Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62930
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University of Pennsylvania

Summary

דג הזברה הוא מודל חשוב להבנת התפתחות הכליות. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום מותאם כדי לזהות ביטוי גנים בזחלי דגי זברה וצעירים במהלך פיתוח mesonephros.

Abstract

דג הזברה יוצר שני מבני כליות בחייו. הנוטה (כליה עוברית) נוצרת במהלך התפתחות עוברית ומתחילה לתפקד ביומיים לאחר ההפריה. המורכב משני נפרונים בלבד, הנוטה משמשת ככליה היחידה במהלך חיי הזחל עד שנדרשת תפקוד כליות נוסף בשל מסת הגוף ההולכת וגדלה. כדי להתמודד עם דרישה גבוהה זו, mesonephros (כליה בוגרת) מתחיל להיווצר במהלך מטמורפוזה. הנפרונים הראשיים החדשים מתמזגים לנוודים ויוצרים לומן מחובר. לאחר מכן, נפרונים משניים מתמזגים לראשונים (וכן הלאה) כדי ליצור רשת הסתעפות במסונפרוס. הרוב המכריע של המחקר מתמקד נוטה בשל הקלות של שימוש בעוברים. לכן, יש צורך לפתח טכניקות ללמוד זחלים מבוגרים וגדולים יותר ודגים צעירים כדי להבין טוב יותר את התפתחות mesonephros. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום לניתוח ביטוי גנים מותאם לחדירת בדיקה, שטיפת בדיקות ונוגדנים, והלבנת פיגמנטים כדי לדמיין טוב יותר את mesonephros. הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP) משמש לתיוג תאי אבות ואת הצינורות הדיסטליים של נפרונים המתהווים. פרוטוקול זה ממלא פער במחקר mesonephros. זהו מודל חיוני להבנת האופן שבו רקמות כליות חדשות נוצרות ומשתלבות עם נפרונים קיימים ומספקות תובנות על טיפולים רגנרטיביים.

Introduction

עובר דג הזברה הוא מודל חשוב לחקר התפתחות הרקמות בשל גודלו הקטן, השקיפות, הכלים הזמינים וההישרדות שלו ללא הזנה עד חמישה ימים1,2. היא תרמה רבות להבנת התפתחות הכליות ולשימור בין דגי זברה ליונקים3,4,5. הכליה ממלאת תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס נוזלי, סינון הדם והפרשת פסולת6. הנפרון, היחידה התפקודית של הכליה, כולל מסנן דם המחובר לצינור ארוך. בדגי זברה נוצרים שני מבני כליות לאורך כל חייו. הנוטה (הכליה העוברית הזמנית) נוצרת תחילה במהלך ההתפתחות המוקדמת. הוא מורכב משני נפרונים רצים לאורך הציר הקדמי-אחורי והופך לפונקציונלי בסביבות 2 ימים לאחר ההפריה (dpf). התועלת של הנוטה טמונה בפשטות שלה, שיש רק שני נפרונים כי הם בעיקר ליניארי וקל לדמיין (אם כי הצינור המפותל הפרוקסימלי מתחיל סליל בשלושה dpf)3. זה הקל לא רק על מחקרים על התפתחותה המוקדמת מן mesoderm הביניים, אלא גם את דפוס פילוח ותיקון צינורית7,8.

