Summary
Zebrafisken er en vigtig model for forståelse af nyreudvikling. Her er en in situ hybridisering protokol optimeret til at opdage genekspression i zebrafisk larver og unge under mesonephros udvikling.
Abstract
Zebrafisken danner to nyrestrukturer i sin levetid. Pronephros (embryonale nyre) dannes under embryonal udvikling og begynder at fungere ved 2 dage efter befrugtning. Bestående af kun to jomfruer, pronephros tjener som den eneste nyre i larve liv, indtil mere nyrefunktion er påkrævet på grund af den stigende kropsmasse. For at klare denne højere efterspørgsel begynder mesonephros (voksen nyre) at danne sig under metamorfose. De nye primære tåger smelter sammen med de udsattephros og danner forbundne lumen. Derefter smelter sekundære jomfruer til primære (og så videre) for at skabe et forgreningsnetværk i mesonephros. Langt størstedelen af forskningen er fokuseret på pronephros på grund af den lethed at bruge embryoner. Der er således behov for at udvikle teknikker til at studere ældre og større larver og ungfisk for bedre at forstå mesonephros udvikling. Her er en in situ hybridiseringsprotokol til genekspressionsanalyse optimeret til sondeindtrængning, vask af sonder og antistoffer og blegning af pigmenter for bedre at visualisere mesonephros. Den transgene Tg(lhx1a-EGFP) linje bruges til at mærke stamfaderceller og de distale tubules af spirende jomfruhroner. Denne protokol udfylder et hul i mesonephros forskning. Det er en afgørende model for at forstå, hvordan nye nyrevæv dannes og integreres med eksisterende jomfruer og giver indsigt i regenerative behandlinger.
Introduction
Zebrafiskembryo er en vigtig model til undersøgelse af vævsudvikling på grund af dets lille størrelse, gennemsigtighed, tilgængelige værktøjer og overlevelse uden fodring i op til fem dage1,2. Det har i høj grad bidraget til forståelsen af nyreudvikling og bevarelsen mellem zebrafisk og pattedyr3,4,5. Nyrerne spiller en væsentlig rolle i at opretholde flydende homøostase, filtrering af blodet, og udskille affald6. Nephron, den funktionelle enhed i nyrerne, består af et blodfilter forbundet med en lang tubule. I zebrafisk dannes to nyrestrukturer gennem hele sit liv. Pronephros (den midlertidige embryonale nyre) dannes først under den tidlige udvikling. Den består af to nephrons kører langs den forreste-posterior akse og bliver funktionel på omkring 2 dage efter befrugtning (dpf). Nytten af pronephros ligger i sin enkelhed, der kun har to nephrons, der er for det meste lineære og let at visualisere (selv om den proksimale indviklede tubule begynder at spole på tre dpf)3. Dette har lettet ikke kun undersøgelser af dens tidlige udvikling fra den mellemliggende mesoderm, men også segmenteringsmønsteret og tubule repair7,8.
Zebrafiskens nytte bliver begrænset efter fem dpf, når æggeblommen er formindsket, og larverne er afhængige af fodring i vandsystemet9. På omkring 2 uger gammel gennemgår larverne metamorfose til unger, hvor nye væv dannes og gammelt væv går tabt og / eller reorganiseret9. Dette er også, når mesonephros (den permanente voksne nyre) danner10,11,12. Den første voksne nephron danner nær den sjette somit, og smelter sammen med den distale tidlige tubule af pronephros. Yderligere nephrons tilføjes posterior til denne position i første omgang, men også mod den forreste senere. De primære jomfruer i denne første bølge smelter sammen med de tilbøjeligephros' tubules og deler en fælles lumen for at deponere deres affald. Sekundære jomfruer dannes i den næste bølge og smelter til primære jomfruer. Denne reiterative proces skaber en mesonephros, der er forgrenet, noget beslægtet med pattedyr nyre. Formentlig mister pronephros til sidst sin tubule identitet og bliver to store indsamling kanaler, hvor alle nephrons dræne deres affald13.
