Summary
Il pesce zebra è un modello importante per comprendere lo sviluppo del rene. Qui, un protocollo di ibridazione in situ è ottimizzato per rilevare l'espressione genica nelle larve di zebrafish e nei giovani durante lo sviluppo del mesonephros.
Abstract
Il pesce zebra forma due strutture renali nel corso della sua vita. Il pronephros (rene embrionale) si forma durante lo sviluppo embrionale e inizia a funzionare a 2 giorni dopo la fecondazione. Costituito da soli due nefroni, il pronephros funge da unico rene durante la vita larvale fino a quando non è richiesta una maggiore funzionalità renale a causa dell'aumento della massa corporea. Per far fronte a questa maggiore domanda, il mesonephros (rene adulto) inizia a formarsi durante la metamorfosi. I nuovi nefroni primari si fondono con il pronephros e formano lumen collegati. Quindi, i nefroni secondari si fondono con quelli primari (e così via) per creare una rete ramificata nel mesonefro. La stragrande maggioranza della ricerca si concentra sul pronephros a causa della facilità di utilizzo degli embrioni. Pertanto, è necessario sviluppare tecniche per studiare larve più vecchie e più grandi e pesci giovani per comprendere meglio lo sviluppo del mesonephros. Qui, un protocollo di ibridazione in situ per l'analisi dell'espressione genica è ottimizzato per la penetrazione della sonda, il lavaggio di sonde e anticorpi e lo sbiancamento dei pigmenti per visualizzare meglio il mesonefro. La linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP) viene utilizzata per etichettare le cellule progenitrici e i tubuli distali dei nefroni nascenti. Questo protocollo colma una lacuna nella ricerca sul mesonefro. È un modello cruciale per capire come i nuovi tessuti renali si formano e si integrano con i nefroni esistenti e fornire approfondimenti sulle terapie rigenerative.
Introduction
L'embrione di zebrafish è un modello importante per lo studio dello sviluppo dei tessuti grazie alle sue piccole dimensioni, alla trasparenza, agli strumenti disponibili e alla sopravvivenza senza nutrirsi fino a cinque giorni1,2. Ha notevolmente contribuito alla comprensione dello sviluppo renale e alla conservazione tra zebrafish e mammiferi3,4,5. Il rene svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi fluida, nel filtraggio del sangue e nell'escrezione dei rifiuti6. Il nefrone, l'unità funzionale del rene, comprende un filtro del sangue collegato a un lungo tubulo. Nel pesce zebra, due strutture renali si formano per tutta la sua vita. Il pronephros (il rene embrionale temporaneo) si forma prima durante lo sviluppo precoce. È costituito da due nefroni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore e diventa funzionale a circa 2 giorni dopo la fecondazione (dpf). L'utilità del pronephros sta nella sua semplicità, avendo solo due nefroni che sono per lo più lineari e facili da visualizzare (anche se il tubulo contorto prossimale inizia a ruotare a tre dpf)3. Ciò ha facilitato non solo gli studi sul suo sviluppo precoce dal mesoderma intermedio, ma anche il modello di segmentazione e la riparazione dei tubuli7,8.
L'utilità del pesce zebra diventa limitata dopo cinque dpf, quando il tuorlo è diminuito e le larve si affidano all'alimentazione nel sistema acquatico9. A circa 2 settimane di età, le larve subiscono metamorfosi in giovani, dove si formano nuovi tessuti e i vecchi tessuti vengono persi e/ o riorganizzati9. Questo è anche quando il mesonephros (il rene adulto permanente) forma10,11,12. Il primo nefrone adulto si forma vicino al sesto somite e si fonde con il tubulo distale precoce del pronephros. Ulteriori nefroni vengono aggiunti posteriormente a questa posizione inizialmente, ma anche verso l'anteriore in seguito. I nefroni primari in questa prima ondata si fondono con i tubuli del pronephros e condividono un lume comune per depositare i loro rifiuti. I nefroni secondari si formano nell'onda successiva e si fondono con i nefroni primari. Questo processo ripetitivo crea un mesonephros che è ramificato, in qualche modo simile al rene dei mammiferi. Presumibilmente, il pronephros alla fine perde la sua identità tubulare e diventa due importanti condotti di raccolta in cui tutti i nefroni drenano i loro rifiuti13.