התועלת של דגי זברה מוגבלת לאחר חמישה dpf, כאשר החלמון פוחת והזחלים מסתמכים על האכלה במערכת הימית9. בסביבות 2 שבועות, הזחלים עוברים מטמורפוזה לקטינים, שם נוצרות רקמות חדשות ורקמות ישנות אובדות ו/או מאורגנות מחדש9. זה גם כאשר mesonephros (הכליה הבוגרת הקבועה) יוצר10,11,12. הנפרון הבוגר הראשון נוצר ליד הסומיט השישי, ומתמזג עם הצינורית המוקדמת הדיסטלית של הנוגים. נפרונים נוספים מתווספים אחוריים לעמדה זו בתחילה, אך גם לכיוון הקדמי בהמשך. הנפרונים העיקריים בגל הראשון מתמזגים לצינורות של הנוטים וחולקים לומן משותף להפקיד את הפסולת שלהם. נפרונים משניים נוצרים בגל הבא ומתמזגים לנפרונים ראשיים. תהליך חוזר זה יוצר מסונפרוס המסתעף, דומה במקצת לכליות היונקים. ככל הנראה, הנוטה בסופו של דבר מאבדת את זהות הצינור שלה והופכת לשני צינורות איסוף עיקריים שבהם כל הנפרונים מרוקנים את הפסולת שלהם13.

לפני היווצרותו של הנפרון הבוגר הראשון, תאי אבות יחידים מתחילים להופיע בזחלים ~4 מ"מ (אורך כולל) (~ 10 dpf). תאים אלה, המסומנים בקו מהונדס Tg(lhx1a-EGFP), לדבוק נוטה ונדמה להעביר לאתרים עתידיים של נפרוגנזה. התאים הבודדים מתמזגים לאשכולות, המבדילים לנפרונים חדשים12. לא ברור היכן תאים אלה שוכנים או אילו גנים הם מבטאים לפני תחילתו של mesonephrogenesis.

הבנת התפתחות מסונפרוס מספקת תובנות על כליות היונקים בדרכים שהנואפרוסים אינם יכולים. אלה כוללים היווצרות של אגרגטים נפרוגניים מתאי אבות יחידים, שילוב פונקציונלי של נפרונים חדשים עם קיימים, ומורפוגנזה מסתעפת. עם זאת, ישנן מגבלות לחקר התפתחות פוסט-מבריונית. הזחלים פחות שקופים בשל גודלם הגדול יותר ויש להם פיגמנטציה. ציר הזמן ההתפתחותי אינו סינכרוני בין בעלי חיים בודדים ותלוי מאוד בגורמים סביבתיים, כגון האכלה וצפיפות 9,14. למרות ריאגנטים נוקאאוט קיימים, הם פחות יעילים בזחלים לעומת עוברים15. בפרוטוקול זה, מתוארת שיטת הכלאה במקום לקביעת ביטוי גנים במהלך התפתחות mesonephros של דגי זברה. מספר שלבים מותאמים להגברת ההדמיה של mesonephros וחדירה ושטיפה של הבדיקה ואת הנוגדן. הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP) משמש יחד עם בדיקה עבור EGFP כדי לתייג תאים יחידים של אבות, אגרגטים נפרוגניים, ואת צינורות דיסטליים של נפרונים המתהווה. שיטה זו תספק הבנה עמוקה יותר של התפתחות mesonephros ותובנה על טיפולים רגנרטיביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש בזחלי דגי זברה וצעירים מאושר על ידי IUP IACUC (פרוטוקול #02-1920, #08-1920). פרטי תוכן הפתרון מפורטים ברשימת החומרים.

1. גידול זחלים

הערה: זה ייקח עד 21 ימים או יותר כדי להעלות זחלים וצעירים לשלב של עניין.

