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Developmental Biology

सीटू में Mesonephros विकास के दौरान Zebrafish लार्वा और किशोरों में संकरण

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62930
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

Summary

जेब्राफ़िश गुर्दे के विकास को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है। यहां, मेसोनेफ्रॉस विकास के दौरान ज़ेब्राफ़िश लार्वा और किशोरों में जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक इन सीटू संकरण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है।

Abstract

ज़ेब्राफ़िश अपने जीवनकाल में दो गुर्दे की संरचनाएं बनाता है। प्रोनफ्रॉस (भ्रूण गुर्दे) भ्रूण के विकास के दौरान बनता है और निषेचन के बाद 2 दिनों में कार्य करना शुरू कर देता है। केवल दो नेफ्रॉन से मिलकर, प्रोनफ्रॉस लार्वा जीवन के दौरान एकमात्र गुर्दे के रूप में कार्य करता है जब तक कि शरीर के बढ़ते द्रव्यमान के कारण अधिक गुर्दे के कार्य की आवश्यकता न हो। इस उच्च मांग का सामना करने के लिए, मेसोनेफ्रोस (वयस्क गुर्दे) कायापलट के दौरान बनना शुरू हो जाता है। नए प्राथमिक नेफ्रॉन प्रोनफ्रॉस के लिए फ्यूज होते हैं और जुड़े हुए लुमेन बनाते हैं। फिर, माध्यमिक नेफ्रॉन मेसोनेफ्रोस में एक ब्रांचिंग नेटवर्क बनाने के लिए प्राथमिक लोगों (और इसी तरह) को फ्यूज करते हैं। अनुसंधान का विशाल बहुमत भ्रूण का उपयोग करने में आसानी के कारण प्रोनफ्रॉस पर केंद्रित है। इस प्रकार, मेसोनेफ्रॉस विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए पुराने और बड़े लार्वा और किशोर मछली का अध्ययन करने के लिए तकनीकों को विकसित करने की आवश्यकता है। यहां, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक इन सीटू संकरण प्रोटोकॉल को जांच प्रवेश, जांच और एंटीबॉडी की धुलाई, और मेसोनेफ्रॉस की बेहतर कल्पना करने के लिए पिगमेंट के विरंजन के लिए अनुकूलित किया गया है। Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग पूर्वज कोशिकाओं और नवजात नेफ्रॉन के डिस्टल नलिकाओं को लेबल करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल मेसोनेफ्रोस अनुसंधान में एक अंतर को भरता है। यह समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है कि नए गुर्दे के ऊतक कैसे बनते हैं और मौजूदा नेफ्रॉन के साथ एकीकृत होते हैं और पुनर्योजी उपचारों में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

Introduction

ज़ेब्राफ़िश भ्रूण अपने छोटे आकार, पारदर्शिता, उपलब्ध उपकरणों और पांच दिनों तक खिलाए बिना जीवित रहने के कारण ऊतक विकास का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है1,2। इसने गुर्दे के विकास की समझ और ज़ेब्राफ़िश और स्तनधारियों के बीच संरक्षण में बहुत योगदान दिया है3,4,5। गुर्दे द्रव होमोस्टैसिस को बनाए रखने, रक्त को फ़िल्टर करने और अपशिष्ट को उत्सर्जित करने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है6। नेफ्रॉन, गुर्दे की कार्यात्मक इकाई, एक लंबी नलिका से जुड़ा एक रक्त फिल्टर शामिल है। ज़ेब्राफ़िश में, दो गुर्दे की संरचनाएं अपने पूरे जीवन में बनती हैं। प्रोनफ्रॉस (अस्थायी भ्रूण गुर्दे) प्रारंभिक विकास के दौरान पहले बनता है। इसमें पूर्वकाल-पश्च अक्ष के साथ चलने वाले दो नेफ्रॉन होते हैं और निषेचन (डीपीएफ) के बाद लगभग 2 दिनों में कार्यात्मक हो जाता है। प्रोनफ्रॉस की उपयोगिता इसकी सादगी में निहित है, जिसमें केवल दो नेफ्रॉन होते हैं जो ज्यादातर रैखिक होते हैं और कल्पना करने में आसान होते हैं (हालांकि समीपस्थ जटिल नलिका तीन डीपीएफ पर कुंडल करना शुरू कर देती है)3। इसने न केवल मध्यवर्ती मेसोडर्म से इसके शुरुआती विकास के अध्ययन की सुविधा प्रदान की है, बल्कि विभाजन पैटर्न और नलिका की मरम्मत 7,8 भी की सुविधा प्रदान की है।

