Summary
Рыбка данио является важной моделью для понимания развития почек. Здесь протокол гибридизации in situ оптимизирован для обнаружения экспрессии генов у личинок рыбок данио и молоди во время развития мезонефроса.
Abstract
Рыбка данио образует две почечные структуры за свою жизнь. Пронефрос (эмбриональная почка) образуется во время эмбрионального развития и начинает функционировать через 2 дня после оплодотворения. Состоящий только из двух нефронов, пронефрос служит единственной почкой во время личиночной жизни, пока не потребуется больше функции почек из-за увеличения массы тела. Чтобы справиться с этой более высокой потребностью, мезонефрос (взрослая почка) начинает формироваться во время метаморфоза. Новые первичные нефроны сливаются с пронефрами и образуют соединенные просветы. Затем вторичные нефроны сливаются с первичными (и так далее), чтобы создать разветвленную сеть в мезонефросе. Подавляющее большинство исследований сосредоточено на пронефросах из-за простоты использования эмбрионов. Таким образом, необходимо разработать методы изучения более старых и крупных личинок и молоди рыб, чтобы лучше понять развитие мезонефроса. Здесь протокол гибридизации in situ для анализа экспрессии генов оптимизирован для проникновения зонда, промывки зондов и антител, а также отбеливания пигментов для лучшей визуализации мезонефроса. Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) используется для маркировки клеток-предшественников и дистальных канальцев зарождающихся нефронов. Этот протокол заполняет пробел в исследованиях мезонефроса. Это важная модель для понимания того, как новые ткани почек формируются и интегрируются с существующими нефронами и дают представление о регенеративной терапии.
Introduction
Эмбрион рыбки данио является важной моделью для изучения развития тканей из-за его небольшого размера, прозрачности, доступных инструментов и выживаемости без кормления в течение пяти дней1,2. Это в значительной степени способствовало пониманию развития почек и сохранения между рыбками данио и млекопитающими3,4,5. Почки играют важную роль в поддержании гомеостаза жидкости, фильтрации крови и выведении отходов6. Нефрон, функциональная единица почки, содержит фильтр крови, соединенный с длинным канальцем. У рыбок данио две почечные структуры формируются на протяжении всей ее жизни. Пронефрос (временная эмбриональная почка) образуется сначала во время раннего развития. Он состоит из двух нефронов, проходящих вдоль передне-задней оси и становится функциональным примерно через 2 дня после оплодотворения (dpf). Полезность пронефроса заключается в его простоте, имея всего два нефрона, которые в основном линейны и легко визуализируются (хотя проксимальный извитый каналец начинает сворачиваться при трех dpf)3. Это облегчило не только изучение его раннего развития из промежуточной мезодермы, но и структуру сегментации и ремонт канальцев7,8.
Полезность рыбок данио становится ограниченной после пяти dpf, когда желток уменьшается и личинки полагаются на питание в водной системе9. Примерно в возрасте 2 недель личинки претерпевают метаморфозы в молодых особей, где образуются новые ткани, а старые ткани теряются и/или реорганизуются9. Это также когда образуется мезонефрос (постоянная взрослая почка) 10,11,12. Первый взрослый нефрон образуется около шестого сомита и сливается с дистальным ранним канальцем пронефроса. Дополнительные нефроны добавляются сзади к этому положению изначально, но также и к передней части позже. Первичные нефроны в этой первой волне сливаются с канальцами пронефроса и имеют общий просвет для осаждения своих отходов. Вторичные нефроны образуются в следующей волне и сливаются с первичными нефронами. Этот повторяющийся процесс создает мезонефрос, который разветвлен, несколько сродни почке млекопитающих. Предположительно, пронефрос в конечном итоге теряет свою трубчатую идентичность и становится двумя основными собирательными протоками, где все нефроны сливают свои отходы13.