Før dannelsen af den første voksne nephron begynder enkelte stamceller at dukke op i ~ 4 mm (samlet længde) larver (~ 10 dpf). Disse celler, som er markeret i Tg(lhx1a-EGFP) transgene linje, klæber til pronephros og synes at migrere til fremtidige steder for nefrosese. De enkelte celler samles i klynger, som differentierer sig til nye jomfruer12. Det er uklart, hvor disse celler bor, eller hvilke gener de udtrykker før starten af mesonephrogenese.
Forståelse mesonephros udvikling giver indsigt i pattedyr nyre på måder, at pronephros ikke kan. Disse omfatter dannelsen af nefrogene aggregater fra enkelte stamfaderceller, funktionel integration af nye jomfruer med eksisterende og forgrening af morfogenese. Der er dog begrænsninger for at studere postembryonisk udvikling. Larverne er mindre gennemsigtige på grund af deres større størrelse og har pigmentering. Den udviklingsmæssige tidslinje er ikke synkron blandt de enkelte dyr og er meget afhængig af miljømæssige faktorer, såsom fodring og fortrængning9,14. Selvom knockdown reagenser eksisterer, er de mindre effektive i larver sammenlignet med embryoner15. I denne protokol beskrives en in situ hybridiseringsmetode til bestemmelse af genekspression under zebrafisk mesonephros udvikling. Flere trin er optimeret til at øge visualisering af mesonephros og penetration og vask af sonden og antistof. Den transgene Tg(lhx1a-EGFP) linje bruges sammen med en sonde til EGFP til at mærke enkelte stamfaderceller, nefrogene aggregater og de distale tubules af spirende jomfruer. Denne metode vil give en dybere forståelse af mesonephros udvikling og indsigt i regenerative behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af zebrafisk larver og unger er godkendt af IUP IACUC (protokol # 02-1920, # 08-1920). Oplysninger om løsningsindholdet er angivet i materialetabellen.
1. Opdræt af larver
BEMÆRK: Det vil tage op til 21 dage eller mere at hæve larver og unger til det stadium af interesse.
- Opsæt voksne zebrafisk til at parre ved at tilføje 1 mandlige og 1 kvindelige fisk i en parringstank i den sene eftermiddag efter deres sidste måltid.
BEMÆRK: Ikke alle fiskepar vil parre sig. Start med at oprette 20 par for at bestemme parringshastigheden og justere i overensstemmelse hermed i fremtidige eksperimenter. - Den næste dag efter fisken er færdig parring (omkring 13:00), indsamle embryoner med E3 medium i Petri plader.
- Sørg for, at der ikke er mere end 30 embryoner pr. plade.
- Fjern snavs (såsom afføring) fra petripladerne og tilsæt 20 mL E3-medium.
- Inkuberes ved 28,5 °C i 1 dag.
- Sæt den voksne zebrafisk tilbage i vandsystemet.
- Ved 1 dpf skal E3-mediet udskiftes med frisk E3.
- Inkuberes ved 28,5 °C i 4 dage mere, indtil 5 dpf.
- Sæt en 400 μm skærm i en 2,8 L tank og fyld den med 2 cm systemvand.
- Tilsæt de 5 dpf larver fra 1 plade (op til 30 samlede larver).
- Sæt tanken i vandsystemet, men start ikke vandstrømmen.
- Foder larverne 4 mL pulver mad to gange om dagen indtil 14 dpf.
- Ved 6 dpf skal du starte vandstrømmen ved 1 dryp i sekundet.
BEMÆRK: Kontroller vandstrømmen dagligt, og juster i overensstemmelse hermed. - Ved 8 dpf øges vandstrømmen til en langsom, stabil strøm.
- Ved 14 dpf fodres levende saltlage rejer ud over pulverføde.
2. Dag 1 - 2: Fastsættelse af larver
- Fjern en tank larver på det ønskede tidspunkt.
- Fyld en petriplade med 20 mL systemvand.
- Brug et fint net til forsigtigt at scoop larverne og bringe dem til vandoverfladen.
