Summary
الحمار الوحشي هو نموذج مهم لفهم نمو الكلى. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في يرقات حمار وحشي والأحداث أثناء تطور الميكسونفروس.
Abstract
تشكل سمكة الحمار الوحشي هيكلين للكلى في حياتها. تتشكل الفروس (الكلى الجنينية) أثناء النمو الجنيني وتبدأ في العمل بعد يومين من الإخصاب. تتكون من اثنين فقط من الكليفرونات ، يعمل الفروس ككلية وحيدة خلال حياة اليرقات حتى يلزم المزيد من وظائف الكلى بسبب زيادة كتلة الجسم. للتعامل مع هذا الطلب المرتفع ، يبدأ الموسونيفروس (الكلى البالغة) في التشكل أثناء التحول. الكلية الأولية الجديدة تنصهر إلى المعرضة وتشكل التجويفات المتصلة. ثم، تنصهر الكلية الثانوية إلى تلك الأولية (وهلم جرا) لإنشاء شبكة متفرعة في mesonephros. وتركز الغالبية العظمى من البحوث على المعرضة بسبب سهولة استخدام الأجنة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تطوير تقنيات لدراسة اليرقات القديمة والأكبر والأسماك الأحداث لفهم أفضل لتطور الميكسونيفروس. هنا ، يتم تحسين بروتوكول التهجين في الموقع لتحليل التعبير الجيني لاختراق المسبار ، وغسل المسابير والأجسام المضادة ، وتبييض الأصباغ لتصور أفضل للمسونيفروس. يستخدم خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا لتسمية خلايا السلف والأنابيب البعيدة من الكليرونات الوليدة. هذا البروتوكول يسد فجوة في أبحاث الميكسونفروس. وهو نموذج حاسم لفهم كيفية تشكل أنسجة الكلى الجديدة والاندماج مع الكلية الموجودة وتوفير رؤى في العلاجات التجديدية.
Introduction
جنين حمار وحشي هو نموذج مهم لدراسة تطور الأنسجة بسبب صغر حجمه وشفافيته وأدواته المتاحة وبقائه دون تغذية لمدة تصل إلى خمسة أيام1,2. وقد ساهم بشكل كبير في فهم نمو الكلى والحفاظ على بين حمار وحشي والثدييات3،4،5. تلعب الكلية دورا أساسيا في الحفاظ على التوازن السائل ، وتصفية الدم ، وإفراز النفايات6. وتتألف الكلية، وهي الوحدة الوظيفية للكلى، من فلتر دم متصل بأنابيب طويلة. في حمار وحشي، اثنين من هياكل الكلى تشكل طوال حياتها. تتشكل الفروس (الكلية الجنينية المؤقتة) أولا أثناء النمو المبكر. وهو يتألف من اثنين من الكلية التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي ويصبح وظيفيا في حوالي 2 أيام بعد الإخصاب (dpf). تكمن فائدة الفروس في بساطته ، حيث يبدأ اثنان فقط من الكليرونات التي هي في الغالب خطية وسهلة التصور (على الرغم من أن أنبوب الأنبوب الملتوي القريب يبدأ في اللف عند ثلاثة dpf)3. وقد سهل هذا ليس فقط دراسات تطورها المبكر من mesoderm المتوسطة، ولكن أيضا نمط التقسيم وإصلاح أنبوبي7،8.
تصبح فائدة سمك الحمار الوحشي محدودة بعد خمسة dpf ، عندما يتضاءل الصفار وتعتمد اليرقات على التغذية في النظام المائي9. في حوالي 2 أسابيع من العمر ، تخضع اليرقات للتحول إلى أحداث ، حيث تتشكل أنسجة جديدة وتضيع الأنسجة القديمة و / أو إعادة تنظيم9. هذا هو أيضا عندما mesonephros (الكلى الكبار الدائم) تشكل10،11،12. يتشكل أول نييفرون بالغ بالقرب من السوسميت السادس ، ويندمج مع أنبوب الأنابيب المبكر البعيدة من النضال. تتم إضافة نييفرونات إضافية إلى هذا الموقف في البداية ، ولكن أيضا نحو الأمامي في وقت لاحق. تندمج الكليرونات الأولية في هذه الموجة الأولى في أنابيب التينفروس وتشترك في تجويف مشترك لإيداع نفاياتها. تتشكل الكلية الثانوية في الموجة التالية ويندمج في الكليرونات الأولية. هذه العملية تكرار يخلق mesonephros التي تتفرع، إلى حد ما أقرب إلى الكلى الثدييات. يفترض، وs pronephros يفقد في نهاية المطاف هويته أنبوبي ويصبح اثنين من قنوات جمع الرئيسية حيث جميع nephrons استنزاف النفايات الخاصة بهم13.