До образования первого взрослого нефрона одиночные клетки-предшественники начинают появляться в ~4 мм (общая длина) личинок (~10 dpf). Эти клетки, которые отмечены в трансгенной линии Tg(lhx1a-EGFP), прилипают к пронефросу и, по-видимому, мигрируют в будущие места нефрогенеза. Отдельные клетки объединяются в кластеры, которые дифференцируются в новые нефроны12. Неясно, где находятся эти клетки или какие гены они экспрессируют до начала мезонефрогенеза.
Понимание развития мезонефроса дает представление о почках млекопитающих так, как пронефрос не может. К ним относятся образование нефрогенных агрегатов из одиночных клеток-предшественников, функциональная интеграция новых нефронов с существующими и ветвящийся морфогенез. Тем не менее, существуют ограничения для изучения постэмбрионального развития. Личинки менее прозрачны из-за их большего размера и пигментации. Временная шкала развития не является синхронной среди отдельных животных и сильно зависит от факторов окружающей среды, таких как кормление и скученность9,14. Хотя нокдаун-реагенты существуют, они менее эффективны в личинках по сравнению с эмбрионами15. В этом протоколе описан метод гибридизации in situ для определения экспрессии генов во время развития мезонефроса рыбок данио. Несколько шагов оптимизированы для увеличения визуализации мезонефроса и проникновения и промывки зонда и антитела. Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) используется вместе с зондом для EGFP для маркировки одиночных клеток-предшественников, нефрогенных агрегатов и дистальных канальцев зарождающихся нефронов. Этот метод обеспечит более глубокое понимание развития мезонефроса и понимание регенеративной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование личинок рыбок данио и молоди одобрено IUP IACUC (протокол No02-1920, No08-1920). Сведения о содержимом решения приведены в Таблице материалов.
1. Разведение личинок
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поднятия личинок и молоди до стадии интереса потребуется до 21 дня и более.
- Настройте взрослую рыбку данио на спаривание, добавив 1 самца и 1 самку рыбы в брачный резервуар ближе к вечеру после их последнего приема пищи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не все пары рыб будут спариваться. Начните с настройки 20 пар для определения скорости спаривания и соответствующей корректировки в будущих экспериментах. - На следующий день после того, как рыба закончит спариваться (около 13:00), соберите эмбрионы со средой E3 в пластины Петри.
- Убедитесь, что на тарелке не более 30 эмбрионов.
- Удалите мусор (например, фекалии) из пластин Петри и добавьте 20 мл среды E3.
- Инкубировать при 28,5 °C в течение 1 дня.
- Поместите взрослую рыбку данио обратно в водную систему.
- При 1 dpf замените среду E3 на свежую E3.
- Инкубировать при 28,5 °C еще 4 дня до 5 dpf.
- Поместите экран 400 мкм в резервуар объемом 2,8 л и заполните его 2 см системной воды.
- Добавьте 5 личинок dpf из 1 пластинки (до 30 всего личинок).
- Поместите резервуар в водную систему, но не запускайте поток воды.
- Кормите личинок по 4 мл порошкообразной пищи два раза в день до 14 дпф.
- При 6 dpf начинайте поток воды со скоростью 1 капля в секунду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверяйте поток воды ежедневно и корректируйте соответствующим образом. - При 8 dpf увеличьте поток воды до медленного, устойчивого потока.
- При 14 дпф кормите живым рассолом креветок в дополнение к порошкообразной пище.
2. День 1 - 2: Фиксация личинок
- Снимите резервуар с личинками в нужный момент времени.
- Наполните пластину Петри 20 мл системной воды.
- Используйте тонкую сетчатую сетку, чтобы аккуратно зачерпнуть личинок и вывести их на поверхность воды.
- Отрежьте кончик передаточной пипетки, чтобы дать более широкое отверстие и перенесите личинок к пластине Петри. Больший рот пипетки позволяет переносить сразу несколько мелких личинок или несколько более крупных.
- Добавьте 2 мл трикаина (2%, рН 7 штока), чтобы обездвижить личинок.
- После того, как личинки перестанут двигаться, удалите большую часть воды и добавьте 10 мл трикаина. Подождите 15 минут, пока личинки будут усыплены.
