Summary
De zebravis is een belangrijk model voor het begrijpen van de nierontwikkeling. Hier wordt een in situ hybridisatieprotocol geoptimaliseerd om genexpressie in zebravislarven en juvenielen te detecteren tijdens de ontwikkeling van mesonephros.
Abstract
De zebravis vormt tijdens zijn leven twee nierstructuren. De pronephros (embryonale nier) vormt zich tijdens de embryonale ontwikkeling en begint te functioneren op 2 dagen na de bevruchting. De pronephros bestaat uit slechts twee nefronen en dient als enige nier tijdens het larvale leven totdat er meer nierfunctie nodig is vanwege de toenemende lichaamsmassa. Om aan deze hogere vraag te voldoen, begint de mesonephros (volwassen nier) zich te vormen tijdens metamorfose. De nieuwe primaire nefronen versmelten met de pronephros en vormen verbonden lumen. Vervolgens fuseren secundaire nefronen met primaire (enzovoort) om een vertakkend netwerk in de mesonephros te creëren. Het overgrote deel van het onderzoek is gericht op de pronephros vanwege het gemak van het gebruik van embryo's. Er is dus behoefte aan het ontwikkelen van technieken om oudere en grotere larven en jonge vissen te bestuderen om de ontwikkeling van mesonephros beter te begrijpen. Hier is een in situ hybridisatieprotocol voor genexpressieanalyse geoptimaliseerd voor sondepenetratie, wassen van sondes en antilichamen en bleken van pigmenten om de mesonephros beter te visualiseren. De Tg(lhx1a-EGFP) transgene lijn wordt gebruikt om voorlopercellen en de distale tubuli van ontluikende nefronen te labelen. Dit protocol vult een leemte in mesonephros-onderzoek. Het is een cruciaal model om te begrijpen hoe nieuwe nierweefsels zich vormen en integreren met bestaande nefronen en inzichten bieden in regeneratieve therapieën.
Introduction
Het zebravisembryo is een belangrijk model voor het bestuderen van weefselontwikkeling vanwege zijn kleine omvang, transparantie, beschikbare hulpmiddelen en overleving zonder voeding gedurende maximaal vijf dagen1,2. Het heeft sterk bijgedragen aan het begrip van nierontwikkeling en het behoud tussen zebravissen en zoogdieren3,4,5. De nier speelt een essentiële rol bij het handhaven van vloeibare homeostase, het filteren van het bloed en het uitscheiden van afval6. Het nefron, de functionele eenheid van de nier, bestaat uit een bloedfilter dat is verbonden met een lange buis. Bij zebravissen vormen zich gedurende zijn hele leven twee nierstructuren. De pronephros (de tijdelijke embryonale nier) vormt zich het eerst tijdens de vroege ontwikkeling. Het bestaat uit twee nefronen die langs de voorste-achterste as lopen en wordt functioneel rond 2 dagen na de bevruchting (dpf). Het nut van de pronephros ligt in zijn eenvoud, met slechts twee nefronen die meestal lineair en gemakkelijk te visualiseren zijn (hoewel de proximale ingewikkelde tubulus begint te spoelen bij drie dpf)3. Dit heeft niet alleen studies van de vroege ontwikkeling van het intermediaire mesoderm vergemakkelijkt, maar ook het segmentatiepatroon en tubulusherstel7,8.
Het nut van zebravissen wordt beperkt na vijf dpf, wanneer de dooier wordt verminderd en de larven afhankelijk zijn van voeding in het aquatische systeem9. Op ongeveer 2 weken oud ondergaan de larven een metamorfose tot juvenielen, waarbij nieuwe weefsels ontstaan en oude weefsels verloren gaan en/of gereorganiseerd worden9. Dit is ook wanneer de mesonephros (de permanente volwassen nier) zich vormt10,11,12. Het eerste volwassen nefron vormt zich in de buurt van de zesde somiet en versmelt met de distale vroege tubulus van de pronephros. Extra nefronen worden in eerste instantie aan deze positie toegevoegd, maar later ook naar de voorste. De primaire nefronen in deze eerste golf fuseren met de tubuli van de pronephros en delen een gemeenschappelijk lumen om hun afval af te zetten. Secundaire nefronen vormen zich in de volgende golf en fuseren met primaire nefronen. Dit reiteratieve proces creëert een mesonephros die vertakt is, enigszins verwant aan de zoogdiernier. Vermoedelijk verliest de pronephros uiteindelijk zijn tubulusidentiteit en worden het twee grote verzamelkanalen waar alle nefronen hun afval afvoeren13.