قبل تشكيل أول نسل نيفيرون بالغ ، تبدأ خلايا السلف المفردة في الظهور في يرقات ~4 مم (الطول الإجمالي) (~ 10 ديسيبل في البرونيل). هذه الخلايا، التي تم وضع علامة في خط TG (lhx1a-EGFP) المعدلة وراثيا، تلتزم المعرضة ويبدو أن الهجرة إلى مواقع مستقبلية من تولد الكلية. تتجمع الخلايا المفردة في مجموعات، والتي تفرق إلى nephrons12 جديدة. ومن غير الواضح أين تتواجد هذه الخلايا أو ما هي الجينات التي تعبر عنها قبل بداية تكوين الميسونيفروجين.
فهم تطور mesonephros يوفر رؤى في الكلى الثدييات بطرق لا يمكن أن المعرضة. وتشمل هذه تشكيل المجاميع الكلية من خلايا السلف واحد، والتكامل الوظيفي للنيفرونات الجديدة مع تلك الموجودة، والمورفوجين المتفرعة. ومع ذلك ، هناك قيود على دراسة التنمية بعد الطمث. اليرقات أقل شفافية بسبب حجمها الأكبر وجود تصبغ. والجدول الزمني للنمو غير متزامن بين فرادى الحيوانات ويعتمد اعتمادا كبيرا على العوامل البيئية، مثل التغذية والزحام 9،14. على الرغم من وجود الكواشف القاضية ، إلا أنها أقل فعالية في اليرقات مقارنة بالأجنة15. في هذا البروتوكول، يتم وصف طريقة التهجين في الموقع لتحديد التعبير الجيني أثناء تطوير سمك الحمار الوحشي mesonephros. يتم تحسين عدة خطوات لزيادة التصور من mesonephros والاختراق وغسل المسبار والأجسام المضادة. يستخدم خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا جنبا إلى جنب مع مسبار ل EGFP لتسمية خلايا السلف المفردة ، والمجاميع الكلية ، وأنابيب الكلية البعيدة من الكلية الوليدة. ستوفر هذه الطريقة فهما أعمق لتطوير mesonephros ونظرة ثاقبة في العلاجات التجديدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على استخدام يرقات ويرقات حمار وحشي من قبل IUP IACUC (البروتوكول رقم 02-1920، #08-1920). يتم سرد تفاصيل محتوى الحل في جدول المواد.
1. تربية اليرقات
ملاحظة: يستغرق رفع اليرقات والأحداث إلى مرحلة الاهتمام ما يصل إلى 21 يوما أو أكثر.
- إعداد حمار وحشي الكبار لتزاوج عن طريق إضافة 1 الذكور و 1 أنثى الأسماك في خزان التزاوج في وقت متأخر من بعد الظهر بعد وجبتهم الأخيرة.
ملاحظة: لن تتزاوج جميع أزواج السمك. ابدأ بإعداد 20 زوجا لتحديد معدل التزاوج وضبطه وفقا لذلك في التجارب المستقبلية. - في اليوم التالي بعد الانتهاء من التزاوج الأسماك (حوالي 1 بعد الظهر)، وجمع الأجنة مع E3 المتوسطة في لوحات بيتري.
- تأكد من عدم وجود أكثر من 30 جنينا لكل طبق.
- إزالة الحطام (مثل البراز) من لوحات بيتري وإضافة 20 مل من E3 المتوسطة.
- حضانة عند 28.5 درجة مئوية لمدة يوم واحد.
- ضع سمك الحمار الوحشي البالغ مرة أخرى في النظام المائي.
- في 1 dpf، استبدال المتوسط E3 مع E3 الطازجة.