- Дополнительно: Для молодых особей длиной более 8 мм отрежьте головы и хвосты лезвием бритвы (после эвтаназии) под рассекающим микроскопом для улучшения проникновения фиксирующего раствора. Обязательно запишите общую длину каждого животного, прежде чем отрезать голову и хвост и изолировать каждое из них в своей собственной пластине Петри. Обратитесь к шагу 3, чтобы узнать, как измерить животных.
- Заменить трикаин 20 мл фиксирующего раствора (4% параформальдегид, 1% ДМСО). Положите крышку обратно на пластину Петри и медленно качайтесь в вытяжном капюшоне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать качающуюся платформу. Трясущаяся платформа с круговым движением приведет к искривлению оси животного. Используйте только свежий (не предварительно замороженный) фиксирующий раствор.
ВНИМАНИЕ: Фиксирующий раствор содержит параформальдегид, который является вероятным канцерогеном. Используйте вытяжной капюшон (или маску) и перчатки для измерения порошка. - Через 30 мин замените фиксирующий раствор свежим фиксирующим раствором.
- Соберите использованный крепежный раствор в отдельный контейнер для отходов для правильной утилизации.
- Переложите личинки в трубку объемом 50 мл, содержащую 25 мл свежего фиксирующего раствора.
- Убедитесь, что колпачок плотный и медленно раскачивается при 4 °C в течение 2 дней. Для удобства можно дольше инкубировать.
3. День 3: Измерение личинок
- В вытяжном шкафу замените фиксирующий раствор 20 мл PBST.
- Перенесите личинок в пластину Петри.
- Положите плоскую линейку на рассекающий микроскоп и положите пластину Петри поверх линейки.
- Используйте манипулятор ресниц, чтобы переместить каждую личинку на линейку, чтобы измерить ее общую длину (от морды до кончика хвостового плавника) (рисунок 1).
- Объедините несколько личинок одинаковой длины (например, 5,0 мм и 5,1 мм) в один стеклянный флакон объемом 5,5 мл, до 10 личинок на флакон.
4. День 3 - 4: Обезвоживание
- Замените ПБСТ 4 мл 100% метанола. Качайте флакон в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Замените метанол свежим метанолом и камнем в течение 5 мин. Повторите еще раз.
- Хранить флакон при -20 °C в течение 2 дней. Для удобства можно дольше инкубировать.
5. День 5: Регидратация
- Разогрейте флакон до комнатной температуры.
- Замените метанол 4 мл 75% метанола/25% ПБСТ. Камень в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Заменить раствор на этапе 5.2 4 мл 50% метанола/50% ПБСТ и породой в течение 5 мин.
- Заменить раствор на этапе 5.3 4 мл 25% метанола/75% ПБСТ и породой в течение 5 мин.
- Замените раствор на этапе 5.4 на 4 мл PBST и породу в течение 10 мин.
- Замените PBST на 4 мл свежего PBST и камня на 10 минут. Повторите еще раз.
6. День 5: Протеиназа К дайджест
- Заменить ПБСТ 2 мл раствора протеиназы К (20 мкг/мл, конечная концентрация ДМСО 1% в ПБСТ) и породу при комнатной температуре в течение 30 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Личинкам длиной более 6 мм потребуется более длительное время инкубации и/или более высокая концентрация протеиназы К. Точное время и концентрация должны быть определены эмпирически. Начните с 10-минутного увеличения времени инкубации на каждые 0,5 мм длиннее 6 мм. - Заменить раствор протеиназы К 4 мл ПБСТ и породы в течение 10 мин.
- Замените PBST на 4 мл свежего PBST и камня на 10 минут. Повторите еще раз.
- Замените ПБСТ 4 мл свежего фиксирующего раствора и породы в течение 1 ч. Для удобства можно инкубировать дольше при 4 °C.
7. День 5: Отбеливание
- Замените фиксирующий раствор 4 мл ПБСТ и породы при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Замените PBST на 4 мл свежего PBST и камня на 10 минут. Повторите еще раз.