Voorafgaand aan de vorming van het eerste volwassen nefron, beginnen enkelvoudige voorlopercellen te verschijnen in larven van ~ 4 mm (totale lengte) (~ 10 dpf). Deze cellen, die zijn gemarkeerd in de Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn, hechten zich aan de pronephros en lijken te migreren naar toekomstige plaatsen van nefroese. De afzonderlijke cellen smelten samen tot clusters, die differentiëren tot nieuwe nefronen12. Het is onduidelijk waar deze cellen zich bevinden of welke genen ze tot expressie brengen vóór het begin van mesonefogenese.
Inzicht in de ontwikkeling van mesonephros geeft inzicht in de nier van zoogdieren op manieren die de pronephros niet kunnen. Deze omvatten de vorming van nefrogene aggregaten uit cellen met één voorloper, functionele integratie van nieuwe nefronen met bestaande en vertakkende morfogenese. Er zijn echter beperkingen aan het bestuderen van postembryonische ontwikkeling. De larven zijn minder transparant vanwege hun grotere formaat en pigmentatie. De ontwikkelingstijdlijn loopt niet synchroon tussen individuele dieren en is sterk afhankelijk van omgevingsfactoren, zoals voeding en drukte9,14. Hoewel knockdown-reagentia bestaan, zijn ze minder effectief in larven in vergelijking met embryo's15. In dit protocol wordt een in situ hybridisatiemethode beschreven om genexpressie te bepalen tijdens de ontwikkeling van mesonephros van zebravissen. Verschillende stappen zijn geoptimaliseerd om de visualisatie van de mesonephros en de penetratie en het wassen van de sonde en het antilichaam te vergroten. De Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn wordt gebruikt samen met een sonde voor EGFP om enkele voorlopercellen, nefrogene aggregaten en de distale tubuli van ontluikende nefronen te labelen. Deze methode zal een dieper inzicht geven in de ontwikkeling van mesonephros en inzicht geven in regeneratieve therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van zebravislarven en juvenielen is goedgekeurd door de IUP IACUC (protocol #02-1920, #08-1920). Details van de inhoud van de oplossing worden vermeld in de tabel met materialen.
1. Larven grootbrengen
OPMERKING: Het duurt tot 21 dagen of langer om larven en juvenielen op te kweken tot het stadium van interesse.
- Stel volwassen zebravissen in om te paren door 1 mannetje en 1 vrouwtje toe te voegen in een paringstank in de late namiddag na hun laatste maaltijd.
OPMERKING: Niet alle visparen zullen paren. Begin met het instellen van 20 paren om de paringssnelheid te bepalen en dienovereenkomstig aan te passen in toekomstige experimenten. - De volgende dag nadat de vissen klaar zijn met paren (rond 13.00 uur), verzamelt u de embryo's met E3-medium in petriplaten.
- Zorg ervoor dat er niet meer dan 30 embryo's per plaat zijn.
- Verwijder vuil (zoals uitwerpselen) van de petriplaten en voeg 20 ml E3-medium toe.
- Incubeer bij 28,5 °C gedurende 1 dag.
- Zet de volwassen zebravis terug in het aquatische systeem.
- Vervang bij 1 dpf het E3 medium door verse E3.
- Incubeer bij 28,5 °C nog 4 dagen tot 5 dpf.
- Plaats een scherm van 400 μm in een tank van 2,8 liter en vul het met 2 cm systeemwater.
- Voeg de 5 dpf-larven van 1 bord toe (tot 30 totale larven).
- Plaats de tank in het aquatische systeem, maar start de waterstroom niet.
- Voer de larven twee keer per dag 4 ml poedervoer tot 14 dpf.
- Bij 6 dpf start je de waterstroom met 1 druppel per seconde.
OPMERKING: Controleer de waterstroom dagelijks en pas dienovereenkomstig aan. - Verhoog bij 8 dpf de waterstroom naar een langzame, gestage stroom.
- Voer bij 14 dpf levende pekelkreeftjes naast het poedervoer.
2. Dag 1 - 2: Larven fixeren
- Verwijder een tank met larven op het gewenste tijdstip.
- Vul een petriplaat met 20 ml systeemwater.
- Gebruik een fijnmazig net om de larven voorzichtig op te scheppen en naar het wateroppervlak te brengen.