ज़ेब्राफ़िश की उपयोगिता पांच डीपीएफ के बाद सीमित हो जाती है, जब जर्दी कम हो जाती है और लार्वा जलीय प्रणाली में खिलाने पर भरोसा करते हैं। लगभग 2 सप्ताह की उम्र में, लार्वा किशोरों में कायापलट से गुजरते हैं, जहां नए ऊतक बनते हैं और पुराने ऊतक खो जाते हैं और / या पुनर्गठित होते हैं। यह तब भी होता है जब मेसोनेफ्रॉस (स्थायी वयस्क गुर्दे) 10,11,12 बनाता है। पहला वयस्क नेफ्रॉन छठे सोमाइट के पास बनता है, और प्रोनफ्रॉस के डिस्टल शुरुआती नलिका के साथ फ़्यूज़ करता है। अतिरिक्त नेफ्रॉन को शुरू में इस स्थिति के पीछे जोड़ा जाता है, लेकिन बाद में पूर्वकाल की ओर भी। इस पहली लहर में प्राथमिक नेफ्रॉन प्रोनफ्रोस की नलिकाओं को फ्यूज करते हैं और अपने अपशिष्ट को जमा करने के लिए एक आम लुमेन साझा करते हैं। माध्यमिक नेफ्रॉन अगली लहर में बनते हैं और प्राथमिक नेफ्रॉन के लिए फ्यूज होते हैं। यह पुनरावृत्ति प्रक्रिया एक मेसोनेफ्रोस बनाती है जो शाखित होती है, कुछ हद तक स्तनधारी गुर्दे के समान होती है। संभवतः, प्रोनफ्रॉस अंततः अपनी नलिका पहचान खो देता है और दो प्रमुख संग्रह नलिकाएं बन जाता है जहां सभी नेफ्रॉन अपने अपशिष्ट को निकालते हैं।

पहले वयस्क नेफ्रॉन के गठन से पहले, एकल पूर्वज कोशिकाएं ~ 4 मिमी (कुल लंबाई) लार्वा (~ 10 डीपीएफ) में दिखाई देने लगती हैं। ये कोशिकाएं, जिन्हें Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन में चिह्नित किया गया है, प्रोनफ्रॉस का पालन करती हैं और नेफ्रोजेनेसिस की भविष्य की साइटों पर माइग्रेट करने लगती हैं। एकल कोशिकाएं समूहों में मिलती हैं, जो नए नेफ्रॉन 12 में अंतर करती हैं। यह स्पष्ट नहीं है कि ये कोशिकाएं कहां रहती हैं या मेसोनेफ्रोजेनेसिस की शुरुआत से पहले वे कौन से जीन व्यक्त करते हैं।

मेसोनेफ्रॉस के विकास को समझना स्तनधारी गुर्दे में उन तरीकों से अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो प्रोनफ्रॉस नहीं कर सकते हैं। इनमें एकल पूर्वज कोशिकाओं से नेफ्रोजेनिक समुच्चय का गठन, मौजूदा लोगों के साथ नए नेफ्रॉन का कार्यात्मक एकीकरण, और मॉर्फोजेनेसिस की शाखाओं में शामिल हैं। हालांकि, पोस्टमब्रायोनिक विकास का अध्ययन करने की सीमाएं हैं। लार्वा अपने बड़े आकार और रंजकता होने के कारण कम पारदर्शी होते हैं। विकास की समयरेखा व्यक्तिगत जानवरों के बीच तुल्यकालिक नहीं है और पर्यावरणीय कारकों पर अत्यधिक निर्भर है, जैसे कि खिलाना और भीड़ 9,14। हालांकि नॉकडाउन अभिकर्मक मौजूद हैं, वे भ्रूण 15 की तुलना में लार्वा में कम प्रभावी हैं। इस प्रोटोकॉल में, ज़ेब्राफ़िश मेसोनेफ्रॉस विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए एक इन सीटू संकरण विधि का वर्णन किया गया है। कई चरणों mesonephros और प्रवेश और जांच और एंटीबॉडी की धुलाई के दृश्य को बढ़ाने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग ईजीएफपी के लिए एकल पूर्वज कोशिकाओं, नेफ्रोजेनिक समुच्चय और नवजात नेफ्रॉन के डिस्टल नलिकाओं को लेबल करने के लिए ईजीएफपी के लिए एक जांच के साथ किया जाता है। यह विधि मेसोनेफ्रॉस के विकास की गहरी समझ और पुनर्योजी उपचारों में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी।