- Перенесите личинок на 6-луночную пластину (до 10 личинок на лунку).
- Замените PBST 3 мл свежего отбеливающего раствора.
- Качайте при комнатной температуре и контролируйте пигментацию под рассекающим микроскопом каждые 5 мин. Следите за исчезновением пигментации вдоль мезонефроса (спинной к плавательному пузырю и кишечнику).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для личинок длиной до 6 мм потребуется до 20 минут, чтобы отбелить пигментацию, окружающую мезонефрос. Не отбеливайте дольше, чем необходимо для сохранения целостности личинок. - Перенесите личинок обратно в стеклянный флакон.
- Замените отбеливающий раствор 4 мл ПБСТ. Рок в течение 10 мин.
- Замените PBST на 4 мл свежего PBST и камня на 10 минут. Повторите еще раз.
- Замените ПБСТ 4 мл свежего фиксирующего раствора и породы в течение 1 ч. Для удобства можно инкубировать дольше при 4 °C.
8. День 5: Прегибридизация
ПРИМЕЧАНИЕ: Для шагов, выполняемых при 70 °C, важно работать быстро, чтобы свести к минимуму охлаждение флакона.
- Замените фиксирующий раствор 4 мл ПБСТ и породы при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Замените PBST на 4 мл свежего PBST и камня на 10 минут. Повторите еще раз.
- Заменить ПБСТ 4 мл гиб-раствора и поменять при комнатной температуре в течение 10 мин.
ВНИМАНИЕ: Гиб-, Гиб+ и зондовые растворы содержат формамид, который может раздражать кожу. Используйте перчатки для обработки этих решений. - Замените Hyb- на 4 мл свежего Hyb- и камня в течение 10 минут. Повторите еще раз.
- Соберите использованные растворы Hyb-, Hyb+ и зондов в отдельный контейнер для отходов для надлежащей утилизации.
- Замените Hyb- на 4 мл раствора Hyb+.
- Инкубируйте флакон при 70 °C в течение ночи.
- Разбавить EGFP-флуоресцеиновый зонд 1:100 в 500 мкл Hyb+ и инкубировать его O/N при 70 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя по синтезу зондов.
9. День 6: Гибридизация зондов
- Замените раствор Hyb+ во флаконе предварительно нагретым зондом и инкубируйте при 70 °C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Личинкам длиной более 6 мм требуется 2 дня инкубации. - Разогрейте буфер промывки, 2 раствора SSCT и 0,2 раствора SSCT при 70 °C в течение ночи.
10. День 7: Промывка зонда
- Замените зонд 4 мл предварительно нагретого промывочного буфера и инкубируйте при 70 °C в течение 30 мин.
- Соберите использованный зонд в отдельный контейнер для отходов для надлежащей утилизации.
- Замените буфер для стирки 4 мл свежего промывочного буфера и инкубируйте при 70 °C в течение 30 мин.
- Замените промывочный буфер 4 мл предварительно нагретого 2-кратного раствора SSCT и инкубируйте его при 70 °C в течение 15 мин.
- Добавьте 50 мл предварительно нагретого 0,2x SSCT в пробирку объемом 50 мл.
- Вставьте клеточный ситечко (100 мкм) в верхнюю часть трубки. Убедитесь, что клеточный сетчатый фильтр сдвинут вниз до тех пор, пока он не остановится.
- Перенесите личинок из стеклянного флакона в клеточное ситечко. Убедитесь, что личинки погружены в буфер и насиживают при 70 °C в течение 2 ч.
- Подготовьте новую трубку, содержащую 50 мл предварительно нагретого 0,2x SSCT.
- Перенесите клеточный ситечко со стадии 10.4.2 в новую трубку 0,2x SSCT и инкубируйте при 70 °C в течение 2 ч.
- Повторите шаг 10.5 еще раз.
11. День 7: Блокировка
- Перенесите личинки в новый стеклянный флакон и охладите до комнатной температуры.
- Замените 0,2x SSCT на 4 мл 67% 0,2x SSCT/33% MABT и породу при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Заменить раствор на этапе 11.2 4 мл 33% 0,2x SSCT/67% MABT и породой в течение 10 мин.