  1. הקימו דגי זברה בוגרים להזדווג על ידי הוספת דג זכר אחד ונקבה במיכל הזדווגות בשעות אחר הצהריים המאוחרות לאחר הארוחה האחרונה שלהם.
    הערה: לא כל זוגות הדגים יתזדווגו. התחל על ידי הגדרת 20 זוגות כדי לקבוע את קצב ההזדווגות ולהתאים בהתאם בניסויים עתידיים.
  2. למחרת לאחר שהדגים סיימו להזדווג (בסביבות השעה 13:00), אוספים את העוברים עם בינוני E3 בצלחות פטרי.
    1. ודא כי אין יותר מ 30 עוברים לכל צלחת.
    2. הסר פסולת (כגון צואה) מלוחות פטרי ולהוסיף 20 מ"ל של בינוני E3.
    3. דגירה ב 28 °C (5 °F) ליום אחד.
  3. תחזיר את דג הזברה הבוגר למערכת הימית.
  4. ב 1 dpf, להחליף את המדיום E3 עם E3 טרי.
    1. דגירה ב 28 °C (5 °F) במשך 4 ימים נוספים עד 5 dpf.
  5. שים מסך 400 מיקרומטר במיכל 2.8 L ולמלא אותו עם 2 ס"מ של מי מערכת.
    1. מוסיפים את 5 זחלי dpf מצלחת אחת (עד 30 זחלים סה"כ).
    2. שים את המיכל במערכת הימית, אבל לא להתחיל את זרימת המים.
  6. להאכיל את הזחלים 4 מ"ל של אבקת מזון פעמיים ביום עד 14 dpf.
  7. ב 6 dpf, להתחיל את זרימת המים ב 1 טפטוף לשנייה.
    הערה: בדוק את זרימת המים מדי יום ולהתאים בהתאם.
  8. בשעה 8 dpf, להגביר את זרימת המים לזרם איטי ויציב.
  9. ב 14 dpf, להאכיל שרימפס מי מלח חי בנוסף אבקת מזון.

2. יום 1 - 2: תיקון זחלים

  1. הסר מיכל של זחלים בנקודת הזמן הרצויה.
  2. מלא צלחת פטרי עם 20 מ"ל של מי מערכת.
  3. השתמשו ברשת רשת עדינה כדי לגרוף בעדינות את הזחלים ולהביא אותם אל פני המים.
    1. חותכים את קצה פיפטת ההעברה כדי לתת פתח רחב יותר ולהעביר את הזחלים לצלחת פטרי. הפה גדול יותר פיפטה מאפשר העברה של כמה זחלים קטנים או כמה גדולים בבת אחת.
  4. הוסף 2 מ"ל של טריקאין (2%, מניית pH 7) כדי לשתק את הזחלים.
    1. לאחר הזחלים להפסיק לנוע, להסיר את רוב המים ולהוסיף 10 מ"ל של tricaine. המתן 15 דקות עד שהזחלים יומתו.
    2. אופציונלי: עבור קטינים שאורכם עולה על 8 מ"מ, חתוך את הראשים והזנבות עם סכין גילוח (לאחר המתת חסד) תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לשפר את החדירה של פתרון התיקון. הקפד לתעד את האורך הכולל של כל חיה לפני חיתוך הראש והזנב ולבודד כל אחד בצלחת פטרי משלו. עיין בשלב 3 למדידת בעלי החיים.
  5. החלף את הטריקיין בפתרון תיקון של 20 מ"ל (4% paraformaldehyde, 1% DMSO). החזירו את המכסה לצלחת הפטרי ותתנדנדו לאט במכסה אדים.
    הערה: חשוב להשתמש בפלטפורמת נדנדה. פלטפורמה רועדת עם תנועה מעגלית תגרום לציר החי להיות מעוקל. יש להשתמש רק בתמיסת תיקון טרייה (לא קפואה מראש).
    זהירות: פתרון התיקון מכיל paraformaldehyde, שהוא מסרטן סביר. השתמש מכסה המנוע אדים (או מסכה) וכפפות כדי למדוד את האבקה.
  6. לאחר 30 דקות, החלף את פתרון התיקון בפתרון תיקון טרי.
    1. לאסוף את פתרון התיקון המשומש במיכל פסולת נפרד לסילוק נאות.
    2. העבר את הזחלים לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של פתרון תיקון טרי.
    3. ודא את הכובע הוא חזק רוק לאט ב 4 °C (5 °F) במשך 2 ימים. ניתן לדגור זמן רב יותר לנוחות.