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Protocol

ज़ेब्राफ़िश लार्वा और किशोरों के उपयोग को IUP IACUC (प्रोटोकॉल # 02-1920, # 08-1920) द्वारा अनुमोदित किया गया है। समाधान सामग्री का विवरण सामग्री तालिका में सूचीबद्ध है।

1. लार्वा बढ़ाने

नोट: लार्वा और किशोरों को ब्याज के चरण तक बढ़ाने में 21 दिन या उससे अधिक समय लगेगा।

  1. अपने अंतिम भोजन के बाद देर से दोपहर में एक संभोग टैंक में 1 नर और 1 मादा मछली जोड़कर संभोग करने के लिए वयस्क ज़ेब्राफ़िश स्थापित करें।
    नोट: सभी मछली जोड़े संभोग नहीं करेंगे। संभोग दर निर्धारित करने के लिए 20 जोड़े स्थापित करके शुरू करें और भविष्य के प्रयोगों में तदनुसार समायोजित करें।
  2. मछली संभोग समाप्त करने के अगले दिन (लगभग 1 बजे) के बाद, पेट्री प्लेटों में ई 3 माध्यम के साथ भ्रूण एकत्र करें।
    1. सुनिश्चित करें कि प्रति प्लेट 30 से अधिक भ्रूण नहीं हैं।
    2. पेट्री प्लेटों से मलबे (जैसे मल) को हटा दें और E3 माध्यम के 20 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 1 दिन के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. वयस्क ज़ेबराफ़िश को जलीय प्रणाली में वापस रखो।
  4. 1 डीपीएफ पर, ई 3 माध्यम को ताजा ई 3 के साथ बदलें।
    1. 5 डीपीएफ तक 4 और दिनों के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. एक 2.8 एल टैंक में एक 400 μm स्क्रीन रखो और इसे सिस्टम पानी के 2 सेमी के साथ भरें।
    1. 1 प्लेट (30 कुल लार्वा तक) से 5 डीपीएफ लार्वा जोड़ें।
    2. टैंक को जलीय प्रणाली में रखें, लेकिन पानी का प्रवाह शुरू न करें।
  6. लार्वा को 14 डीपीएफ तक दिन में दो बार 4 मिलीलीटर पाउडर भोजन खिलाएं।
  7. 6 डीपीएफ पर, प्रति सेकंड 1 ड्रिप पर पानी का प्रवाह शुरू करें।
    नोट: दैनिक जल प्रवाह की जाँच करें और तदनुसार समायोजित करें।
  8. 8 डीपीएफ पर, पानी के प्रवाह को धीमी, स्थिर धारा में बढ़ाएं।
  9. 14 डीपीएफ पर, पाउडर भोजन के अलावा जीवित ब्राइन झींगा खिलाएं।