Prima della formazione del primo nefrone adulto, le singole cellule progenitrici iniziano ad apparire in larve di ~ 4 mm (lunghezza totale) (~ 10 dpf). Queste cellule, che sono marcate nella linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP ), aderiscono al pronephros e sembrano migrare verso futuri siti di nefrogenesi. Le singole cellule si fondono in cluster, che si differenziano in nuovi nefroni12. Non è chiaro dove risiedano queste cellule o quali geni esprimano prima dell'inizio della mesonefrogenesi.
Comprendere lo sviluppo del mesonefro fornisce informazioni sul rene dei mammiferi in modi che il pronephros non può. Questi includono la formazione di aggregati nefrogenici da singole cellule progenitrici, l'integrazione funzionale di nuovi nefroni con quelli esistenti e la morfogenesi ramificata. Tuttavia, ci sono limitazioni allo studio dello sviluppo postembrionale. Le larve sono meno trasparenti a causa delle loro dimensioni maggiori e della pigmentazione. La linea temporale dello sviluppo non è sincrona tra i singoli animali ed è fortemente dipendente da fattori ambientali, come l'alimentazione e l'affollamento9,14. Sebbene esistano reagenti knockdown, sono meno efficaci nelle larve rispetto agli embrioni15. In questo protocollo, viene descritto un metodo di ibridazione in situ per determinare l'espressione genica durante lo sviluppo del mesonephros zebrafish. Diversi passaggi sono ottimizzati per aumentare la visualizzazione del mesonefro e la penetrazione e il lavaggio della sonda e dell'anticorpo. La linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP) viene utilizzata insieme a una sonda per EGFP per etichettare singole cellule progenitrici, aggregati nefrogenici e tubuli distali dei nefroni nascenti. Questo metodo fornirà una comprensione più profonda dello sviluppo del mesonefro e una visione approfondita delle terapie rigenerative.
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Protocol
L'uso di larve e novellame di zebrafish è approvato dalla IUP IACUC (protocollo #02-1920, #08-1920). I dettagli del contenuto della soluzione sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Allevamento di larve
NOTA: Ci vorranno fino a 21 giorni o più per allevare larve e giovani allo stadio di interesse.
- Prepara il pesce zebra adulto ad accoppiarsi aggiungendo 1 pesce maschio e 1 femmina in una vasca di accoppiamento nel tardo pomeriggio dopo il loro ultimo pasto.
NOTA: non tutte le coppie di pesci si accoppiano. Inizia impostando 20 coppie per determinare il tasso di accoppiamento e regolare di conseguenza negli esperimenti futuri. - Il giorno successivo, dopo che i pesci hanno terminato l'accoppiamento (intorno alle 13:00), raccogliere gli embrioni con il mezzo E3 in piastre di Petri.
- Assicurarsi che non ci siano più di 30 embrioni per piastra.
- Rimuovere i detriti (come le feci) dalle piastre di Petri e aggiungere 20 ml di mezzo E3.
- Incubare a 28,5 °C per 1 giorno.
- Rimetti il pesce zebra adulto nel sistema acquatico.
- A 1 dpf, sostituire il mezzo E3 con E3 fresco.
- Incubare a 28,5 °C per altri 4 giorni fino a 5 dpf.
- Mettere uno schermo da 400 μm in un serbatoio da 2,8 L e riempirlo con 2 cm di acqua di sistema.
- Aggiungere le 5 larve dpf da 1 piastra (fino a 30 larve totali).
- Metti il serbatoio nel sistema acquatico, ma non avviare il flusso d'acqua.
- Nutrire le larve con 4 ml di cibo in polvere due volte al giorno fino a 14 dpf.
- A 6 dpf, avviare il flusso d'acqua a 1 goccia al secondo.
NOTA: Controllare il flusso d'acqua ogni giorno e regolare di conseguenza. - A 8 dpf, aumentare il flusso d'acqua in un flusso lento e costante.
- A 14 dpf, nutrire i gamberetti vivi in salamoia oltre al cibo in polvere.
2. Giorno 1 - 2: Fissaggio delle larve
- Rimuovere un serbatoio di larve nel punto temporale desiderato.
- Riempire una piastra di Petri con 20 ml di acqua di sistema.