3. יום 3: מדידת זחלים

  1. במכסה המנוע אדים, להחליף את פתרון התיקון עם 20 מ"ל של PBST.
  2. מעבירים את הזחלים לצלחת פטרי.
  3. שים סרגל שטוח על מיקרוסקופ ניתוח ולשים את צלחת פטרי על גבי הסרגל.
  4. השתמשו במניפולטור ריסים כדי להזיז כל זחל אל הסרגל כדי למדוד את אורכו הכולל (מהחוט ועד קצה סנפיר התדהמה) (איור 1).
  5. שלבו מספר זחלים באורכים דומים (למשל, 5.0 מ"מ ו-5.1 מ"מ) ל בקבוקון זכוכית אחד של 5.5 מ"ל, עד 10 זחלים ל בקבוקון.

4. יום 3 – 4: התייבשות

  1. החלף את PBST עם 4 מ"ל של 100% מתנול. רוק את המשחקון במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. החליפו את המתנול במתנול טרי וסלע למשך 5 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  3. לאחסן את המשחקון ב -20 °C (50 °F) במשך יומיים. ניתן לדגור זמן רב יותר לנוחות.

5. יום 5: התייבשות

  1. מחממים את הקרבון לטמפרטורת החדר.
  2. החלף את המתנול עם 4 מ"ל של 75% מתנול / 25% PBST. רוק במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. החלף את הפתרון בשלב 5.2 עם 4 מ"ל של 50% מתנול / 50% PBST וסלע במשך 5 דקות.
  4. החלף את הפתרון בשלב 5.3 עם 4 מ"ל של 25% מתנול / 75% PBST וסלע במשך 5 דקות.
  5. החלף את הפתרון בשלב 5.4 עם PBST 4 מ"ל וסלע במשך 10 דקות.
  6. החלף את PBST עם 4 מ"ל של PBST טרי וסלע במשך 10 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.

6. יום 5: תקציר פרוטאינאז K

  1. החלף את PBST עם 2 מ"ל של תמיסת חלבון K (20 מיקרוגרם / מ"ל, 1% DMSO ריכוז סופי PBST) וסלע בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    הערה: זחלים ארוכים מ-6 מ"מ יזדקקו לזמן דגירה ארוך יותר ו/או לריכוז גבוה יותר של חלבון K. הזמן והריכוז המדויקים יצטרכו להיקבע אמפירית. התחל עם עלייה של 10 דקות בזמן הדגירה על כל 0.5 מ"מ יותר מ 6 מ"מ.
  2. החלף את תמיסת Proteinase K עם 4 מ"ל של PBST וסלע במשך 10 דקות.
  3. החלף את PBST עם 4 מ"ל של PBST טרי וסלע במשך 10 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  4. החלף את PBST עם 4 מ"ל של פתרון תיקון טרי וסלע עבור 1 שעה. ניתן לדגור יותר ב 4 °C (5 °F) לנוחות.

7. יום 5: הלבנת

  1. החלף את פתרון התיקון עם 4 מ"ל של PBST וסלע בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  2. החלף את PBST עם 4 מ"ל של PBST טרי וסלע במשך 10 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  3. מעבירים את הזחלים לצלחת של 6 בארות (עד 10 זחלים לבאר).
  4. החלף את PBST עם 3 מ"ל של פתרון להלבנה טרי.
  5. מתנדנדים בטמפרטורת החדר ומנטרים את הפיגמנטציה תחת מיקרוסקופ מנתח כל 5 דקות. חפשו את היעלמות הפיגמנטציה לאורך מסונפרוס (גב לשלפוחית השחייה ולמעיים).
    הערה: עבור זחלים באורך של עד 6 מ"מ, ייקח עד 20 דקות להלבין את הפיגמנטציה המקיפה את המזונפרוס. אין להלבין זמן רב מהנדרש כדי לשמור על שלמות הזחלים.
  6. מעבירים את הזחלים בחזרה ל בקבוקון זכוכית.
  7. החלף את פתרון ההלבנה ב- 4 מ"ל של PBST. רוק במשך 10 דקות.
  8. החלף את PBST עם 4 מ"ל של PBST טרי וסלע במשך 10 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  9. החלף את PBST עם 4 מ"ל של פתרון תיקון טרי וסלע עבור 1 שעה. ניתן לדגור יותר ב 4 °C (5 °F) לנוחות.