2. दिन 1 - 2: फिक्सिंग लार्वा

  1. वांछित समय बिंदु पर लार्वा के एक टैंक को हटा दें।
  2. सिस्टम पानी के 20 मिलीलीटर के साथ एक पेट्री प्लेट भरें।
  3. लार्वा को धीरे से स्कूप करने और उन्हें पानी की सतह पर लाने के लिए एक ठीक जाल जाल का उपयोग करें।
    1. एक व्यापक उद्घाटन देने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट की नोक को काट दें और लार्वा को पेट्री प्लेट में स्थानांतरित करें। बड़ा पिपेट मुंह कई छोटे लार्वा या एक ही बार में कुछ बड़े लोगों के हस्तांतरण के लिए अनुमति देता है।
  4. लार्वा को स्थिर करने के लिए ट्राइकेन (2%, पीएच 7 स्टॉक) के 2 एमएल जोड़ें।
    1. लार्वा के हिलना बंद करने के बाद, अधिकांश पानी को हटा दें और 10 मिलीलीटर ट्राइकेन जोड़ें। लार्वा euthanized होने के लिए 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. वैकल्पिक: 8 मिमी से अधिक समय तक किशोरों के लिए, फिक्सिंग समाधान के प्रवेश में सुधार करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक रेजर ब्लेड (इच्छामृत्यु के बाद) के साथ सिर और पूंछ को काट दें। सिर और पूंछ को काटने से पहले प्रत्येक जानवर की कुल लंबाई को रिकॉर्ड करना सुनिश्चित करें और प्रत्येक को अपनी पेट्री प्लेट में अलग करें। जानवरों को मापने के तरीके के लिए चरण 3 देखें।
  5. फिक्सिंग समाधान के 20 मिलीलीटर (4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड, 1% डीएमएसओ) के साथ ट्राइकेन को बदलें। पेट्री प्लेट पर ढक्कन वापस रखो और एक धुएं हुड में धीरे-धीरे रॉक करें।
    नोट: एक रॉकिंग प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। एक परिपत्र गति के साथ एक मिलाते हुए मंच पशु अक्ष को घुमावदार होने का कारण बनेगा। केवल ताजा (नहीं पूर्वनिर्मित जमे हुए) फिक्सिंग समाधान का उपयोग करें।
    सावधानी: फिक्सिंग समाधान में पैराफॉर्मेल्डिहाइड होता है, जो एक संभावित कार्सिनोजेन है। पाउडर को मापने के लिए धुएं के हुड (या मुखौटा) और दस्ताने का उपयोग करें।
  6. 30 मिनट के बाद, एक ताजा फिक्सिंग समाधान के साथ फिक्सिंग समाधान को बदलें।
    1. उचित निपटान के लिए एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में इस्तेमाल किया फिक्सिंग समाधान ले लीजिए।
    2. लार्वा को एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 25 मिलीलीटर ताजा फिक्सिंग समाधान होता है।
    3. सुनिश्चित करें कि टोपी तंग है और 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे-धीरे रॉक करें। सुविधा के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेट करना संभव है।

3. दिन 3: लार्वा को मापने

  1. एक धुएं हुड में, PBST के 20 मिलीलीटर के साथ फिक्सिंग समाधान की जगह।
  2. लार्वा को पेट्री प्लेट में स्थानांतरित करें।
  3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर एक फ्लैट शासक रखो और शासक के शीर्ष पर पेट्री प्लेट रखो।
  4. प्रत्येक लार्वा को शासक पर ले जाने के लिए एक बरौनी मैनिपुलेटर का उपयोग करें ताकि इसकी कुल लंबाई को मापा जा सके (थूथन से पुच्छल पंख की नोक तक) (चित्रा 1)।
  5. समान लंबाई के कई लार्वा (जैसे, 5.0 मिमी और 5.1 मिमी) को एक 5.5 मिलीलीटर ग्लास शीशी में मिलाएं, प्रति शीशी 10 लार्वा तक।

4. दिन 3 - 4: निर्जलीकरण

  1. PBST को 100% मेथनॉल के 4 mL के साथ बदलें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए शीशी रॉक।
  2. मेथनॉल को ताजा मेथनॉल और 5 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें। एक बार और दोहराएं।
  3. शीशी को 2 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सुविधा के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेट करना संभव है।

5. दिन 5: पुनर्जलीकरण

  1. शीशी को कमरे के तापमान पर गर्म करें।
  2. मेथनॉल को 75% मेथनॉल / 25% पीबीएसटी के 4 एमएल के साथ बदलें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए रॉक।
  3. चरण 5.2 में समाधान को 50% मेथनॉल / 50% PBST के 4 mL और 5 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें।
  4. चरण 5.3 में समाधान को 25% मेथनॉल / 75% PBST के 4 mL और 5 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें।
  5. चरण 5.4 में समाधान को 4 mL PBST और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें।
  6. PBST को 4 मिलीलीटर ताजा PBST और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें। एक बार और दोहराएं।

6. दिन 5: Proteinase कश्मीर पचाने

  1. PBST को प्रोटीनेज K समाधान के 2 mL (20 μg / mL, PBST में 1% DMSO अंतिम एकाग्रता) और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रॉक के साथ बदलें।
    नोट: 6 मिमी से अधिक लंबे लार्वा को लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय और / या एक उच्च प्रोटीनेज के एकाग्रता की आवश्यकता होगी। सटीक समय और एकाग्रता को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता होगी। 6 मिमी से अधिक समय तक हर 0.5 मिमी के लिए इनक्यूबेशन समय में 10 मिनट की वृद्धि के साथ शुरू करें।
  2. प्रोटीनेज के समाधान को 4 मिलीलीटर पीबीएसटी और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें।
  3. PBST को 4 मिलीलीटर ताजा PBST और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें। एक बार और दोहराएं।
  4. PBST को 4 मिलीलीटर ताजा फिक्सिंग समाधान और 1 घंटे के लिए रॉक के साथ बदलें। सुविधा के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक इनक्यूबेट करना संभव है।