- حضانة عند 28.5 درجة مئوية لمدة 4 أيام أخرى حتى 5 ديسب في ال 5.
- وضع شاشة 400 ميكرومتر في خزان 2.8 لتر وملئه مع 2 سم من مياه النظام.
- أضف يرقات 5 ديسيبل من طبق واحد (ما يصل إلى 30 يرقة إجمالية).
- وضع الخزان في النظام المائي، ولكن لا تبدأ تدفق المياه.
- إطعام اليرقات 4 مل من مسحوق الطعام مرتين في اليوم حتى 14 ديسبف.
- في 6 dpf، بدء تدفق المياه في 1 بالتنقيط في الثانية الواحدة.
ملاحظة: تحقق من تدفق المياه يوميا وضبط وفقا لذلك. - في 8 ديسبف في الوو، قم بزيادة تدفق المياه إلى تيار بطيء وثابت.
- في 14 ديسبف، تغذية الروبيان المالحة الحية بالإضافة إلى مسحوق الغذاء.
2. اليوم 1 - 2: إصلاح اليرقات
- إزالة خزان من اليرقات في الوقت المطلوب.
- ملء لوحة بيتري مع 20 مل من مياه النظام.
- استخدم شبكة شبكية دقيقة لاستخراج اليرقات بلطف وجلبها إلى سطح الماء.
- قطع غيض من ماصة نقل لإعطاء فتح أوسع ونقل اليرقات إلى لوحة بيتري. فم ماصة أكبر يسمح لنقل العديد من اليرقات الصغيرة أو عدد قليل منها أكبر في وقت واحد.
- أضف 2 مل من ثلاثية (2٪، pH 7 stock) لشل حركة اليرقات.
- بعد توقف اليرقات عن الحركة ، قم بإزالة معظم الماء وإضافة 10 مل من tricaine. انتظر 15 دقيقة حتى يتم قتل اليرقات.
- اختياري: بالنسبة للأحداث الذين تزيد مدة طولهم عن 8 مم، اقطعوا الرؤوس والذيول بشفرة حلاقة (بعد القتل الرحيم) تحت مجهر تشريح لتحسين اختراق محلول التثبيت. تأكد من تسجيل الطول الإجمالي لكل قبل قطع الرأس والذيل وعزل كل واحد في لوحة بيتري الخاصة به. راجع الخطوة 3 لمعرفة كيفية قياس الحيوانات.
- استبدال tricaine مع 20 مل من حل تحديد (4٪ بارافورمالديهايد، 1٪ DMSO). وضع الغطاء مرة أخرى على لوحة بيتري والصخور ببطء في غطاء الدخان.
ملاحظة: من المهم استخدام منصة هزاز. منصة اهتزاز مع حركة دائرية سوف يسبب محور الحيوان أن يكون منحنيا. استخدام الطازجة فقط (غير مسبقة الصنع المجمدة) حل تحديد.
تنبيه: يحتوي محلول التثبيت على بارافورمالدهيد، وهو مادة مسرطنة محتملة. استخدام غطاء الدخان (أو قناع) والقفازات لقياس مسحوق. - بعد 30 دقيقة، استبدل حل الإصلاح بحل إصلاح جديد.
- جمع حل التثبيت المستخدم في حاوية نفايات منفصلة للتخلص منها بشكل صحيح.
- نقل اليرقات إلى أنبوب 50 مل يحتوي على 25 مل من محلول التثبيت الطازج.
- تأكد من أن الغطاء ضيق والصخور ببطء عند 4 درجة مئوية لمدة يومين. فمن الممكن لاحتضان لفترة أطول للراحة.
3. اليوم الثالث: قياس اليرقات
- في غطاء الدخان، استبدل حل التثبيت ب 20 مل من PBST.
- نقل اليرقات إلى لوحة بيتري.
- وضع مسطرة مسطحة على المجهر تشريح ووضع لوحة بيتري على رأس المسطرة.
- استخدم متلاعب رمش لتحريك كل يرقة إلى المسطرة لقياس طولها الإجمالي (من خطم إلى طرف الزعنفة caudal) (الشكل 1).
