液，2x SSCT和0.2x SSCT溶液在70°C下预热过夜。
10. 第7天：探头清洗
- 用4 mL预热的洗涤缓冲液替换探头，并在70°C下孵育30分钟。
- 将用过的探头收集在单独的废物容器中以进行适当处理。
- 用4mL新鲜洗涤缓冲液替换洗涤缓冲液，并在70°C下孵育30分钟。
- 用4mL预热的2x SSCT溶液代替洗涤缓冲液，并将其在70°C下孵育15分钟。
- 将 50 mL 预热的 0.2x SSCT 加入 50 mL 管中。
- 将细胞过滤器（100μm）插入管的顶部。确保将细胞过滤器一直向下推，直到停止。
- 将幼虫从玻璃小瓶转移到细胞过滤器中。确保幼虫浸没在缓冲液中并在70°C下孵育2小时。
- 准备一个装有50 mL预热0.2x SSCT的新管。
- 将细胞过滤器从步骤10.4.2转移到0.2x SSCT的新管中，并在70°C下孵育2小时。
- 再次重复步骤 10.5。
11. 第7天：封锁
- 将幼虫转移到新的玻璃小瓶中并冷却至室温。
- 将 0.2x SSCT 替换为 4 mL 67% 0.2x SSCT/33% MABT，并在室温下摇动 10 分钟。
- 将步骤11.2中的溶液替换为4 mL的33%0.2x SSCT / 67%MABT，并摇动10分钟。
- 将步骤11.3中的溶液替换为4 mL MABT和岩石10分钟。
- 用4毫升新鲜的MABT和岩石代替MABT 10分钟。再重复一次。
- 用4mL封闭溶液代替MABT，并在4°C下孵育过夜。为了方便起见，可以孵育更长时间。
12. 第8 -9天：抗体孵育
- 将抗荧光素抗体在500μL封闭溶液中以1：5，000稀释。
- 用抗体溶液代替封闭溶液，并在4°C下孵育2天。为了方便起见，可以孵育更长时间。
- 每天旋转小瓶两次以搅动幼虫。
注意：长度超过6毫米的幼虫需要再孵育1-2天。
- 每天旋转小瓶两次以搅动幼虫。
13. 第10 - 11天：抗体清洗
- 用4mL PBST替换抗体溶液，并在室温下摇动10分钟。
- 将 PBST 与 4 mL 新鲜 PBST 和岩石取 10 分钟。再重复一次。
- 将幼虫转移到50 mL管中。
- 加入 40 毫升 PBST2。将管放在其侧面并在4°C下振荡过夜。
- 用40 mL新鲜PBST2代替PBST2，并在4°C下摇寥过夜。为了方便起见，可以孵育更长时间。
注意：长度超过6毫米的幼虫需要再洗1-2天。
14. 第12天：染色
- 将幼虫转移到6孔板中。
- 用3 mL染色缓冲液代替PBST2，并在室温下岩石5分钟。
- 用3 mL新鲜染色缓冲液和岩石代替染色缓冲液5分钟。再重复一次。
- 用3 mL染色溶液代替染色缓冲液。盖上铝箔，并在接下来的几个小时内监测污渍。
- 对于信号较弱的探针，在4°C下孵育过夜，并在两者之间用新鲜的染色溶液替换染色溶液。
- 当达到所需的染色强度时，用3mL停止溶液和岩石代替染色溶液30分钟。
- 用3 mL新鲜停止溶液代替停止溶液，并摇动30分钟。再重复一次。
- 将幼虫转移到新的玻璃小瓶中，并用4mL新鲜固定溶液代替停止溶液，并在室温下孵育1小时。为方便起见，可以在4°C下孵育更长时间。
- 将幼虫在4°C的黑暗中储存在固定溶液中长达一年。
15. 第12天：成像
- 用4 mL PBST代替固定溶液，并在室温下摇动10分钟。
- 将幼虫转移到6孔板中。
- 将 PBST 与 4 mL 新鲜 PBST 和岩石取 10 分钟。再重复一次。
- 将PBST替换为3 mL 50%甘油（在PBST中）并摇10分钟。
- 用3mL的100%甘油代替步骤15.4中的溶液，不摇晃10分钟。