7. दिन 5: ब्लीचिंग

  1. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर PBST और रॉक के 4 मिलीलीटर के साथ फिक्सिंग समाधान को बदलें।
  2. PBST को 4 मिलीलीटर ताजा PBST और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें। एक बार और दोहराएं।
  3. लार्वा को 6-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें (प्रति अच्छी तरह से 10 लार्वा तक)।
  4. ताजा ब्लीचिंग समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ PBST को बदलें।
  5. कमरे के तापमान पर रॉक और हर 5 मिनट में एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत रंजकता की निगरानी करें। मेसोनेफ्रोस के साथ रंजकता के गायब होने की तलाश करें (तैरने वाले मूत्राशय और आंत के लिए पृष्ठीय)।
    नोट: 6 मिमी तक लंबे लार्वा के लिए, मेसोनेफ्रॉस के आसपास के रंजकता को ब्लीच करने में 20 मिनट तक का समय लगेगा। लार्वा की अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यकता से अधिक समय तक ब्लीच न करें।
  6. लार्वा को कांच की शीशी में वापस स्थानांतरित करें।
  7. पीबीएसटी के 4 एमएल के साथ ब्लीचिंग समाधान को बदलें। 10 मिनट के लिए रॉक।
  8. PBST को 4 मिलीलीटर ताजा PBST और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें। एक बार और दोहराएं।
  9. PBST को 4 मिलीलीटर ताजा फिक्सिंग समाधान और 1 घंटे के लिए रॉक के साथ बदलें। सुविधा के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक इनक्यूबेट करना संभव है।

8. दिन 5: Prehybridization

नोट: 70 डिग्री सेल्सियस पर किए गए चरणों के लिए, शीशी को ठंडा करने को कम करने के लिए जल्दी से काम करना महत्वपूर्ण है।

  1. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर PBST और रॉक के 4 मिलीलीटर के साथ फिक्सिंग समाधान को बदलें।
  2. PBST को 4 मिलीलीटर ताजा PBST और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें। एक बार और दोहराएं।
  3. PBST को Hyb-solution के 4 mL के साथ बदलें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रॉक करें।
    सावधानी: Hyb-, Hyb+, और जांच समाधानों में फॉर्मामाइड होता है, जो त्वचा को परेशान कर सकता है। इन समाधानों को संभालने के लिए दस्ताने का उपयोग करें।
  4. Hyb को 4 मिलीलीटर ताजा Hyb के साथ बदलें- और 10 मिनट के लिए रॉक। एक बार और दोहराएं।
    1. उचित निपटान के लिए एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में इस्तेमाल किया Hyb-, Hyb +, और जांच समाधान ले लीजिए।
  5. Hyb को Hyb+ समाधान के 4 mL के साथ बदलें।
  6. रात भर में 70 डिग्री सेल्सियस पर शीशी को इनक्यूबेट करें।
  7. Hyb + के 500 μL में EGFP-fluorescein जांच 1: 100 पतला करें और इसे 70 डिग्री सेल्सियस पर O / N इनक्यूबेट करें।
    नोट: जांच संश्लेषण के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

9. दिन 6: जांच संकरण

  1. पहले से गर्म जांच के साथ शीशी में Hyb + समाधान को बदलें और रात भर 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: 6 मिमी से अधिक लंबे लार्वा को 2 दिनों के इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है।
  2. धोने बफर, 2x SSCT, और 0.2x SSCT समाधान ों को रात भर के लिए 70 °C पर प्रीहीट करें।