- Utilizzare una rete a maglie sottili per raccogliere delicatamente le larve e portarle sulla superficie dell'acqua.
- Tagliare la punta di una pipetta di trasferimento per dare un'apertura più ampia e trasferire le larve nella piastra di Petri. La bocca della pipetta più grande consente il trasferimento di diverse piccole larve o di alcune più grandi contemporaneamente.
- Aggiungere 2 ml di tricaina (2%, pH 7 stock) per immobilizzare le larve.
- Dopo che le larve hanno smesso di muoversi, rimuovere la maggior parte dell'acqua e aggiungere 10 ml di tricaina. Attendere 15 minuti per l'eutanasia delle larve.
- Opzionale: per i giovani di lunghezza superiore a 8 mm, tagliare le teste e le code con una lama di rasoio (dopo eutanasia) sotto un microscopio di dissezione per migliorare la penetrazione della soluzione di fissaggio. Assicurati di registrare la lunghezza totale di ogni animale prima di tagliare la testa e la coda e isolare ciascuno nella propria piastra di Petri. Fare riferimento al passaggio 3 per come misurare gli animali.
- Sostituire la tricaina con 20 ml di soluzione fissante (4% paraformaldeide, 1% DMSO). Rimettere il coperchio sulla piastra di Petri e dondolare lentamente in una cappa aspirante.
NOTA: è importante utilizzare una piattaforma a dondolo. Una piattaforma vibrante con un movimento circolare causerà la curvatura dell'asse animale. Utilizzare solo una soluzione fissante fresca (non preconfezionata congelata).
ATTENZIONE: La soluzione fissante contiene paraformaldeide, che è un probabile cancerogeno. Utilizzare cappa aspirante (o maschera) e guanti per misurare la polvere. - Dopo 30 minuti, sostituire la soluzione di fissaggio con una nuova soluzione di fissaggio.
- Raccogliere la soluzione fissante utilizzata in un contenitore separato per il corretto smaltimento.
- Trasferire le larve in un tubo da 50 ml contenente 25 mL di soluzione fissante fresca.
- Assicurarsi che il cappuccio sia stretto e oscillare lentamente a 4 °C per 2 giorni. È possibile incubare più a lungo per comodità.
3. Giorno 3: Misurazione delle larve
- In una cappa aspirante, sostituire la soluzione di fissaggio con 20 ml di PBST.
- Trasferire le larve in una piastra di Petri.
- Metti un righello piatto su un microscopio di dissezione e metti la piastra di Petri sopra il righello.
- Usa un manipolatore di ciglia per spostare ogni larva sul righello per misurarne la lunghezza totale (dal muso alla punta della pinna caudale) (Figura 1).
- Combinare diverse larve di lunghezze simili (ad esempio, 5,0 mm e 5,1 mm) in una fiala di vetro da 5,5 ml, fino a 10 larve per fiala.
4. Giorno 3 - 4: Disidratazione
- Sostituire il PBST con 4 ml di metanolo al 100%. Cullare il flaconcino per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Sostituire il metanolo con metanolo fresco e roccia per 5 minuti. Ripeti ancora una volta.
- Conservare il flaconcino a -20 °C per 2 giorni. È possibile incubare più a lungo per comodità.
5. Giorno 5: Reidratazione
- Riscaldare il flaconcino a temperatura ambiente.
- Sostituire il metanolo con 4 ml di metanolo al 75% / PBST al 25%. Roccia per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Sostituire la soluzione nel passaggio 5.2 con 4 ml di metanolo al 50% / PBST al 50% e roccia per 5 minuti.
- Sostituire la soluzione nel passaggio 5.3 con 4 mL di metanolo al 25% / PBST al 75% e roccia per 5 minuti.
- Sostituire la soluzione nel passaggio 5.4 con 4 ml di PBST e roccia per 10 minuti.
- Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.
6. Giorno 5: Proteinasi K digest
- Sostituire il PBST con 2 mL della soluzione di proteinasi K (20 μg/mL, concentrazione finale dmSO all'1% in PBST) e oscillare a temperatura ambiente per 30 min.
NOTA: le larve più lunghe di 6 mm avranno bisogno di un tempo di incubazione più lungo e/o di una concentrazione di proteinasi K più elevata. Il tempo esatto e la concentrazione dovranno essere determinati empiricamente. Inizia con un aumento di 10 minuti del tempo di incubazione per ogni 0,5 mm più lungo di 6 mm. - Sostituire la soluzione di proteinasi K con 4 mL di PBST e roccia per 10 min.
- Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.
- Sostituire il PBST con 4 mL di soluzione di fissaggio fresco e roccia per 1 ora. È possibile incubare più a lungo a 4 °C per comodità.
7. Giorno 5: Sbiancamento
- Sostituire la soluzione di fissaggio con 4 ml di PBST e rocciare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.
- Trasferire le larve in una piastra a 6 pozzetti (fino a 10 larve per pozzetto).
- Sostituire il PBST con 3 ml di soluzione sbiancante fresca.
- Roccia a temperatura ambiente e monitorare la pigmentazione al microscopio sezionante ogni 5 minuti. Cerca la scomparsa della pigmentazione lungo il mesonefro (dorsale alla vescica natatoria e all'intestino).
NOTA: Per le larve lunghe fino a 6 mm, ci vorranno fino a 20 minuti per sbiancare la pigmentazione che circonda il mesonefro. Non sbiancare più a lungo del necessario per preservare l'integrità delle larve. - Trasferire nuovamente le larve in una fiala di vetro.
- Sostituire la soluzione sbiancante con 4 ml di PBST. Roccia per 10 min.
- Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.
- Sostituire il PBST con 4 mL di soluzione di fissaggio fresco e roccia per 1 ora. È possibile incubare più a lungo a 4 °C per comodità.
8. Giorno 5: Preibridizzazione
NOTA: per i passaggi eseguiti a 70 °C, è importante lavorare rapidamente per ridurre al minimo il raffreddamento del flaconcino.
- Sostituire la soluzione di fissaggio con 4 ml di PBST e rocciare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.
- Sostituire il PBST con 4 mL della soluzione Hyb- e dondolare a temperatura ambiente per 10 min.
ATTENZIONE: Le soluzioni Hyb-, Hyb+ e sonda contengono formammide, che può irritare la pelle. Utilizzare i guanti per maneggiare queste soluzioni. - Sostituire l'Hyb- con 4 ml di Hyb fresco- e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.
- Raccogliere le soluzioni Hyb-, Hyb+ e probe usate in un contenitore separato per il corretto smaltimento.
- Sostituire Hyb- con 4 mL della soluzione Hyb+.
- Incubare il flaconcino a 70 °C durante la notte.
- Diluire la sonda EGFP-fluoresceina 1:100 in 500 μL di Hyb+ e incubarla O/N a 70 °C.
NOTA: seguire le istruzioni del produttore per la sintesi della sonda.
9. Giorno 6: Ibridazione della sonda
- Sostituire la soluzione di Hyb+ nel flaconcino con la sonda preriscaldata e incubare a 70 °C durante la notte.
NOTA: le larve più lunghe di 6 mm necessitano di 2 giorni di incubazione. - Preriscaldare il tampone di lavaggio, 2 soluzioni SSCT e 0,2x SSCT a 70 °C per la notte.
10. Giorno 7: Lavaggio della sonda
- Sostituire la sonda con 4 mL del tampone di lavaggio preriscaldato e incubare a 70 °C per 30 min.
- Raccogliere la sonda usata in un contenitore separato per il corretto smaltimento.
- Sostituire il tampone di lavaggio con 4 mL di tampone di lavaggio fresco e incubare a 70 °C per 30 minuti.
- Sostituire il tampone di lavaggio con 4 mL della soluzione preriscaldata 2x SSCT e incubarlo a 70 °C per 15 min.
- Aggiungere 50 mL di SSCT preriscaldato 0,2x in un tubo da 50 mL.
- Inserire un filtro cellulare (100 μm) nella parte superiore del tubo. Assicurarsi che il filtro cellulare venga spinto fino in fondo fino a quando non si ferma.
- Trasferire le larve dalla fiala di vetro nel colino cellulare. Assicurarsi che le larve siano immerse nel tampone e incubare a 70 °C per 2 ore.
- Preparare un nuovo tubo contenente 50 ml di SSCT preriscaldato 0,2x.
- Trasferire il filtro cellulare dal passaggio 10.4.2 nel nuovo tubo di 0,2x SSCT e incubare a 70 °C per 2 ore.