- Snijd de punt van een transferpipet af om een bredere opening te geven en breng de larven over op de petriplaat. De grotere pipetmond zorgt voor de overdracht van meerdere kleine larven of een paar grotere tegelijk.
- Voeg 2 ml tricaïne (2%, pH 7 bouillon) toe om de larven te immobiliseren.
- Nadat de larven stoppen met bewegen, verwijdert u het grootste deel van het water en voegt u 10 ml tricaïne toe. Wacht 15 minuten tot de larven zijn geëuthanaseerd.
- Optioneel: Voor jonge exemplaren langer dan 8 mm, snijd de kop en staart af met een scheermesje (na euthanasie) onder een ontleedmicroscoop om de penetratie van de fixatieoplossing te verbeteren. Zorg ervoor dat u de totale lengte van elk dier registreert voordat u de kop en staart afsnijdt en elk dier in zijn eigen petriplaat isoleert. Raadpleeg stap 3 voor het meten van de dieren.
- Vervang de tricaïne door 20 ml fixatieoplossing (4% paraformaldehyde, 1% DMSO). Doe het deksel terug op de petriplaat en wieg langzaam in een zuurkast.
OPMERKING: Het is belangrijk om een schommelplatform te gebruiken. Een schuddend platform met een cirkelvormige beweging zorgt ervoor dat de dierlijke as krom wordt. Gebruik alleen verse (niet vooraf gemaakte bevroren) bevestigingsoplossing.
LET OP: De fixatieoplossing bevat paraformaldehyde, wat waarschijnlijk kankerverwekkend is. Gebruik de zuurkast (of masker) en handschoenen om het poeder te meten. - Vervang na 30 minuten de bevestigingsoplossing door een nieuwe bevestigingsoplossing.
- Verzamel de gebruikte bevestigingsoplossing in een aparte afvalcontainer voor een goede verwijdering.
- Breng de larven over in een buis van 50 ml met 25 ml verse fixatieoplossing.
- Zorg ervoor dat de dop strak zit en schommel langzaam bij 4 °C gedurende 2 dagen. Het is mogelijk om langer te incuberen voor het gemak.
3. Dag 3: Larven meten
- Vervang in een zuurkast de bevestigingsoplossing door 20 ml PBST.
- Breng de larven over in een petriplaatje.
- Leg een platte liniaal op een ontleedmicroscoop en leg de petriplaat op de liniaal.
- Gebruik een wimpermanipulator om elke larve op de liniaal te bewegen om de totale lengte te meten (van de snuit tot de punt van de staartvin) (figuur 1).
- Combineer verschillende larven van vergelijkbare lengtes (bijv. 5,0 mm en 5,1 mm) in één glazen injectieflacon van 5,5 ml, tot 10 larven per injectieflacon.
4. Dag 3 - 4: Uitdroging
- Vervang de PBST door 4 ml 100% methanol. Laat de injectieflacon gedurende 5 minuten op kamertemperatuur schommelen.
- Vervang de methanol door verse methanol en steen gedurende 5 min. Herhaal dit nog een keer.
- Bewaar de injectieflacon bij -20 °C gedurende 2 dagen. Het is mogelijk om langer te incuberen voor het gemak.
5. Dag 5: Rehydratatie
- Verwarm de injectieflacon tot kamertemperatuur.
- Vervang de methanol door 4 ml 75% methanol/25% PBST. Schommel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Vervang de oplossing in stap 5.2 door 4 ml 50% methanol/50% PBST en steen gedurende 5 minuten.
- Vervang de oplossing in stap 5.3 door 4 ml 25% methanol/75% PBST en steen gedurende 5 minuten.
- Vervang de oplossing in stap 5.4 door 4 ml PBST en rock gedurende 10 minuten.
- Vervang de PBST door 4 ml verse PBST en steen gedurende 10 minuten. Herhaal dit nog een keer.
6. Dag 5: Proteinase K digest
- Vervang de PBST door 2 ml van de proteïnase K-oplossing (20 μg/ml, 1% DMSO-eindconcentratie in PBST) en rock bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Larven langer dan 6 mm hebben een langere incubatietijd en/of een hogere proteïnase K-concentratie nodig. De exacte tijd en concentratie zal empirisch bepaald moeten worden. Begin met een toename van de incubatietijd met 10 minuten voor elke 0,5 mm langer dan 6 mm. - Vervang de proteïnase K-oplossing door 4 ml PBST en steen gedurende 10 minuten.