10. दिन 7: जांच धोने

  1. पहले से गर्म धोने के बफर के 4 मिलीलीटर के साथ जांच को बदलें और 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. उचित निपटान के लिए एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में उपयोग की गई जांच एकत्र करें।
  2. ताजा धोने बफर के 4 मिलीलीटर के साथ धोने बफर को बदलें और 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. पहले से गर्म 2x SSCT समाधान के 4 मिलीलीटर के साथ धोने बफर को बदलें और इसे 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. एक 50 mL ट्यूब में preheated 0.2x SSCT के 50 mL जोड़ें।
    1. ट्यूब के शीर्ष में एक सेल छलनी (100 μm) डालें। सुनिश्चित करें कि सेल छलनी को सभी तरह से नीचे धकेल दिया जाता है जब तक कि यह बंद न हो जाए।
    2. कांच की शीशी से लार्वा को सेल छलनी में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि लार्वा बफर में डूबे हुए हैं और 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं।
  5. एक नई ट्यूब तैयार करें जिसमें 50 मिलीलीटर प्रीहीटेड 0.2x एसएससीटी शामिल है।
    1. चरण 10.4.2 से सेल छलनी को 0.2x एसएससीटी की नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. चरण 10.5 को एक और बार दोहराएँ।

11. दिन 7: अवरुद्ध

  1. लार्वा को एक नई कांच की शीशी में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
  2. 0.2x SSCT को 67% 0.2x SSCT/33% MABT के 4 mL के साथ बदलें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रॉक करें।
  3. चरण 11.2 में समाधान को 33% 0.2x SSCT/67% MABT के 4 mL के साथ बदलें और 10 मिनट के लिए रॉक करें।
  4. चरण 11.3 में समाधान को MABT के 4 mL और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें।
  5. MABT को 10 मिनट के लिए ताजा MABT और रॉक के 4 mL के साथ बदलें। एक बार और दोहराएं।
  6. ब्लॉकिंग समाधान के 4 मिलीलीटर के साथ एमएबीटी को बदलें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सुविधा के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेट करना संभव है।

12. दिन 8 - 9: एंटीबॉडी इनक्यूबेशन

  1. 500 μL अवरुद्ध समाधान में एंटी-फ्लोरोसीन एंटीबॉडी 1: 5,000 को पतला करें।
  2. एंटीबॉडी समाधान के साथ अवरुद्ध समाधान को बदलें और 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सुविधा के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेट करना संभव है।
    1. लार्वा को उत्तेजित करने के लिए दिन में दो बार शीशी घुमाएं।
      नोट: 6 मिमी से अधिक लंबे लार्वा को इनक्यूबेशन के 1-2 और दिनों की आवश्यकता होती है।

13. दिन 10 - 11: एंटीबॉडी धोने

  1. एंटीबॉडी समाधान को 4 मिलीलीटर पीबीएसटी के साथ बदलें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रॉक करें।
  2. PBST को 4 मिलीलीटर ताजा PBST और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें। एक बार और दोहराएं।
  3. लार्वा को 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. PBST2 के 40 mL जोड़ें। ट्यूब को अपनी तरफ रखें और रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉक करें।
  5. ताजा PBST2 के 40 mL के साथ PBST2 को बदलें और रात भर में 4 °C पर रॉक करें। सुविधा के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेट करना संभव है।
    नोट: 6 मिमी से अधिक लंबे लार्वा को धोने के 1-2 और दिनों की आवश्यकता होती है।

14. दिन 12: धुंधला

  1. लार्वा को 6-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।
  2. PBST2 को 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बफर और रॉक को धुंधला करने के 3 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  3. 5 मिनट के लिए ताजा धुंधला बफर और रॉक के 3 मिलीलीटर के साथ धुंधला बफर को बदलें। एक बार और दोहराएं।
  4. धुंधला समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ धुंधला बफर को बदलें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर और अगले कुछ घंटों में धुंधला की निगरानी.
    1. एक कमजोर संकेत के साथ जांच के लिए, रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और बीच में एक बार ताजा धुंधला समाधान के साथ धुंधला समाधान को प्रतिस्थापित करें।
  5. जब वांछित धुंधला तीव्रता तक पहुंच जाता है, तो 30 मिनट के लिए रोकने वाले समाधान और चट्टान के 3 मिलीलीटर के साथ धुंधला समाधान को बदलें।
  6. 30 मिनट के लिए ताजा रोकने वाले समाधान और रॉक के 3 मिलीलीटर के साथ रोकने वाले समाधान को बदलें। एक बार और दोहराएं।
  7. लार्वा को एक नई कांच की शीशी में स्थानांतरित करें और 4 मिलीलीटर ताजा फिक्सिंग समाधान के साथ रोकने वाले समाधान को प्रतिस्थापित करें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। सुविधा के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक इनक्यूबेट करना संभव है।
  8. एक वर्ष तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में फिक्सिंग समाधान में लार्वा स्टोर करें।