- Замените раствор на этапе 11.3 4 мл МАБТ и породы в течение 10 мин.
- Замените MABT на 4 мл свежего MABT и камня в течение 10 минут. Повторите еще раз.
- Заменить МАБТ 4 мл блокирующего раствора и инкубировать при 4 °C в течение ночи. Для удобства можно дольше инкубировать.
12. День 8 - 9: Инкубация антител
- Развести антифлуоресцеиновое антитело 1:5000 в блокирующем растворе 500 мкл.
- Заменить блокирующий раствор раствором антител и инкубировать при 4 °C в течение 2 дней. Для удобства можно дольше инкубировать.
- Закручивайте флакон два раза в день, чтобы взбудоражить личинок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Личинкам длиной более 6 мм требуется еще 1-2 дня инкубации.
- Закручивайте флакон два раза в день, чтобы взбудоражить личинок.
13. День 10 - 11: Промывка антителами
- Заменить раствор антител 4 мл ПБСТ и породы при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Замените PBST на 4 мл свежего PBST и камня на 10 минут. Повторите еще раз.
- Перенесите личинок в трубку объемом 50 мл.
- Добавьте 40 мл PBST2. Положите трубку на бок и покачайте при 4 °C на ночь.
- Замените PBST2 40 мл свежего PBST2 и породу при 4 °C в течение ночи. Для удобства можно дольше инкубировать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Личинкам длиной более 6 мм требуется еще 1-2 дня промывки.
14. День 12: Окрашивание
- Перенесите личинок на 6-луночную пластину.
- Замените PBST2 3 мл окрашивающего буфера и породы при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Замените буфер окрашивания 3 мл свежего буфера окрашивания и камня в течение 5 минут. Повторите еще раз.
- Замените буфер окрашивания 3 мл окрашивающего раствора. Накройте алюминиевой фольгой и следите за окрашиванием в течение следующих нескольких часов.
- Для зондов со слабым сигналом инкубируйте при 4 °C в течение ночи и замените окрашивающий раствор свежим раствором для окрашивания один раз между ними.
- Когда желаемая интенсивность окрашивания достигнута, замените окрашивающий раствор 3 мл останавливающего раствора и камня в течение 30 мин.
- Заменить остановочный раствор 3 мл свежего стопорного раствора и породы в течение 30 мин. Повторите еще раз.
- Переложить личинки в новый стеклянный флакон и заменить остановочный раствор 4 мл свежего фиксирующего раствора и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Для удобства можно инкубировать дольше при 4 °C.
- Хранить личинок в фиксирующем растворе в темноте при 4 °C до года.
15. День 12: Визуализация
- Замените фиксирующий раствор 4 мл ПБСТ и породы при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Перенесите личинок на 6-луночную пластину.
- Замените PBST на 4 мл свежего PBST и камня на 10 минут. Повторите еще раз.
- Замените ПБСТ 3 мл 50% глицерина (в ПБСТ) и породу в течение 10 мин.
- Заменить раствор на этапе 15.4 3 мл 100% глицерина без раскачивания в течение 10 мин.
- Используйте рассекающий микроскоп для изображения личинок непосредственно в 6-луночной пластине или перенесите личинок в депрессивный слайд для изображения под составным микроскопом. Используйте манипулятор ресниц для ориентации личинок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя трансгенную линию Tg(lhx1a-EGFP), было продемонстрировано, что этот протокол гибридизации in situ эффективен при маркировке клеток-предшественников почек и различных нефроновых структур во время развития мезонефроса. Как и ожидалось, центральная нервная система также помечена в этой трансгенной линии (не показана). Исходный мезонефрический нефрон образуется примерно на 5,2 мм, дорсальный к пронефру (рисунок 2А), а дистальный каналец этого нефрона помечен EGFP10,12. Кластеры-предшественники присутствуют на этом этапе и позже (рисунок 2A-B, наконечники стрел), а одиночные клетки-предшественники также помечены (рисунок 2C). Этот метод предоставляет дополнительный инструмент в изучении развития почек и помогает пролить свет на понимание почки человека.