- اجمع عدة يرقات ذات أطوال مماثلة (على سبيل المثال، 5.0 مم و5.1 مم) في قارورة زجاجية واحدة سعة 5.5 مل، تصل إلى 10 يرقات لكل قارورة.
4. اليوم 3 - 4: الجفاف
- استبدال برنامج تلفزيوني مع 4 مل من الميثانول 100٪. صخرة القارورة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- استبدل الميثانول بالميثانول الطازج والصخور لمدة 5 دقائق. كرر مرة أخرى.
- تخزين القارورة في -20 درجة مئوية لمدة 2 أيام. فمن الممكن لاحتضان لفترة أطول للراحة.
5. اليوم الخامس: الإماهة
- قم بتدفئة القارورة إلى درجة حرارة الغرفة.
- استبدال الميثانول مع 4 مل من الميثانول 75٪ / 25٪ PBST. صخرة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال الحل في الخطوة 5.2 مع 4 مل من الميثانول 50٪ / 50٪ PBST والصخور لمدة 5 دقائق.
- استبدال الحل في الخطوة 5.3 مع 4 مل من الميثانول 25٪ / 75٪ PBST والصخور لمدة 5 دقائق.
- استبدال الحل في الخطوة 5.4 مع 4 مل PBST والصخور لمدة 10 دقيقة.
- استبدال PBST مع 4 مل من برنامج تلفزيوني جديد والصخور لمدة 10 دقيقة. كرر مرة أخرى.
6. اليوم الخامس: هضم بروتيناز ك
- استبدال برنامج تلفزيوني مع 2 مل من محلول البروتين K (20 ميكروغرام / مل، 1٪ تركيز DMSO النهائي في PBST) والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: ستحتاج اليرقات التي تزيد فترة 6 مم إلى وقت حضانة أطول و/ أو تركيز أعلى من البروتين K. وسيتعين تحديد الوقت والتركيز بدقة تجريبيا. ابدأ بزيادة قدرها 10 دقائق في وقت الحضانة لكل 0.5 مم أطول من 6 مم. - استبدال محلول البروتين K مع 4 مل من PBST والصخور لمدة 10 دقيقة.
- استبدال PBST مع 4 مل من برنامج تلفزيوني جديد والصخور لمدة 10 دقيقة. كرر مرة أخرى.
- استبدال برنامج تلفزيوني مع 4 مل من حل تحديد جديدة والصخور لمدة 1 ساعة. من الممكن احتضان لفترة أطول عند 4 درجة مئوية للراحة.
7. اليوم الخامس: التبييض
- استبدال حل تحديد مع 4 مل من PBST والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- استبدال PBST مع 4 مل من برنامج تلفزيوني جديد والصخور لمدة 10 دقيقة. كرر مرة أخرى.
- نقل اليرقات إلى لوحة من 6 آبار (تصل إلى 10 يرقات لكل بئر).
- استبدال برنامج تلفزيوني مع 3 مل من محلول التبييض الطازج.
- صخرة في درجة حرارة الغرفة ورصد تصبغ تحت المجهر تشريح كل 5 دقائق. ابحث عن اختفاء التصبغ على طول mesonephros (الظهرية إلى المثانة السباحة والأمعاء).
ملاحظة: بالنسبة لليرقات التي يصل طولها إلى 6 مم ، سيستغرق الأمر ما يصل إلى 20 دقيقة لتبييض التصبغ المحيط بالميكونفروس. لا تبيض لفترة أطول من اللازم للحفاظ على سلامة اليرقات. - نقل اليرقات مرة أخرى إلى قارورة زجاجية.
- استبدال حل التبييض مع 4 مل من برنامج تلفزيوني. صخرة لمدة 10 دقائق.
- استبدال PBST مع 4 مل من برنامج تلفزيوني جديد والصخور لمدة 10 دقيقة. كرر مرة أخرى.
- استبدال برنامج تلفزيوني مع 4 مل من حل تحديد جديدة والصخور لمدة 1 ساعة. من الممكن احتضان لفترة أطول عند 4 درجة مئوية للراحة.
8. اليوم الخامس: الترطيب المسبق
ملاحظة: بالنسبة للخطوات التي تتم عند 70 درجة مئوية، من المهم العمل بسرعة لتقليل تبريد القارورة.