8. יום 5: פרה-ברינדיזציה

הערה: עבור שלבים שבוצעו ב 70 °C (70 °F), חשוב לעבוד במהירות כדי למזער את קירור המשחקון.

  1. החלף את פתרון התיקון עם 4 מ"ל של PBST וסלע בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  2. החלף את PBST עם 4 מ"ל של PBST טרי וסלע במשך 10 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  3. החלף את PBST עם 4 מ"ל של פתרון Hyb, וסלע בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    זהירות: פתרונות Hyb-, Hyb+, ו- probe מכילים פורממיד, אשר יכול לגרות את העור. השתמש בכפפות כדי לטפל בפתרונות אלה.
  4. החליפו את ה- Hyb - ב-4 מ"ל של הייב טרי וסלע למשך 10 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
    1. לאסוף את פתרונות Hyb-, Hyb+, ולבדוק במיכל פסולת נפרד לסילוק נאות.
  5. החלף את ה- Hyb ב- 4 מ"ל של פתרון Hyb+ .
  6. לדגור את המשחקון ב 70 °C (70 °F) לילה.
  7. לדלל את גשושית EGFP-פלואורסצ'ין 1:100 ב 500 μL של Hyb + ולדגירה אותו O / N ב 70 °C (70 °F).
    הערה: בצע את הוראות היצרן עבור סינתזה בדיקה.

9. יום 6: הכלאה בדיקה

  1. החלף את תמיסת Hyb+ בבקריאל עם בדיקה מחומם מראש ודגורה ב 70 °C (70 °F) לילה.
    הערה: זחלים ארוכים מ 6 מ"מ צריך 2 ימים של דגירה.
  2. מחממים מראש את מאגר הכביסה, 2X SSCT ופתרונות SSCT 0.2x ב- 70 °C (70 °F) למשך הלילה.

10. יום 7: שטיפת גשוש

  1. החלף את הבדיקה עם 4 מ"ל של חוצץ לשטוף מחומם מראש ודגורה ב 70 °C (70 °F) במשך 30 דקות.
    1. לאסוף את הבדיקה המשמשת במיכל פסולת נפרד לסילוק נאות.
  2. החלף את חוצץ לשטוף עם 4 מ"ל של חוצץ לשטוף טרי ודגורה ב 70 °C (70 °F) במשך 30 דקות.
  3. החלף את מאגר לשטוף עם 4 מ"ל של פתרון SSCT 2x מחומם מראש ודגרה אותו ב 70 °C (70 °F) במשך 15 דקות.
  4. הוסף 50 מ"ל של SSCT 0.2x מחומם מראש לתוך צינור 50 מ"ל.
    1. הכנס מסננת תא (100 מיקרומטר) לחלק העליון של הצינור. ודא כי מסננת התא נדחף כל הדרך למטה עד שהוא מפסיק.
    2. מעבירים את הזחלים מ בקבוקון הזכוכית למסננת התא. ודא כי הזחלים שקועים במאגר ודגרה ב 70 °C (70 °F) במשך 2 שעות.
  5. הכן צינור חדש המכיל 50 מ"ל של SSCT מחומם מראש 0.2x.
    1. העבר את מסננת התאים בשלב 10.4.2 לתוך הצינור החדש של 0.2x SSCT ודגרה ב 70 °C (70 °F) במשך 2 שעות.
    2. חזור על שלב 10.5 פעם נוספת.