- 使用解剖显微镜直接在6孔板中对幼虫进行成像，或将幼虫转移到凹陷载玻片中以在复合显微镜下成像。使用睫毛操纵器定位幼虫。
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Representative Results
使用Tg（lhx1a-EGFP）转基因系，证明该原位杂交方案在中胚层发育过程中有效标记肾脏祖细胞和各种肾单位结构。正如预期的那样，中枢神经系统也被标记在这个转基因系中（未显示）。初始的中胚层肾单位在大约5.2毫米处形成，背侧到前几发（图2A），并且该肾单位的远端肾小管由EGFP10，12标记。祖细胞簇存在于这个阶段和以后（图2A-B，箭头），并且单个祖细胞也被标记（图2C）。这种方法为研究肾脏发育提供了额外的工具，并有助于阐明对人体肾脏的理解。
图1：测量幼虫。 固定在培养皿中的幼虫被放置在扁平尺子的顶部。在解剖显微镜下，测量幼虫并由类似大小的组分开。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：中胚层发育。在Tg（lhx1a-EGFP）转基因系中约5.2毫米处，第一个中胚层肾单位形成背侧到前静脉和游泳膀胱（SB）（A）。除了单个祖细胞（C，支架）外，在中胚层发育过程中还存在祖细胞簇（A-B，箭头）。在较大的幼体中，背景染色可能发生在体细胞中（C，箭头）。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
这里描述 的原位 杂交方法旨在研究中胚层发育。然而，它可以应用于研究蜕变过程中其他组织和器官的发育，例如肠道，神经系统，鳞片和色素沉着14。可以为转基因系中的内源性基因或荧光标记物生成探针。
幼虫保持完整至关重要，以便观察其原生环境中的器官和组织。为了保持组织的完整性，重要的是要尽量减少蛋白酶K治疗的时间。重要的是要确定每批新酶的最佳处理时间。或者，可以使用丙酮代替蛋白酶K来改善组织完整性16。过度漂白也会降低组织的完整性。最小的漂白和让眼睛保留一些色素沉着有助于在洗涤过程中可视化幼虫。在杂交步骤中，眼睛脱落是很常见的，这是组织脆弱性的指标。将DMSO与固定和蛋白酶K溶液一起使用对于组织渗透至关重要17。
这种方法的局限性是试剂在大型动物中的渗透性差。为了提高穿透力，可以在固定前用剃须刀片取下头部和尾部17。固定后可以用细镊子和钨针去除肠道，以允许试剂直接进入中胚层。长探针（大于1 KB）对组织的穿透性可能较差，但它们可以水解成短片段（约0.3 KB）以提高穿透力18。对于信号较弱的探头，具有检测序列的控制探头可用于区分背景和探头信号。较大的动物将具有更高的somites背景染色（图2C，箭头）。然而，这可以通过更长时间的探针和抗体洗涤来最小化。
这里的方案也可以应用于解剖和分离的组织和器官，例如成年斑马鱼肾脏12，19。虽然有关于类似方案的公开描述9，16，但没有一个描述从幼体饲养到 原位 杂交的整个过程，具有这种详细程度。因此，该方法为破译脊椎动物肾脏的发展提供了额外的工具。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
资金由宾夕法尼亚科学院，宾夕法尼亚生物学家联邦和宾夕法尼亚州印第安纳大学（研究生学习与研究学院，生物学系和辛西娅·苏沙克本科生物学卓越基金）提供。 Tg（lhx1a-EGFP） 转基因系由Neil Hukriede博士（匹兹堡大学）提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
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