- استبدال حل تحديد مع 4 مل من PBST والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- استبدال PBST مع 4 مل من برنامج تلفزيوني جديد والصخور لمدة 10 دقيقة. كرر مرة أخرى.
- استبدال برنامج تلفزيوني مع 4 مل من الحل هيب، والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
تنبيه: تحتوي حلول Hyb-وHyb+و probe على فورماميد، والتي يمكن أن تهيج الجلد. استخدم قفازات للتعامل مع هذه الحلول. - استبدال Hyb- مع 4 مل من الهيب الطازجة والصخور لمدة 10 دقيقة. كرر مرة أخرى.
- جمع Hyb-، Hyb+، وحلول التحقيق المستخدمة في حاوية نفايات منفصلة للتخلص منها بشكل صحيح.
- استبدل Hyb- مع 4 مل من الحل Hyb+ .
- احتضان القارورة في 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تمييع مسبار EGFP-fluorescein 1:100 في 500 ميكرولتر من Hyb+ واحتضانه O/N عند 70 درجة مئوية.
ملاحظة: اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتوليف التحقيق.
9. اليوم 6: التهجين التحقيق
- استبدل محلول Hyb+ في القارورة بالمسبار المحمى مسبقا واحتضنه عند 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: تحتاج اليرقات التي تزيد عن 6 مم إلى يومين من الحضانة. - سخني المخزن المؤقت للغسيل، و2x SSCT، وحلول SSCT 0.2x عند 70 درجة مئوية لليلة واحدة.
10. اليوم 7: التحقيق الغسيل
- استبدل المسبار ب 4 مل من حاجز الغسيل المحمى مسبقا واحتضنه عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- جمع المسبار المستخدم في حاوية نفايات منفصلة للتخلص منها بشكل سليم.
- استبدل حاجز الغسيل ب 4 مل من مخزن الغسيل الطازج واحتضنه عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- استبدل حاجز الغسيل ب 4 مل من محلول SSCT المحمى مسبقا 2x واحتضنه عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- أضف 50 مل من SSCT مسخن 0.2x في أنبوب 50 مل.
- أدخل مصفاة خلايا (100 ميكرومتر) في الجزء العلوي من الأنبوب. تأكد من أن يتم دفع مصفاة الخلية على طول الطريق إلى أسفل حتى يتوقف.
- نقل اليرقات من القارورة الزجاجية إلى مصفاة الخلية. تأكد من أن اليرقات مغمورة في العازلة واحتضانها عند 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- إعداد أنبوب جديد يحتوي على 50 مل من سسخين 0.2x SSCT.
- نقل مصفاة الخلية من الخطوة 10.4.2 إلى أنبوب جديد من 0.2x SSCT واحتضان في 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- كرر الخطوة 10.5 مرة أخرى.
11. اليوم السابع: حظر
- نقل اليرقات إلى قارورة زجاجية جديدة وباردة لدرجة حرارة الغرفة.
- استبدال 0.2x SSCT مع 4 مل من 67٪ 0.2x SSCT/33٪ MABT والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- استبدال الحل في الخطوة 11.2 مع 4 مل من 33٪ 0.2x SSCT/67٪ MABT والصخور لمدة 10 دقيقة.
- استبدال الحل في الخطوة 11.3 مع 4 مل من MABT والصخور لمدة 10 دقيقة.
- استبدال MABT مع 4 مل من MABT الطازجة والصخور لمدة 10 دقيقة. كرر مرة أخرى.
- استبدل MABT ب 4 مل من محلول الحجب واحتضنه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. فمن الممكن لاحتضان لفترة أطول للراحة.
12. اليوم 8 - 9: حضانة الأجسام المضادة
- تمييع الأجسام المضادة للفلورسين 1:5,000 في محلول حجب 500 ميكرولتر.
- استبدل محلول الحجب بمحلول الأجسام المضادة واحتضنه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة يومين. فمن الممكن لاحتضان لفترة أطول للراحة.
- قم بتدير القارورة مرتين في اليوم لإثارة اليرقات.
ملاحظة: تحتاج اليرقات التي تزيد فترة أطول من 6 مم إلى أيام حضانة أكثر من 1-2.