Рисунок 1: Измерение личинок. Неподвижные личинки в пластине Петри помещаются поверх плоской линейки. Под рассекающим микроскопом личинки измеряются и разделяются группами одинаковых размеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Развитие мезонефроса. Примерно на 5,2 мм в трансгенной линии Tg(lhx1a-EGFP) первый мезонефрический нефрон образуется дорсальным к пронефросу и плавательному пузырю (SB) (A). Кластеры клеток-предшественников присутствуют во время развития мезонефроса (A-B, наконечники стрел) в дополнение к одиночным клеткам-предшественникам (C, скобка). У более крупных молодых особей фоновое окрашивание может происходить в сомитах (С, стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод гибридизации in situ направлен на изучение развития мезонефроса. Однако его можно применять для изучения развития других тканей и органов во время метаморфоз, таких как кишечник, нервная система, чешуя и пигментация14. Зонды могут быть сгенерированы для эндогенных генов или флуоресцентных маркеров в трансгенных линиях.
Крайне важно, чтобы личинки оставались нетронутыми, чтобы наблюдать за органами и тканями в их родном контексте. Чтобы сохранить целостность тканей, важно свести к минимуму время лечения протеиназой К. Важно определить наилучшее время обработки для каждой новой партии фермента. Альтернативно, ацетон можно использовать вместо протеиназы K для улучшения целостности тканей16. Чрезмерное отбеливание также снижает целостность тканей. Минимальное отбеливание и разрешение глазам сохранять некоторую пигментацию помогают в визуализации личинок во время промывания. Часто глаза отпадают во время стадии гибридизации, что является показателем хрупкости тканей. Применение ДМСО с фиксацией и раствором протеиназы К имеет решающее значение для проникновения в ткани17.
Ограничением этого метода является плохое проникновение реагентов в более крупных животных. Для улучшения проникновения голову и хвост можно удалить лезвием бритвы перед фиксацией17. Кишечник может быть удален тонкими пинцетом и вольфрамовыми иглами после фиксации, чтобы обеспечить прямой доступ реагентов к мезонефросу. Длинные зонды (более 1 КБ) могут иметь плохое проникновение в ткань, но они могут быть гидролизованы на короткие фрагменты (около 0,3 КБ) для улучшения проникновения18. Для зондов со слабыми сигналами можно использовать управляющие зонды с сенсорной последовательностью для различения фонового и зондового сигнала. Более крупные животные будут иметь более высокое фоновое окрашивание сомитов (рисунок 2С, стрелки). Однако это может быть сведено к минимуму при более длительных промывках зонда и антител.
Протокол здесь также может быть применен к рассеченным и изолированным тканям и органам, таким как почки взрослой рыбки данио12,19. Хотя есть опубликованные описания подобных протоколов9,16, ни один из них не описывает весь процесс от выращивания личинок до гибридизации in situ с таким уровнем детализации. Поэтому данный метод предоставляет дополнительный инструмент в расшифровке развития почек позвоночных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Финансирование было предоставлено Академией наук Пенсильвании и Содружеством биологов Пенсильвании, а также Университетом Индианы в Пенсильвании (Школа аспирантуры и исследований, Департамент биологии и Фонд биологии синтии Сушак для передового опыта). Трансгенная линия Tg(lhx1a-EGFP) была предоставлена доктором Нилом Хукриде (Университет Питтсбурга).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
References
- Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. Mapping of zebrafish research: a global outlook. Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate. Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).
- Swanhart, L. M., et al. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).
- Dressler, G. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845 (2011).
- Marra, A. N., et al. Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration. Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).
- McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. Working with zebrafish at postembryonic stages. Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).
- Diep, C. Q., et al.
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).
- Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).
- Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Guo, R., et al. LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish. Science Reports. 11 (1), 1977 (2021).
- Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PloS One. 15 (8), 0237167 (2020).
- Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).
- Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644 (2014).