- Ripetere il passaggio 10.5 ancora una volta.
11. Giorno 7: Blocco
- Trasferire le larve in una nuova fiala di vetro e raffreddare a temperatura ambiente.
- Sostituire lo 0,2x SSCT con 4 mL del 67% 0,2x SSCT/33% MABT e oscillare a temperatura ambiente per 10 min.
- Sostituire la soluzione nel passaggio 11.2 con 4 mL di 33% 0,2x SSCT/67% MABT e roccia per 10 min.
- Sostituire la soluzione nel passaggio 11.3 con 4 mL di MABT e roccia per 10 min.
- Sostituire il MABT con 4 ml di MABT fresco e roccia per 10 minuti. Ripeti ancora una volta.
- Sostituire il MABT con 4 mL della soluzione bloccante e incubare a 4 °C durante la notte. È possibile incubare più a lungo per comodità.
12. Giorno 8 - 9: Incubazione degli anticorpi
- Diluire l'anticorpo anti-fluoresceina 1:5.000 in soluzione bloccante da 500 μL.
- Sostituire la soluzione bloccante con la soluzione anticorpale e incubare a 4 °C per 2 giorni. È possibile incubare più a lungo per comodità.
- Ruotare la fiala due volte al giorno per agitare le larve.
NOTA: le larve più lunghe di 6 mm hanno bisogno di 1-2 giorni in più di incubazione.
- Ruotare la fiala due volte al giorno per agitare le larve.
13. Giorno 10 - 11: Lavaggio degli anticorpi
- Sostituire la soluzione anticorpale con 4 mL di PBST e oscillare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.
- Trasferire le larve in un tubo da 50 ml.
- Aggiungere 40 ml di PBST2. Posare il tubo su un lato e oscillare a 4 °C durante la notte.
- Sostituire il PBST2 con 40 ml di PBST2 fresco e dondolare a 4 °C durante la notte. È possibile incubare più a lungo per comodità.
NOTA: le larve più lunghe di 6 mm richiedono 1-2 giorni in più di lavaggio.
14. Giorno 12: Colorazione
- Trasferire le larve in una piastra a 6 pozzetti.
- Sostituire il PBST2 con 3 mL di tampone di colorazione e roccia a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Sostituire il tampone di colorazione con 3 mL di tampone di colorazione fresco e roccia per 5 minuti. Ripeti ancora una volta.
- Sostituire il tampone colorante con 3 mL della soluzione colorante. Coprire con un foglio di alluminio e monitorare la colorazione nelle prossime ore.
- Per le sonde con un segnale debole, incubare a 4 °C durante la notte e sostituire la soluzione colorante con una soluzione colorante fresca una volta nel mezzo.
- Quando viene raggiunta l'intensità di colorazione desiderata, sostituire la soluzione di colorazione con 3 ml della soluzione di arresto e roccia per 30 minuti.
- Sostituire la soluzione di arresto con 3 mL di soluzione di arresto fresco e roccia per 30 minuti. Ripeti ancora una volta.
- Trasferire le larve in un nuovo flaconcino di vetro e sostituire la soluzione di arresto con 4 mL di soluzione fissante fresca e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. È possibile incubare più a lungo a 4 °C per comodità.
- Conservare le larve nella soluzione fissante al buio a 4 °C per un massimo di un anno.
15. Giorno 12: Imaging
- Sostituire la soluzione di fissaggio con 4 ml di PBST e rocciare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Trasferire le larve in una piastra a 6 pozzetti.
- Sostituire il PBST con 4 ml di PBST fresco e roccia per 10 min. Ripeti ancora una volta.
- Sostituire il PBST con 3 ml di glicerolo al 50% (in PBST) e roccia per 10 minuti.
- Sostituire la soluzione nel passaggio 15.4 con 3 ml di glicerolo al 100% senza dondolare per 10 minuti.
- Utilizzare un microscopio di dissezione per visualizzare le larve direttamente nella piastra a 6 pozzetti o trasferire le larve in un vetrino di depressione a immagine sotto un microscopio composto. Usa un manipolatore di ciglia per orientare le larve.