- قم بتدير القارورة مرتين في اليوم لإثارة اليرقات.
13. اليوم 10 - 11: غسل الأجسام المضادة
- استبدال حل الأجسام المضادة مع 4 مل من PBST والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- استبدال PBST مع 4 مل من برنامج تلفزيوني جديد والصخور لمدة 10 دقيقة. كرر مرة أخرى.
- نقل اليرقات إلى أنبوب 50 مل.
- إضافة 40 مل من PBST2. وضع أنبوب على جانبها والصخور في 4 °C بين عشية وضحاها.
- استبدال PBST2 مع 40 مل من PBST2 الطازجة والصخور في 4 °C بين عشية وضحاها. فمن الممكن لاحتضان لفترة أطول للراحة.
ملاحظة: تحتاج اليرقات التي تزيد فترة 6 مم إلى 1-2 أيام أخرى من الغسيل.
14. اليوم 12: تلطيخ
- نقل اليرقات إلى لوحة من 6 آبار.
- استبدل برنامج PBST2 ب 3 مل من العازلة والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- استبدل العازلة تلطيخ مع 3 مل من العازلة تلطيخ جديدة والصخور لمدة 5 دقائق. كرر مرة أخرى.
- استبدل العازلة تلطيخ مع 3 مل من محلول تلطيخ. تغطية مع رقائق الألومنيوم ورصد تلطيخ على مدى الساعات القليلة المقبلة.
- للمسابير ذات الإشارة الضعيفة، احتضن عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها واستبدال محلول تلطيخ مع محلول تلطيخ جديدة مرة واحدة في ما بين.
- عندما يتم الوصول إلى كثافة تلطيخ المطلوب، استبدال محلول تلطيخ مع 3 مل من محلول وقف والصخور لمدة 30 دقيقة.
- استبدال حل وقف مع 3 مل من محلول وقف جديدة والصخور لمدة 30 دقيقة. كرر مرة أخرى.
- نقل اليرقات إلى قارورة زجاجية جديدة واستبدال محلول التوقف مع 4 مل من محلول التثبيت الطازج واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. من الممكن احتضان لفترة أطول عند 4 درجة مئوية للراحة.
- تخزين اليرقات في حل تحديد في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة.
15. اليوم الثاني عشر: التصوير
- استبدال حل تحديد مع 4 مل من PBST والصخور في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- نقل اليرقات إلى لوحة من 6 آبار.
- استبدال PBST مع 4 مل من برنامج تلفزيوني جديد والصخور لمدة 10 دقيقة. كرر مرة أخرى.
- استبدال برنامج تلفزيوني مع 3 مل من 50٪ الجلسرين (في PBST) والصخور لمدة 10 دقيقة.
- استبدال الحل في الخطوة 15.4 مع 3 مل من 100٪ الجلسرين مع عدم هزاز لمدة 10 دقيقة.
- استخدم مجهر تشريح لتصوير اليرقات مباشرة في لوحة 6-well أو نقل اليرقات إلى شريحة اكتئاب إلى صورة تحت مجهر مركب. استخدم متلاعب رمش لتوجيه اليرقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا ، ثبت أن هذا البروتوكول التهجين في الموقع فعال في وضع العلامات على خلايا السلف الكلوي وهياكل الكلية المختلفة أثناء تطوير الميكسونفروس. كما هو متوقع، يتم تسمية الجهاز العصبي المركزي أيضا في هذا الخط المعدلة وراثيا (لا يظهر). أشكال الكلية mesonephric الأولية في حوالي 5.2 مم، الظهرية إلى عرضة (الشكل 2A)، وتوبول البعيدة من هذا الكلي هو المسمى من قبل EGFP10،12. مجموعات السلف موجودة في هذه المرحلة وفي وقت لاحق (الشكل 2A-B، رؤوس الأسهم)، وخلايا السلف واحد وصفت أيضا (الشكل 2C). توفر هذه الطريقة أداة إضافية في دراسة نمو الكلى وتساعد على تسليط الضوء على فهم الكلى البشرية.