- Vervang de PBST door 4 ml verse PBST en steen gedurende 10 minuten. Herhaal dit nog een keer.
- Vervang de PBST door 4 ml verse bevestigingsoplossing en rock gedurende 1 uur. Het is mogelijk om langer te incuberen bij 4 °C voor het gemak.
7. Dag 5: Bleken
- Vervang de bevestigingsoplossing door 4 ml PBST en rock bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Vervang de PBST door 4 ml verse PBST en steen gedurende 10 minuten. Herhaal dit nog een keer.
- Breng de larven over naar een 6-well plaat (maximaal 10 larven per put).
- Vervang de PBST door 3 ml verse bleekoplossing.
- Rock bij kamertemperatuur en controleer de pigmentatie elke 5 minuten onder een ontleedmicroscoop. Zoek naar het verdwijnen van pigmentatie langs de mesonephros (dorsaal naar de zwemblaas en darm).
OPMERKING: Voor larven tot 6 mm lang duurt het tot 20 minuten om de pigmentatie rond de mesonephros te bleken. Bleek niet langer dan nodig is om de integriteit van de larven te behouden. - Breng de larven terug in een glazen injectieflacon.
- Vervang de bleekoplossing door 4 ml PBST. Rock voor 10 min.
- Vervang de PBST door 4 ml verse PBST en steen gedurende 10 minuten. Herhaal dit nog een keer.
- Vervang de PBST door 4 ml verse bevestigingsoplossing en rock gedurende 1 uur. Het is mogelijk om langer te incuberen bij 4 °C voor het gemak.
8. Dag 5: Prehybridisatie
OPMERKING: Voor stappen bij 70 °C is het belangrijk om snel te werken om de afkoeling van de injectieflacon tot een minimum te beperken.
- Vervang de bevestigingsoplossing door 4 ml PBST en rock bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Vervang de PBST door 4 ml verse PBST en steen gedurende 10 minuten. Herhaal dit nog een keer.
- Vervang de PBST door 4 ml van de Hyb-oplossing en rock gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
LET OP: De Hyb-, Hyb+- en sondeoplossingen bevatten formamide, dat de huid kan irriteren. Gebruik handschoenen om met deze oplossingen om te gaan. - Vervang de Hyb- door 4 ml verse Hyb- en rock gedurende 10 min. Herhaal dit nog een keer.
- Verzamel de gebruikte Hyb-, Hyb+- en sondeoplossingen in een aparte afvalcontainer voor een goede verwijdering.
- Vervang de Hyb- door 4 ml van de Hyb+ oplossing.
- Incubeer de injectieflacon 's nachts bij 70 °C.
- Verdun de EGFP-fluoresceïnesonde 1:100 in 500 μL Hyb+ en incubeer deze O/N bij 70 °C.
OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant voor sondesynthese.
9. Dag 6: Probe hybridisatie
- Vervang de Hyb+-oplossing in de injectieflacon door de voorverwarmde sonde en incubeer 's nachts bij 70 °C.
OPMERKING: Larven langer dan 6 mm hebben 2 dagen incubatie nodig. - Verwarm de wasbuffer, 2x SSCT en 0,2x SSCT-oplossingen 's nachts voor op 70 °C.
10. Dag 7: Sonde wassen
- Vervang de sonde door 4 ml van de voorverwarmde wasbuffer en incubeer bij 70 °C gedurende 30 minuten.
- Verzamel de gebruikte sonde in een aparte afvalcontainer voor een goede verwijdering.
- Vervang de wasbuffer door 4 ml verse wasbuffer en incubeer bij 70 °C gedurende 30 minuten.
- Vervang de wasbuffer door 4 ml van de voorverwarmde 2x SSCT-oplossing en incubeer deze gedurende 15 minuten bij 70 °C.
- Voeg 50 ml voorverwarmde 0,2x SSCT toe aan een buis van 50 ml.
- Plaats een celzeef (100 μm) in de bovenkant van de buis. Zorg ervoor dat de celzeef helemaal naar beneden wordt geduwd totdat deze stopt.
- Breng de larven van de glazen injectieflacon over in de celzeef. Zorg ervoor dat de larven in de buffer worden ondergedompeld en incubateer bij 70 °C gedurende 2 uur.
- Bereid een nieuwe buis voor met 50 ml voorverwarmd 0,2x SSCT.
- Breng de celzeef van stap 10.4.2 over in de nieuwe buis van 0,2x SSCT en incubeer bij 70 °C gedurende 2 uur.