- Skær spidsen af en overførselspipette for at give en bredere åbning og overfør larverne til petripladen. Den større pipette munden giver mulighed for overførsel af flere små larver eller et par større på én gang.
- Tilsæt 2 mL tricain (2%, pH 7 lager) for at immobilisere larverne.
- Når larverne holder op med at bevæge sig, skal du fjerne det meste af vandet og tilsæt 10 mL tricain. Vent i 15 minutter på, at larverne aflives.
- Valgfrit: For unger, der er længere end 8 mm, afskæres hoved og haler med et barberblad (efter aktiv dødshjælp) under et dissekeringmikroskop for at forbedre indtrængning af fastgørelsesopløsningen. Sørg for at registrere den samlede længde af hvert dyr, før du afskærer hoved og hale og isolere hver enkelt i sin egen Petri plade. Se trin 3 for, hvordan du måler dyrene.
- Udskift tricainen med 20 mL fastgørelsesopløsning (4% paraformaldehyd, 1% DMSO). Sæt låget tilbage på Petri plade og rock langsomt i en røg hætte.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge en gyngeplatform. En rysteplatform med en cirkulær bevægelse vil medføre, at dyreaksen bues. Brug kun frisk (ikke premade frosset) fastgørelsesopløsning.
FORSIGTIG: Fastgørelsesopløsningen indeholder paraformaldehyd, som er et sandsynligt kræftfremkaldende stof. Brug røghætte (eller maske) og handsker til at måle pulveret. - Efter 30 min udskiftes fastgørelsesopløsningen med en frisk fastgørelsesopløsning.
- Den brugte fastgørelsesopløsning opsamles i en separat affaldsbeholder til korrekt bortskaffelse.
- Overfør larverne til et 50 mL rør, der indeholder 25 mL frisk fastgørelsesopløsning.
- Sørg for, at hætten er stram og rock langsomt ved 4 °C i 2 dage. Det er muligt at inkubere længere for nemheds skyld.
3. Dag 3: Måling af larver
- I en røghætte udskiftes fastgørelsesopløsningen med 20 mL PBST.
- Overfør larverne til en petriplade.
- Sæt en flad lineal på et dissekeringmikroskop og læg petripladen oven på linealen.
- Brug en øjenvippemanipulator til at flytte hver larve over på linealen for at måle dens samlede længde (fra snuden til spidsen af halefinnen) (Figur 1).
- Kombiner flere larver af lignende længder (f.eks. 5,0 mm og 5,1 mm) i et 5,5 mL glasglasglas, op til 10 larver pr. hætteglas.
4. Dag 3 - 4: Dehydrering
- Udskift PBST med 4 mL 100% methanol. Rock hætteglasset i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Udskift methanolen med frisk methanol og sten i 5 min. Gentag en gang til.
- Opbevar hætteglasset ved -20 °C i 2 dage. Det er muligt at inkubere længere for nemheds skyld.
5. Dag 5: Rehydrering
- Varm hætteglasset til stuetemperatur.
- Udskift methanolen med 4 mL 75% methanol/25% PBST. Rock i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Udskift opløsningen i trin 5.2 med 4 mL 50% methanol/50% PBST og sten i 5 min.
- Udskift opløsningen i trin 5.3 med 4 mL 25% methanol/75% PBST og sten i 5 min.
- Udskift opløsningen i trin 5.4 med 4 mL PBST og sten i 10 min.
- Udskift PBST med 4 mL frisk PBST og sten i 10 min. Gentag en gang til.
6. Dag 5: Proteinase K fordøje
- Udskift PBST med 2 mL af proteinase K-opløsningen (20 μg/mL, 1% DMSO endelig koncentration i PBST) og sten ved stuetemperatur i 30 min.
BEMÆRK: Larver, der er længere end 6 mm, skal have en længere inkubationstid og/eller en højere proteinase K-koncentration. Den nøjagtige tid og koncentration skal bestemmes empirisk. Start med en 10 min stigning i inkubationstiden for hver 0, 5 mm længere end 6 mm. - Udskift proteinase K-opløsningen med 4 mL PBST og sten i 10 min.