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Representative Results
Utilizzando la linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP), è stato dimostrato che questo protocollo di ibridazione in situ è efficace nell'etichettare le cellule progenitrici renali e varie strutture di nefroni durante lo sviluppo di mesonefro. Come previsto, anche il sistema nervoso centrale è etichettato in questa linea transgenica (non mostrata). Il nefrone mesonefrico iniziale si forma a circa 5,2 mm, dorsale al pronephros (Figura 2A), e il tubulo distale di questo nefrone è etichettato da EGFP10,12. I cluster progenitori sono presenti in questa fase e in seguito (Figura 2A-B, punte di freccia) e anche le singole cellule progenitrici sono etichettate (Figura 2C). Questo metodo fornisce uno strumento aggiuntivo nello studio dello sviluppo del rene e aiuta a far luce sulla comprensione del rene umano.
Figura 1: Misurazione delle larve. Le larve fisse in una piastra di Petri sono poste sopra un righello piatto. Sotto un microscopio di dissezione, le larve vengono misurate e separate da gruppi di dimensioni simili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sviluppo di Mesonephros. A circa 5,2 mm nella linea transgenica Tg(lhx1a-EGFP), il primo nefrone mesonefrico si forma dorsale a pronephros e vescica natatoria (SB) (A). Gruppi di cellule progenitrici sono presenti durante lo sviluppo del mesonefro (A-B, punte di freccia) oltre alle singole cellule progenitrici (C, parentesi). Nei giovani più grandi, la colorazione di fondo può verificarsi nei somiti (C, frecce). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo di ibridazione in situ qui descritto ha lo scopo di studiare lo sviluppo del mesonefro. Tuttavia, può essere applicato per studiare lo sviluppo di altri tessuti e organi durante la metamorfosi, come l'intestino, il sistema nervoso, le squame e la pigmentazione14. Le sonde possono essere generate per geni endogeni o marcatori fluorescenti in linee transgeniche.
È fondamentale che le larve rimangano intatte per osservare gli organi e i tessuti nel loro contesto nativo. Per mantenere l'integrità dei tessuti, è importante ridurre al minimo il tempo di trattamento con proteinasi K. È importante determinare il miglior tempo di trattamento per ogni nuovo lotto di enzima. In alternativa, l'acetone può essere utilizzato al posto della proteinasi K per migliorare l'integrità dei tessuti16. L'eccessivo sbiancamento riduce anche l'integrità dei tessuti. Lo sbiancamento minimo e il permesso agli occhi di trattenere una certa pigmentazione aiutano a visualizzare le larve durante i lavaggi. È comune che gli occhi cadano durante la fase di ibridazione, che è un indicatore di fragilità dei tessuti. L'uso di DMSO con la soluzione fissante e di proteinasi K è fondamentale per la penetrazione dei tessuti17.
Una limitazione di questo metodo è la scarsa penetrazione dei reagenti negli animali più grandi. Per migliorare la penetrazione, la testa e la coda possono essere rimosse con una lama di rasoio prima della fissazione17. L'intestino può essere rimosso con pinzette sottili e aghi di tungsteno dopo la fissazione per consentire l'accesso diretto dei reagenti al mesonefro. Le sonde lunghe (superiori a 1 KB) possono avere una scarsa penetrazione del tessuto, ma possono essere idrolizzate in frammenti corti (circa 0,3 KB) per migliorare la penetrazione18. Per le sonde con segnali deboli, le sonde di controllo con la sequenza di rilevamento possono essere utilizzate per distinguere tra il segnale di fondo e quello della sonda. Gli animali più grandi avranno una colorazione di fondo più alta dei somiti (Figura 2C, frecce). Tuttavia, questo può essere ridotto al minimo con lavaggi più lunghi della sonda e degli anticorpi.
Il protocollo qui può essere applicato anche a tessuti e organi sezionati e isolati, come il rene adulto zebrafish12,19. Sebbene ci siano descrizioni pubblicate di protocolli simili9,16, nessuno di essi descrive l'intero processo dall'allevamento delle larve all'ibridazione in situ con questo livello di dettaglio. Pertanto, questo metodo fornisce uno strumento aggiuntivo per decifrare lo sviluppo del rene vertebrato.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il finanziamento è stato fornito dalla Pennsylvania Academy of Science, dal Commonwealth of Pennsylvania Biologists e dall'Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology e Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). La linea transgenica Tg (lhx1a-EGFP) è stata fornita dal Dr. Neil Hukriede (Università di Pittsburgh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
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