11. יום 7: חסימה

  1. מעבירים את הזחלים ל בקבוקון זכוכית חדש ומצננים לטמפרטורת החדר.
  2. החלף את ה- SSCT 0.2x עם 4 מ"ל של 67% SSCT / 33% MABT וסלע בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  3. החלף את הפתרון בשלב 11.2 עם 4 מ"ל של 33% 0.2x SSCT / 67% MABT וסלע במשך 10 דקות.
  4. החלף את הפתרון בשלב 11.3 עם 4 מ"ל של MABT וסלע במשך 10 דקות.
  5. החלף את MABT עם 4 מ"ל של MABT טרי וסלע במשך 10 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  6. החלף את MABT עם 4 מ"ל של פתרון חסימה ודגורה ב 4 °C (5 °F) לילה. ניתן לדגור זמן רב יותר לנוחות.

12. יום 8 – 9: דגירה נוגדנים

  1. לדלל את נוגדן אנטי פלואורסצ'ין 1:5,000 ב 500 פתרון חסימת μL.
  2. החלף את פתרון החסימה עם פתרון הנוגדנים ודגרה ב 4 °C (50 °F) במשך 2 ימים. ניתן לדגור זמן רב יותר לנוחות.
    1. מערבבים את הנקניקיון פעמיים ביום כדי להרגיז את הזחלים.
      הערה: זחלים ארוכים יותר מ 6 מ"מ צריך 1-2 ימים נוספים של דגירה.

13. יום 10 - 11: שטיפת נוגדנים

  1. החלף את פתרון הנוגדנים עם 4 מ"ל של PBST וסלע בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  2. החלף את PBST עם 4 מ"ל של PBST טרי וסלע במשך 10 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  3. מעבירים את הזחלים לצינור 50 מ"ל.
  4. הוסף 40 מ"ל של PBST2. מניחים את הצינור על צדו ומטלטלים ב 4 מעלות צלזיוס בלילה.
  5. החלף את PBST2 עם 40 מ"ל של PBST2 טרי וסלע ב 4 °C (55 °F) לילה. ניתן לדגור זמן רב יותר לנוחות.
    הערה: זחלים ארוכים מ-6 מ"מ זקוקים ל-1-2 ימים נוספים של כביסה.

14. יום 12: כתמים

  1. מעבירים את הזחלים לצלחת של 6 בארות.
  2. החלף את PBST2 עם 3 מ"ל של חיץ כתמים וסלע בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  3. החלף את חוצץ הכתמים עם 3 מ"ל של חיץ כתמים טרי וסלע במשך 5 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  4. החלף את מאגר הכתמים ב- 3 מ"ל של תמיסה הכתימה. מכסים בנייר אלומיניום ומנטרים את הכתמים בשעות הקרובות.
    1. עבור בדיקות עם אות חלש, לדגור ב 4 °C (4 °F) לילה ולהחליף את פתרון הכתמים עם פתרון כתמים טרי פעם אחת בין לבין.
  5. כאשר עוצמת הכתמים הרצויה מגיעה, החליפו את תמיסת הכתמים ב-3 מ"ל של פתרון העצירה והסלע למשך 30 דקות.
  6. החלף את פתרון העצירה עם 3 מ"ל של פתרון עצירה טרי וסלע במשך 30 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  7. מעבירים את הזחלים ל בקבוקון זכוכית חדשים ומחליפים את פתרון העצירה ב-4 מ"ל של פתרון תיקון טרי ודגרה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. ניתן לדגור יותר ב 4 °C (5 °F) לנוחות.
  8. יש לאחסן את הזחלים בתמיסת התיקון בחושך ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שנה.