- Udskift PBST med 4 mL frisk PBST og sten i 10 min. Gentag en gang til.
- Udskift PBST med 4 mL frisk fastgørelsesopløsning og sten i 1 time. Det er muligt at inkubere længere ved 4 °C for nemheds skyld.
7. Dag 5: Blegning
- Udskift fastgørelsesopløsningen med 4 mL PBST og sten ved stuetemperatur i 10 min.
- Udskift PBST med 4 mL frisk PBST og sten i 10 min. Gentag en gang til.
- Overfør larverne til en 6-brønds plade (op til 10 larver pr. Brønd).
- Udskift PBST med 3 mL frisk blegeopløsning.
- Rock ved stuetemperatur og overvåge pigmentering under en dissekering mikroskop hver 5 min. Kig efter forsvinden af pigmentering langs mesonephros (dorsal til svømmeblæren og tarmen).
BEMÆRK: For larver op til 6 mm lange vil det tage op til 20 minutter at blege pigmenteringen omkring mesonephros. Bleg ikke længere end nødvendigt for at bevare larvernes integritet. - Overfør larverne tilbage til et glasglas.
- Udskift blegeopløsningen med 4 mL PBST. Rock i 10 min.
- Udskift PBST med 4 mL frisk PBST og sten i 10 min. Gentag en gang til.
- Udskift PBST med 4 mL frisk fastgørelsesopløsning og sten i 1 time. Det er muligt at inkubere længere ved 4 °C for nemheds skyld.
8. Dag 5: Prehybridization
BEMÆRK: For trin, der udføres ved 70 °C, er det vigtigt at arbejde hurtigt for at minimere hætteglaskølingen.
- Udskift fastgørelsesopløsningen med 4 mL PBST og sten ved stuetemperatur i 10 min.
- Udskift PBST med 4 mL frisk PBST og sten i 10 min. Gentag en gang til.
- Udskift PBST med 4 mL af Hyb-opløsningen, og sten ved stuetemperatur i 10 min.
FORSIGTIG: Hyb-, Hyb+, og sondeopløsninger indeholder formamid, som kan irritere huden. Brug handsker til at håndtere disse løsninger. - Udskift Hyb- med 4 mL frisk Hyb- og rock i 10 min. Gentag en gang til.
- Saml de brugte Hyb-, Hyb+, og sonde løsninger i en separat affaldsbeholder til korrekt bortskaffelse.
- Udskift Hyb- med 4 mL af Hyb+ opløsningen.
- Inkuberes hætteglasset ved 70 °C natten over.
- EGFP-fluoresceinsonden fortyndes 1:100 i 500 μL Hyb+ og inkuberes O/N ved 70 °C.
BEMÆRK: Følg producentens anvisninger for sondesyntese.
9. Dag 6: Probe hybridisering
- Hyb+-opløsningen udskiftes i hætteglasset med den forvarmede sonde, og inkuber ved 70 °C natten over.
BEMÆRK: Larver længere end 6 mm har brug for 2 dages inkubation. - Forvarm vaskebufferen, 2x SSCT og 0,2x SSCT-opløsninger ved 70 °C natten over.
10. Dag 7: Sondevask
- Sonden udskiftes med 4 mL af den forvarmede vaskebuffer, og inkuber ved 70 °C i 30 min.
- Saml den brugte sonde i en separat affaldsbeholder til korrekt bortskaffelse.
- Vaskebufferen udskiftes med 4 mL frisk vaskebuffer, og inkuber ved 70 °C i 30 min.
- Vaskebufferen udskiftes med 4 mL af den forvarmede 2x SSCT-opløsning, og inkuber den ved 70 °C i 15 min.
- Der tilsættes 50 mL forvarmet 0,2x SSCT i et 50 mL rør.
- Sæt en cellesn si (100 μm) ind i toppen af røret. Sørg for, at cellesienen skubbes helt ned, indtil den stopper.
- Overfør larverne fra glasglasset ind i cellesien. Sørg for, at larverne er nedsænket i bufferen og inkuberes ved 70 °C i 2 timer.
- Forbered et nyt rør, der indeholder 50 mL forvarmet 0,2x SSCT.