- Herhaal stap 10.5 nog een keer.
11. Dag 7: Blokkeren
- Breng de larven over naar een nieuwe glazen injectieflacon en koel af tot kamertemperatuur.
- Vervang de 0,2x SSCT door 4 ml van 67% 0,2x SSCT/33% MABT en rock bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Vervang de oplossing in stap 11.2 door 4 ml van 33% 0,2x SSCT/67% MABT en rock gedurende 10 minuten.
- Vervang de oplossing in stap 11.3 door 4 ml MABT en rock gedurende 10 minuten.
- Vervang de MABT door 4 ml verse MABT en steen gedurende 10 minuten. Herhaal dit nog een keer.
- Vervang de MABT door 4 ml van de blokkerende oplossing en incubeer 's nachts bij 4 °C. Het is mogelijk om langer te incuberen voor het gemak.
12. Dag 8 - 9: Antilichaam incubatie
- Verdun het antifluoresceïne-antilichaam 1:5.000 in een blokkerende oplossing van 500 μL.
- Vervang de blokkerende oplossing door de antilichaamoplossing en incubeer bij 4 °C gedurende 2 dagen. Het is mogelijk om langer te incuberen voor het gemak.
- Draai de injectieflacon twee keer per dag om de larven te roeren.
OPMERKING: Larven langer dan 6 mm hebben nog 1-2 dagen incubatie nodig.
- Draai de injectieflacon twee keer per dag om de larven te roeren.
13. Dag 10 - 11: Antilichaam wassen
- Vervang de antilichaamoplossing door 4 ml PBST en steen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Vervang de PBST door 4 ml verse PBST en steen gedurende 10 minuten. Herhaal dit nog een keer.
- Breng de larven over in een buis van 50 ml.
- Voeg 40 ml PBST2 toe. Leg de buis op zijn kant en schommel 's nachts op 4 °C.
- Vervang de PBST2 door 40 ml verse PBST2 en steen 's nachts bij 4 °C. Het is mogelijk om langer te incuberen voor het gemak.
OPMERKING: Larven langer dan 6 mm hebben nog 1-2 dagen wassen nodig.
14. Dag 12: Vlekken
- Breng de larven over op een 6-well plaat.
- Vervang de PBST2 door 3 ml vlekbuffer en steen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Vervang de kleurbuffer door 3 ml verse kleuringsbuffer en steen gedurende 5 minuten. Herhaal dit nog een keer.
- Vervang de kleuringsbuffer door 3 ml van de kleuringsoplossing. Dek af met aluminiumfolie en controleer de vlekken de komende uren.
- Voor sondes met een zwak signaal, incubeer bij 4 °C 's nachts en vervang de kleuringsoplossing eenmaal tussendoor door een nieuwe kleuringsoplossing.
- Wanneer de gewenste kleurintensiteit is bereikt, vervangt u de kleuringsoplossing door 3 ml van de stopoplossing en rockt u gedurende 30 minuten.
- Vervang de stopoplossing door 3 ml verse stopoplossing en rock gedurende 30 minuten. Herhaal dit nog een keer.
- Breng de larven over naar een nieuwe glazen injectieflacon en vervang de stopoplossing door 4 ml verse bevestigingsoplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Het is mogelijk om langer te incuberen bij 4 °C voor het gemak.
- Bewaar de larven in de fixatieoplossing in het donker bij 4 °C gedurende maximaal een jaar.
15. Dag 12: Beeldvorming
- Vervang de bevestigingsoplossing door 4 ml PBST en rock bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Breng de larven over op een 6-well plaat.
- Vervang de PBST door 4 ml verse PBST en steen gedurende 10 minuten. Herhaal dit nog een keer.
- Vervang de PBST door 3 ml 50% glycerol (in PBST) en rock gedurende 10 minuten.
- Vervang de oplossing in stap 15.4 door 3 ml 100% glycerol zonder te schommelen gedurende 10 minuten.