15. दिन 12: इमेजिंग

  1. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर PBST और रॉक के 4 मिलीलीटर के साथ फिक्सिंग समाधान को बदलें।
  2. लार्वा को 6-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।
  3. PBST को 4 मिलीलीटर ताजा PBST और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें। एक बार और दोहराएं।
  4. PBST को 50% ग्लिसरॉल (PBST में) के 3 mL और 10 मिनट के लिए रॉक के साथ बदलें।
  5. चरण 15.4 में समाधान को 10 मिनट के लिए कोई रॉकिंग के साथ 100% ग्लिसरॉल के 3 एमएल के साथ बदलें।
  6. लार्वा को सीधे 6-अच्छी तरह से प्लेट में छवि बनाने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें या लार्वा को एक यौगिक माइक्रोस्कोप के तहत छवि में अवसाद स्लाइड में स्थानांतरित करें। लार्वा को उन्मुख करने के लिए एक बरौनी मैनिपुलेटर का उपयोग करें।

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Representative Results

Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करते हुए, यह प्रदर्शित किया गया था कि यह इन सीटू संकरण प्रोटोकॉल मेसोनेफ्रोस विकास के दौरान गुर्दे के पूर्वज कोशिकाओं और विभिन्न नेफ्रॉन संरचनाओं को लेबल करने में प्रभावी है। जैसा कि अपेक्षित था, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को भी इस ट्रांसजेनिक लाइन में लेबल किया गया है (नहीं दिखाया गया है)। प्रारंभिक मेसोनेफ्रिक नेफ्रॉन लगभग 5.2 मिमी पर बनता है, प्रोनफ्रॉस (चित्रा 2 ए) के लिए पृष्ठीय होता है, और इस नेफ्रॉन के डिस्टल ट्यूबल को ईजीएफपी 10,12 द्वारा लेबल किया जाता है। पूर्वज क्लस्टर इस चरण में और बाद में मौजूद होते हैं (चित्रा 2 ए-बी, एरोहेड्स), और एकल पूर्वज कोशिकाओं को भी लेबल किया जाता है (चित्रा 2 सी)। यह विधि गुर्दे के विकास का अध्ययन करने में एक अतिरिक्त उपकरण प्रदान करती है और मानव गुर्दे को समझने पर प्रकाश डालने में मदद करती है।

Figure 1
चित्रा 1: लार्वा को मापना। पेट्री प्लेट में निश्चित लार्वा को एक फ्लैट शासक के शीर्ष पर रखा जाता है। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, लार्वा को मापा जाता है और समान आकार के समूहों द्वारा अलग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मेसोनेफ्रॉस विकास। Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन में लगभग 5.2 मिमी पर, पहला मेसोनेफ्रिक नेफ्रॉन प्रोनफ्रॉस और तैरने वाले मूत्राशय (एसबी) (ए) के लिए पृष्ठीय बनता है। पूर्वज कोशिकाओं के समूह एकल पूर्वज कोशिकाओं (सी, ब्रैकेट) के अलावा मेसोनेफ्रॉस विकास (ए-बी, एरोहेड्स) के दौरान मौजूद होते हैं। बड़े किशोरों में, पृष्ठभूमि धुंधला somites (सी, तीर) में हो सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां वर्णित इन सीटू संकरण विधि का उद्देश्य मेसोनेफ्रॉस विकास का अध्ययन करना है। हालांकि, इसे कायापलट के दौरान अन्य ऊतकों और अंगों के विकास का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि आंत, तंत्रिका तंत्र, तराजू और रंजकता 14। ट्रांसजेनिक लाइनों में अंतर्जात जीन या फ्लोरोसेंट मार्करों के लिए जांच उत्पन्न की जा सकती है।

लार्वा के लिए अपने मूल संदर्भ में अंगों और ऊतकों का निरीक्षण करने के लिए बरकरार रहना महत्वपूर्ण है। ऊतक अखंडता को बनाए रखने के लिए, प्रोटीनेज के उपचार के समय को कम करना महत्वपूर्ण है। एंजाइम के प्रत्येक नए बैच के लिए सर्वोत्तम उपचार समय निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, एसीटोन का उपयोग प्रोटीनेज के बजाय बेहतर ऊतक अखंडता 16 के लिए किया जा सकता है। अत्यधिक ब्लीचिंग भी ऊतक अखंडता को कम करता है। न्यूनतम ब्लीचिंग और आंखों को कुछ रंजकता को बनाए रखने की अनुमति देने से धोने के दौरान लार्वा की कल्पना करने में मदद मिलती है। संकरण चरण के दौरान आंखों के गिरने के लिए यह आम है, जो ऊतक नाजुकता का संकेतक है। फिक्सिंग और proteinase कश्मीर समाधान के साथ DMSO का उपयोग ऊतक प्रवेश 17 के लिए महत्वपूर्ण है।