- Cellesien fra trin 10.4.2 overføres til det nye rør på 0,2x SSCT og inkuberes ved 70 °C i 2 timer.
- Gentag trin 10,5 en gang til.
11. Dag 7: Blokering
- Overfør larverne til et nyt glasglasglas og afkøles til stuetemperatur.
- Udskift 0,2x SSCT med 4 mL på 67% 0,2x SSCT/33% MABT og sten ved stuetemperatur i 10 min.
- Udskift opløsningen i trin 11.2 med 4 mL på 33% 0,2x SSCT/67% MABT og sten i 10 min.
- Udskift opløsningen i trin 11.3 med 4 mL MABT og sten i 10 min.
- Udskift MABT med 4 mL frisk MABT og sten i 10 min. Gentag en gang til.
- Udskift MABT med 4 mL af blokeringsopløsningen, og inkuber ved 4 °C natten over. Det er muligt at inkubere længere for nemheds skyld.
12. Dag 8 - 9: Antistofinkubation
- Anti-fluorescein antistof 1:5.000 fortyndes i 500 μL-blokerende opløsning.
- Blokereopløsningen udskiftes med antistofopløsningen, og inkuber ved 4 °C i 2 dage. Det er muligt at inkubere længere for nemheds skyld.
- Hvirvle hætteglasset to gange om dagen for at agitere larverne.
BEMÆRK: Larver længere end 6 mm har brug for 1-2 dage mere inkubation.
- Hvirvle hætteglasset to gange om dagen for at agitere larverne.
13. Dag 10 - 11: Antistofvask
- Udskift antistofopløsningen med 4 mL PBST og sten ved stuetemperatur i 10 min.
- Udskift PBST med 4 mL frisk PBST og sten i 10 min. Gentag en gang til.
- Overfør larverne til et 50 mL rør.
- Tilføj 40 mL PBST2. Læg røret på siden og rock ved 4 °C natten over.
- Udskift PBST2 med 40 mL frisk PBST2 og sten ved 4 °C natten over. Det er muligt at inkubere længere for nemheds skyld.
BEMÆRK: Larver længere end 6 mm har brug for 1-2 dage mere vask.
14. Dag 12: Farvning
- Overfør larverne til en 6-brønds plade.
- Udskift PBST2 med 3 mL farvningsbuffer og sten ved stuetemperatur i 5 min.
- Udskift farvningsbufferen med 3 mL frisk farvningsbuffer og sten i 5 min. Gentag en gang til.
- Udskift farvningsbufferen med 3 mL af farvningsopløsningen. Dæk med aluminiumsfolie og overvåge farvning i løbet af de næste par timer.
- For sonder med et svagt signal inkuberes ved 4 °C natten over, og farvningsopløsningen udskiftes med frisk farvningsopløsning en gang imellem.
- Når den ønskede farvningsintensitet er nået, skal farvningsopløsningen udskiftes med 3 ML af stopopløsningen og sten i 30 min.
- Udskift bremseopløsningen med 3 mL frisk stopopløsning og sten i 30 min. Gentag en gang til.
- Overfør larverne til et nyt glasglasglas og udskift bremseopløsningen med 4 mL frisk fastgørelsesopløsning og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Det er muligt at inkubere længere ved 4 °C for nemheds skyld.
- Opbevar larverne i fastgørelsesopløsningen i mørke ved 4 °C i op til et år.
15. Dag 12: Billedbehandling
- Udskift fastgørelsesopløsningen med 4 mL PBST og sten ved stuetemperatur i 10 min.
- Overfør larverne til en 6-brønds plade.
- Udskift PBST med 4 mL frisk PBST og sten i 10 min. Gentag en gang til.
- Udskift PBST med 3 mL 50% glycerol (i PBST) og sten i 10 min.
- Udskift opløsningen i trin 15.4 med 3 mL 100% glycerol uden vuggende i 10 min.