الشكل 1: قياس اليرقات. يتم وضع اليرقات الثابتة في لوحة بيتري فوق مسطرة مسطحة. تحت مجهر تشريح ، يتم قياس اليرقات وفصلها من قبل مجموعات من أحجام مماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تطوير ميسونفروس. في حوالي 5.2 ملم في خط TG (lhx1a-EGFP) المعدلة وراثيا، يتم تشكيل أول نييفرون mesonephric الظهرية إلى أوتيفيروس والمثانة السباحة (SB) (A). مجموعات من الخلايا السلف موجودة أثناء تطوير mesonephros (A-B، رؤوس الأسهم) بالإضافة إلى خلايا السلف واحد (C، قوس). في الأحداث الأكبر ، يمكن أن يحدث تلطيخ الخلفية في السخامات (C ، الأسهم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تهدف طريقة التهجين في الموقع الموصوفة هنا إلى دراسة تطوير الميكونيفروس. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه لدراسة تطور الأنسجة والأعضاء الأخرى أثناء التحول ، مثل الأمعاء والجهاز العصبي والمقاييس والتصبغ14. يمكن إنشاء مسابير للجينات الذاتية أو علامات الفلورسنت في خطوط معدلة وراثيا.
من المهم أن تبقى اليرقات سليمة من أجل مراقبة الأعضاء والأنسجة في سياقها الأصلي. للحفاظ على سلامة الأنسجة، من المهم تقليل وقت علاج البروتين K. من المهم تحديد أفضل وقت للعلاج لكل دفعة جديدة من الإنزيم. بدلا من ذلك، يمكن استخدام الأسيتون بدلا من البروتين K لتحسين سلامة الأنسجة16. التبييض المفرط يقلل أيضا من سلامة الأنسجة. الحد الأدنى من التبييض والسماح للعيون بالاحتفاظ ببعض التصبغ يساعد في تصور اليرقات أثناء الغسل. من الشائع أن تسقط العينين أثناء خطوة التهجين ، وهو مؤشر على هشاشة الأنسجة. استخدام DMSO مع تحديد وبروتيناز K الحل أمر بالغ الأهمية لاختراق الأنسجة17.
أحد قيود هذه الطريقة هو ضعف اختراق الكواشف في الحيوانات الكبيرة. لتحسين الاختراق، يمكن إزالة الرأس والذيل باستخدام شفرة حلاقة قبل التثبيت17. يمكن إزالة القناة الهضمية بالملاقط الدقيقة وإبر التنغستن بعد التثبيت للسماح بالوصول المباشر للكواشف إلى المايسونفروس. يمكن أن يكون للمسابير الطويلة (أكبر من 1 KB) اختراق ضعيف للأنسجة ، ولكن يمكن تحللها إلى شظايا قصيرة (حوالي 0.3 KB) لتحسين الاختراق18. بالنسبة للمسابير ذات الإشارات الضعيفة، يمكن استخدام مسابير التحكم ذات تسلسل الإحساس للتمييز بين الخلفية وإشارة المسبار. سيكون لدى الحيوانات الكبيرة خلفية أعلى من السخامات (الشكل 2C ، السهام). ومع ذلك ، يمكن تقليل هذا مع يغسل أطول من التحقيق والأجسام المضادة.
يمكن تطبيق البروتوكول هنا أيضا على الأنسجة والأعضاء المتشرخة والمعزولة ، مثل الكلى حمار وحشي البالغ12،19. على الرغم من وجود أوصاف منشورة للبروتوكولات المماثلة9،16 ، إلا أن أيا منها لا يصف العملية بأكملها من تربية اليرقات إلى التهجين في الموقع مع هذا المستوى من التفاصيل. لذلك ، توفر هذه الطريقة أداة إضافية في فك شفرة تطور الكلى الفقارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم توفير التمويل من قبل أكاديمية بنسلفانيا للعلوم، وكومنولث علماء الأحياء في بنسلفانيا، وجامعة إنديانا في بنسلفانيا (كلية الدراسات العليا والبحوث، وقسم البيولوجيا، وصندوق سينثيا سوشاك للبيولوجيا الجامعية للتميز). تم توفير خط Tg (lhx1a-EGFP) المعدل وراثيا من قبل الدكتور نيل هوكريدي (جامعة بيتسبرغ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al.
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