इस विधि की एक सीमा बड़े जानवरों में अभिकर्मकों की खराब पैठ है। पैठ में सुधार करने के लिए, सिर और पूंछ को फिक्सेशन 17 से पहले रेजर ब्लेड के साथ हटाया जा सकता है। आंत को ठीक चिमटी और टंगस्टन सुइयों के साथ फिक्सेशन के बाद हटाया जा सकता है ताकि मेसोनेफ्रोस के लिए अभिकर्मकों की सीधी पहुंच की अनुमति मिल सके। लंबी जांच (1 केबी से अधिक) में ऊतक की खराब पैठ हो सकती है, लेकिन उन्हें पैठ में सुधार करने के लिए छोटे टुकड़ों (लगभग 0.3 केबी) में हाइड्रोलाइज्ड किया जा सकता है। कमजोर संकेतों के साथ जांच के लिए, भावना अनुक्रम के साथ नियंत्रण जांच का उपयोग पृष्ठभूमि और जांच संकेत के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है। बड़े जानवरों में सोमाइट्स (चित्रा 2 सी, तीर) की एक उच्च पृष्ठभूमि धुंधला होगा। हालांकि, इसे जांच और एंटीबॉडी के लंबे समय तक धोने के साथ कम से कम किया जा सकता है।

यहां प्रोटोकॉल को विच्छेदित और अलग-थलग ऊतकों और अंगों पर भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि वयस्क ज़ेबराफ़िश किडनी 12,19। यद्यपि समान प्रोटोकॉल 9,16 के प्रकाशित विवरण हैं, उनमें से कोई भी विस्तार के इस स्तर के साथ लार्वा के पालन से सीटू संकरण तक की पूरी प्रक्रिया का वर्णन नहीं करता है। इसलिए, यह विधि कशेरुकी गुर्दे के विकास को समझने में एक अतिरिक्त उपकरण प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

पेंसिल्वेनिया एकेडमी ऑफ साइंस, और पेंसिल्वेनिया जीवविज्ञानियों के राष्ट्रमंडल, और पेंसिल्वेनिया जीवविज्ञानियों के राष्ट्रमंडल, और पेंसिल्वेनिया के इंडियाना विश्वविद्यालय (स्कूल ऑफ ग्रेजुएट स्टडीज एंड रिसर्च, जीव विज्ञान विभाग, और उत्कृष्टता के लिए सिंथिया सुशाक अंडरग्रेजुएट बायोलॉजी फंड) द्वारा वित्त पोषण प्रदान किया गया था। Tg (lhx1a-EGFP) ट्रांसजेनिक लाइन डॉ नील हकरीडे (पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-fluorescein antibody Roche/Sigma-Aldrich 11426338910
Bleaching solution 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent Roche/Sigma-Aldrich 11096176001 Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer Fisher Scientific  22-363-549 100 μm
E3 medium 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator Fisher Scientific NC1083208 Use to manipulate larvae
Fixing solution 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis Roche/Sigma-Aldrich 11685619910
Glass vial Fisher Scientific 03-338B
Hatchfry encapsulation Argent
Hyb- solution 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X) 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT 1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid Sigma-Aldrich M0375
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
PBS (10X) 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST 1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2 1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K Sigma-Aldrich P5568 Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution 20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder Argent
SSC (20X) 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA Sigma-Aldrich R6625
Tricaine Sigma Aldrich E10521 2%, pH 7
Wash buffer 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 174 zebrafish गुर्दे pronephros mesonephros lhx1a लार्वा किशोर
<em>सीटू में</em> Mesonephros विकास के दौरान Zebrafish लार्वा और किशोरों में संकरण
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Kasar, S. N., Grandinette, S. A., Semelsberger, S. D., Diep, C. Q. In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development. J. Vis. Exp. (174), e62930, doi:10.3791/62930 (2021).

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