- Brug et dissekeringmikroskop til at afbilde larverne direkte i 6-brøndspladen eller overføre larverne til et depressionsdias til billedet under et sammensat mikroskop. Brug en øjenvipper manipulator til at orientere larverne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af Tg(lhx1a-EGFP) transgene linje, blev det påvist, at denne in situ hybridisering protokol er effektiv til mærkning nyre stamfader celler og forskellige nephron strukturer under mesonephros udvikling. Som forventet er centralnervesystemet også mærket i denne transgene linje (ikke vist). Den oprindelige mesonephric nephron danner på ca 5,2 mm, dorsal til pronephros (Figur 2A), og den distale tubule af denne nephron er mærket af EGFP10,12. Stam stamklynger er til stede på dette stadium og senere (Figur 2A-B, pilespidser), og enkelte stamfaderceller er også mærket (Figur 2C). Denne metode giver et ekstra værktøj til at studere nyreudvikling og hjælper med at kaste lys over at forstå den menneskelige nyre.
Figur 1: Måling af larver. Faste larver i en petriplade er placeret oven på en flad lineal. Under et dissekeringmikroskop måles larverne og adskilles af grupper af lignende størrelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mesonephros udvikling. Ved ca. 5,2 mm i den transgene Tg(lhx1a-EGFP) linje dannes den første mesonephric nephron dorsal til tilbøjeligephros og svømmeblære (SB) (A). Klynger af stamfaderceller er til stede under mesonephros udvikling (A-B, pilespidser) ud over enkelt stamfader celler (C, beslag). I større unger kan baggrundsfarvning forekomme i somitterne (C, pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den in situ hybridisering metode beskrevet her har til formål at studere mesonephros udvikling. Men, Det kan anvendes til at studere udviklingen af andre væv og organer under metamorfose, såsom tarmen, nervesystemet, skalaer, og pigmentering14. Sonder kan genereres for endogene gener eller fluorescerende markører i transgene linjer.
Det er afgørende for larverne at forblive intakte for at observere organer og væv i deres oprindelige sammenhæng. For at bevare vævsintegritet er det vigtigt at minimere tidspunktet for proteinase K-behandling. Det er vigtigt at bestemme den bedste behandlingstid for hvert nyt parti af enzym. Alternativt kan acetone bruges i stedet for proteinase K for forbedret vævsintegritet16. Overdreven blegning reducerer også vævsintegritet. Minimal blegning og giver øjnene mulighed for at bevare nogle pigmentering hjælpe med at visualisere larverne under vasker. Det er almindeligt, at øjnene falder af under hybridiseringstrinnet, hvilket er en indikator for vævsfragilitet. Brugen af DMSO med fastgørelses- og proteinase K-opløsningen er afgørende for vævspenetration17.
En begrænsning af denne metode er den dårlige indtrængen af reagenser hos større dyr. For at forbedre indtrængning kan hoved og hale fjernes med et barberblad før fiksering17. Tarmen kan fjernes med fine pincet og wolfram nåle efter fiksering for at give direkte adgang til reagenser til mesonephros. Lange sonder (større end 1 KB) kan have dårlig indtrængning af vævet, men de kan hydrolyseres i korte fragmenter (ca. 0,3 KB) for at forbedre indtrængning18. For sonder med svage signaler kan kontrolsonder med sansesekvensen bruges til at skelne mellem baggrunden og sondesignalet. Større dyr vil have en højere baggrund farvning af somitter (Figur 2C, pile). Dette kan dog minimeres med længere vasker af sonden og antistoffer.
Protokollen her kan også anvendes på dissekeret og isolerede væv og organer, såsom den voksne zebrafisk nyre12,19. Selv om der er offentliggjort beskrivelser af lignende protokoller9,16, ingen af dem beskriver hele processen fra opdræt larver til in situ hybridisering med dette detaljeringsniveau. Derfor giver denne metode et ekstra værktøj til at dechifrere udviklingen af hvirveldyr nyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Finansiering blev ydet af Pennsylvania Academy of Science, og Commonwealth of Pennsylvania biologer, og Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology, og Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). Den transgene Tg(lhx1a-EGFP) linje blev leveret af Dr. Neil Hukriede (University of Pittsburgh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al.
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