- Gebruik een ontleedmicroscoop om de larven direct in de 6-putplaat in beeld te brengen of breng de larven over in een depressieglaasje naar beeld onder een samengestelde microscoop. Gebruik een wimpermanipulator om de larven te oriënteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn werd aangetoond dat dit in situ hybridisatieprotocol effectief is in het labelen van niervoorlopercellen en verschillende nefronstructuren tijdens de ontwikkeling van mesonephros. Zoals verwacht is het centrale zenuwstelsel ook gelabeld in deze transgene lijn (niet weergegeven). Het initiële mesonefrische nefron vormt zich op ongeveer 5,2 mm, dorsaal aan de pronephros (figuur 2A), en de distale tubulus van dit nefron wordt gelabeld door EGFP10,12. Voorloperclusters zijn in dit stadium en later aanwezig (figuur 2A-B, pijlpunten) en ook enkele voorlopercellen zijn gelabeld (figuur 2C). Deze methode biedt een extra hulpmiddel bij het bestuderen van de nierontwikkeling en helpt licht te werpen op het begrijpen van de menselijke nier.
Figuur 1: Larven meten. Vaste larven in een petriplaat worden bovenop een platte liniaal geplaatst. Onder een ontleedmicroscoop worden de larven gemeten en gescheiden door groepen van vergelijkbare grootte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Mesonephros ontwikkeling. Bij ongeveer 5,2 mm in de Tg(lhx1a-EGFP) transgene lijn wordt het eerste mesonefrische nefron gevormd dorsaal tot pronephros en zwemblaas (SB) (A). Clusters van voorlopercellen zijn aanwezig tijdens de ontwikkeling van mesonephros (A-B, pijlpunten) naast enkele voorlopercellen (C, haak). Bij grotere juvenielen kan achtergrondkleuring optreden in de somites (C, pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven in situ hybridisatiemethode is gericht op het bestuderen van de ontwikkeling van mesonephros. Het kan echter worden toegepast om de ontwikkeling van andere weefsels en organen tijdens metamorfose te bestuderen, zoals de darm, het zenuwstelsel, schubben en pigmentatie14. Probes kunnen worden gegenereerd voor endogene genen of fluorescerende markers in transgene lijnen.
Het is van cruciaal belang dat de larven intact blijven om de organen en weefsels in hun oorspronkelijke context te observeren. Om de weefselintegriteit te behouden, is het belangrijk om de tijd van proteïnase K-behandeling te minimaliseren. Het is belangrijk om de beste behandelingstijd voor elke nieuwe partij enzym te bepalen. Als alternatief kan aceton worden gebruikt in plaats van proteïnase K voor verbeterde weefselintegriteit16. Overmatig bleken vermindert ook de weefselintegriteit. Minimaal bleken en de ogen wat pigmentatie laten behouden, helpen bij het visualiseren van de larven tijdens het wassen. Het is gebruikelijk dat de ogen afvallen tijdens de hybridisatiestap, wat een indicator is van weefselfragiliteit. Het gebruik van DMSO met de fixatie- en proteïnase K-oplossing is cruciaal voor weefselpenetratie17.
Een beperking van deze methode is de slechte penetratie van reagentia bij grotere dieren. Om de penetratie te verbeteren, kunnen de kop en staart vóór de fixatie met een scheermesje worden verwijderd17. De darm kan na fixatie worden verwijderd met een fijn pincet en wolfraamnaalden om directe toegang van de reagentia tot de mesonephros mogelijk te maken. Lange sondes (groter dan 1 KB) kunnen een slechte penetratie van het weefsel hebben, maar ze kunnen worden gehydrolyseerd in korte fragmenten (ongeveer 0,3 KB) om de penetratie te verbeteren18. Voor sondes met zwakke signalen kunnen besturingssondes met de zintuigvolgorde worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de achtergrond en het sondesignaal. Grotere dieren hebben een hogere achtergrondkleuring van de somites (figuur 2C, pijlen). Dit kan echter worden geminimaliseerd met langere wasbeurten van de sonde en antilichamen.
Het protocol kan hier ook worden toegepast op ontleedde en geïsoleerde weefsels en organen, zoals de volwassen zebravisnier12,19. Hoewel er gepubliceerde beschrijvingen zijn van vergelijkbare protocollen9,16, beschrijft geen van hen het hele proces van het fokken van larven tot in situ hybridisatie met dit detailniveau. Daarom biedt deze methode een extra hulpmiddel bij het ontcijferen van de ontwikkeling van de gewervelde nier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Financiering werd verstrekt door de Pennsylvania Academy of Science, en het Gemenebest van Pennsylvania Biologen, en de Indiana University of Pennsylvania (School of Graduate Studies and Research, Department of Biology, en het Cynthia Sushak Undergraduate Biology Fund for Excellence). De Tg (lhx1a-EGFP) transgene lijn werd geleverd door Dr. Neil Hukriede (Universiteit van Pittsburgh).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al.
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