15. יום 12: הדמיה

  1. החלף את פתרון התיקון עם 4 מ"ל של PBST וסלע בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  2. מעבירים את הזחלים לצלחת של 6 בארות.
  3. החלף את PBST עם 4 מ"ל של PBST טרי וסלע במשך 10 דקות. חזור על הפעולה עוד פעם אחת.
  4. החלף את PBST עם 3 מ"ל של 50% גליסול (ב PBST) וסלע במשך 10 דקות.
  5. החלף את הפתרון בשלב 15.4 עם 3 מ"ל של 100% גלצל ללא נדנדה במשך 10 דקות.
  6. השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לדמיין את הזחלים ישירות בצלחת 6-well או להעביר את הזחלים לשקופית דיכאון לתמונה תחת מיקרוסקופ מורכב. השתמש מניפולטור ריסים כדי לכוון את הזחלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות הקו מהונדס Tg (lhx1a-EGFP), הוכח כי זה בפרוטוקול הכלאה במקום יעיל בתיוג תאי צאצא כליות ומבנים שונים של נפרון במהלך פיתוח mesonephros. כצפוי, מערכת העצבים המרכזית מסומנת גם בקו מהונדס זה (לא מוצג). הנפרון המסונפירי הראשוני נוצר במהירות של כ-5.2 מ"מ, גב לנטייה (איור 2A), והצינור הדיסטלי של הנפרון הזה מסומן על ידי EGFP10,12. אשכולות אבות קיימים בשלב זה ובהמשך (איור 2A-B, ראשי חץ) ותאי אבות יחידים מסומנים גם הם (איור 2C). שיטה זו מספקת כלי נוסף בחקר התפתחות הכליות ומסייעת לשפוך אור על הבנת הכליה האנושית.

Figure 1
איור 1: מדידת זחלים. זחלים קבועים בצלחת פטרי ממוקמים על גבי סרגל שטוח. תחת מיקרוסקופ ניתוח, הזחלים נמדדים ומופרדים על ידי קבוצות בגדלים דומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פיתוח מסונפרוס. בקו מהונדס Tg(lhx1a-EGFP), הנפרון המסונפרי הראשון נוצר גב נוטה נוטה ושלפוחית שחייה (SB) (A). אשכולות של תאי אבות נמצאים במהלך התפתחות mesonephros (A-B, ראשי חץ) בנוסף לתאי אבות יחידים (C, סוגריים מרובעים). אצל קטינים גדולים יותר, כתמי רקע יכולים להתרחש בסמיטים (C, חצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת ההכלאה במקום המתוארת כאן נועדה ללמוד פיתוח מסונפרוס. עם זאת, ניתן ליישם אותו כדי לחקור את ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים במהלך מטמורפוזה, כגון המעיים, מערכת העצבים, קשקשים, פיגמנטציה14. בדיקות ניתן ליצור עבור גנים אנדוגניים או סמנים פלואורסצנטיים בקווים מהונדסים.

זה קריטי עבור הזחלים להישאר שלם על מנת להתבונן באיברים וברקמות בהקשר הטבעי שלהם. כדי לשמור על שלמות הרקמה, חשוב למזער את זמן הטיפול בחלבון K. חשוב לקבוע את זמן הטיפול הטוב ביותר עבור כל אצווה חדשה של אנזים. לחלופין, אצטון יכול לשמש במקום proteinase K לשיפור שלמות הרקמות16. להלבנה מוגזמת גם מפחיתה את שלמות הרקמות. להלבנה מינימלית ולאפשר לעיניים לשמור על פיגמנטציה מסוימת מסייעים לדמיין את הזחלים במהלך הכביסה. זה נפוץ עבור העיניים ליפול במהלך שלב הכלאה, המהווה אינדיקטור של שבריריות רקמות. השימוש ב- DMSO עם פתרון K לתיקון וחלבוןאז חיוני לחדירת רקמות17.

מגבלה של שיטה זו היא חדירה לקויה של ריאגנטים בבעלי חיים גדולים יותר. כדי לשפר את החדירה, הראש והזנב ניתן להסיר עם סכין גילוח לפני קיבעון17. המעיים ניתן להסיר עם פינצטה עדינה ומחטים טונגסטן לאחר קיבעון כדי לאפשר גישה ישירה של ריאגנטים למסונפרוס. בדיקות ארוכות (יותר מ-1 KB) יכולות להיות חדירה לקויה של הרקמה, אך ניתן לעבור הידרוליזה לרסיסים קצרים (בסביבות 0.3 KB) כדי לשפר את החדירה18. עבור בדיקות עם אותות חלשים, בדיקות בקרה עם רצף החושים יכולות לשמש להבחנה בין הרקע לאות הבדיקה. לבעלי חיים גדולים יותר יהיה כתמי רקע גבוהים יותר של הסומיטים (איור 2C, חצים). עם זאת, זה יכול להיות ממוזער עם שטיפות ארוכות יותר של בדיקה ונוגדנים.

הפרוטוקול כאן יכול להיות מיושם גם על רקמות ואיברים מנותקים ומבודדים, כגון כליות דג זברה בוגר12,19. למרות שישנם תיאורים שפורסמו של פרוטוקולים דומים9,16, אף אחד מהם לא מתאר את כל התהליך מגידול זחלים להכלאה במקום עם רמה זו של פירוט. לכן, שיטה זו מספקת כלי נוסף בפענוח התפתחות הכליה החולייתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

המימון ניתן על ידי האקדמיה למדע של פנסילבניה, וחבר העמים של פנסילבניה ביולוגים, ואוניברסיטת אינדיאנה של פנסילבניה (בית הספר ללימודים מתקדמים ומחקר, המחלקה לביולוגיה, ואת סינתיה Sushak לתואר ראשון ביולוגיה הקרן למצוינות). הקו הטרנסגני Tg (lhx1a-EGFP) סופק על ידי ד"ר ניל הוקריגה (אוניברסיטת פיטסבורג).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-fluorescein antibody Roche/Sigma-Aldrich 11426338910
Bleaching solution 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST
Blocking reagent Roche/Sigma-Aldrich 11096176001 Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction
Cell strainer Fisher Scientific  22-363-549 100 μm
E3 medium 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue
Eyelash manipulator Fisher Scientific NC1083208 Use to manipulate larvae
Fixing solution 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down
Fluorescein probe synthesis Roche/Sigma-Aldrich 11685619910
Glass vial Fisher Scientific 03-338B
Hatchfry encapsulation Argent
Hyb- solution 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20
Hyb+ solution HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin
MAB (10X) 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5
MABT 1X MAB, 0.1% Tween-20
Maleic acid Sigma-Aldrich M0375
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
PBS (10X) 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4
PBST 1X PBS, 0.1% Tween-20
PBST2 1X PBS, 0.2% Tween-20
Powder food Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well
Proteinase K Sigma-Aldrich P5568 Use to permeabilize larvae
Proteinase K solution 20  μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST
Spirulina microfine powder Argent
SSC (20X) 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave
SSCT (0.2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
SSCT (2X) Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20
Staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20
Staining solution 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer
Stopping solution 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST
Torula (yeast) RNA Sigma-Aldrich R6625
Tricaine Sigma Aldrich E10521 2%, pH 7
Wash buffer 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
  2. Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
  3. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  4. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
  5. Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
  6. Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
  7. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
  8. Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
  9. McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
  10. Diep, C. Q., et al. Development of the zebrafish mesonephros. Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).
  11. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
  12. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
  13. Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).
  14. Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  15. Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
  16. Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
  17. Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
  18. Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
  19. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 174 דגי זברה כליות נוטה מסונפרוס lhx1a זחל נוער
<em>בסיטו</em> הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kasar, S. N., Grandinette, S. A.,… More

Kasar, S. N., Grandinette, S. A., Semelsberger, S. D., Diep, C. Q. In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development. J. Vis. Exp. (174), e62930, doi:10.3791/62930 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter